Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Karakterisere elektronet Transport gjennom levende biofilm

Published: June 1, 2018 doi: 10.3791/54671
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2, 3, 1, 4, 5, 1
1Center for Bio/Molecular Science and Engineering, Naval Research Laboratory, 2George Mason University, 3Chemistry Division, Naval Research Laboratory, 4Departments of Physics, Biological Sciences, and Chemistry, University of Southern California, 5Department of Chemical Engineering and Materials Science, Michigan State University

Summary

En protokoll for å måle elektrisk ledningsevne av levende mikrobiell biofilm fysiologisk relevante vilkår er presentert.

Abstract

Her viser vi metoden elektrokjemiske gating benyttes for å karakterisere elektrisk ledningsevne av elektroden dyrket mikrobiell biofilm fysiologisk relevante vilkår. 1 disse målingene utføres på levende biofilm i vandig medium bruker kilde og avløp elektroder mønstret på en glassoverflate i en spesialisert konfigurasjon som tabelldata interdigitated elektrode (IDA). En biofilm er dyrket som strekker seg over gapet koble kilden og avløp. Potensialer brukes elektrodene (ES og ED) genererer en kilde strømforbruk gjeldende (ISD) gjennom biofilm mellom elektrodene. Avhengighet av elektrisk ledningsevne på gate potensial (gjennomsnittet av source og potensial, EG = [ED + ES] / 2) bestemmes av systematisk endre porten potensielle og måle den resulterende kilde strømforbruk gjeldende. Avhengighet av konduktivitet på gate potensielle gir mekanistisk informasjon om ekstracellulære elektronet transport prosessen underliggende elektrisk ledningsevne den bestemte biofilm under etterforskning. Elektrokjemiske gating måling metoden beskrevet her er basert på som brukes av M. S. Wrighton2,3 og kolleger og R. W. Murray4,5,6 og kolleger i 1980 er for å undersøke tynnfilm ledende polymerer.

Introduction

Ekstracellulære elektronet transport (lunsj) er en prosess som gjør at visse mikroorganismer å transportere elektroner mellom intracellulær metabolske prosesser og uløselig elektron acceptors eller givere som bor utenfor cellen fra naturlige mineraler til elektroder. I noen tilfeller kan EET mikroorganismer til elektrisk ledende flercellede tykk biofilm på elektroden overflater, der cellene ikke i direkte kontakt med elektroden kan fortsatt utnytte det som en metabolsk elektron acceptor eller donor. Det er betydelig interesse slik biofilm som elektrode katalysatorer for forskjellige programmer, for eksempel mikrobiell electrosynthesis, forurensning sensing/fjerning, og eksterne energi og lagring,7,8,9 ,10,11,12,13,14 på grunn av mangfoldet av metabolske prosesser av mikroorganismer og holdbarheten av mikrobielle biofilm forhold til enzym-baserte bioelectrodes. 15 , 16 i tillegg EET trasé kan potensielt utnyttes til elektrisk kontroll eller signal endringer i naturlig forekommende eller genmodifisert mikrobiell metabolske prosesser involvert, for eksempel i produksjon av en ønsket produkt eller deteksjon for en målet analytt eller stimulans. Elektrisk ledningsevne electrocatalytic biofilm, som skiller dem fra andre biologiske materialer, er et sentralt aspekt av electrocatalytic egenskaper, men lite forstått om underliggende EET prosessen i elektrode-miljøet og det som er kjent er svært omstridt. 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24

Beskrevet her er en 2-elektrode metode for å måle ledningsevne gjennom levende, elektrode dyrket biofilm bruker interdigitated elektrode matriser (IDAs). IDAs består av parallelle rektangulære elektroder mønstret på flat glassoverflaten slik at alle andre band er koblet på motsatte sider av array resulterer i 2 elektroder (kilde og avløp). Nøye undersøkelse av en IDA avslører (se for eksempel figur 6.12b av ref #1) at hullene mellom tilstøtende band er også koblet på en slik måte at skjemaet en eneste gap som vever frem og tilbake over array skille de to elektrodene. Resultatet er en lang og smal avstand skiller source og elektrodene, gir svært høy kilde strømforbruk strøm når en ledende materiale er dannet, kastet, polymerized eller vokst (ved av biofilm anses her) matrisen. Dessuten, resulterer den lille størrelsen på elektrodene i liten bakgrunn gjeldende kapasitans lading og endre oksidasjonstallet for det ledende materialet med endring i gate potensial, siden mengden av materiale for å gjøre ledningsevne mål med IDAs er så liten. Teknikken av IDA-baserte elektrokjemiske gating beskrevet her, utviklet for å karakterisere tynnfilm ledende polymerer,2,3,4,25 har nylig brukt på levende systemer. 18 en annen teknikk som brukes til å måle ledningsevne levende biofilm benyttes et stort format source og elektroder og kilde meter å sette porten potensielle. 26 , 27 men bekymringer over disse metodene har blitt beskrevet tidligere. 18

Protokollen nedenfor sammenfatter vår erfaring med å lage ledningsevne målinger av levende Geobacter sulfurreducens og biocathode MCL biofilm. G. sulfurreducens er en modell elektrode redusere organisme bruke uløselig materialer, inkludert elektroder, som den eneste metabolske elektron acceptor. I tillegg danner tykke biofilm som kan transportere elektroner over flere celle lengder, noe som gjør det til en ideell modell organisme til å studere anodic langdistanseløpet ekstracellulære elektron overføring. Vi har også detaljer for studier av biocathode MCL, en aerobic, autotrophic blandet samfunnet biofilm isolert fra katoden en bunnlevende mikrobiell brenselcelle. Biocathode MCL (oppkalt etter tre viktigste bestanddelene- Marinobacter, Chromatiaceaea og Labrenzia) er i stand til oksiderende en elektrode som sin eneste elektron donor og transport elektroner over flere celle lengder, gjør det en interessant Katodisk system å studere. I tillegg har biocathode MCL høyest rapporterte ledningsevne for et levende system ennå med disse metodene. Inkludering av disse ulike electroactive biofilm i denne protokollen er ment å markere at denne teknikken er anvendelig å måle transport av elektroner gjennom noen levende biofilm elektrisk samhandler med elektroder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. interdigitated microelectrode matrise (IDA) forberedelse

  1. Få kommersielt tilgjengelig IDA elektroder mønstret på et nonconductive substrat eller syntetisere dem ved hjelp av standard litografisk metoder. 28
    Merk: IDA dimensjoner og/eller materialer kan varieres basert på ønskede vilkår for forskjellige eksperimenter. IDAs brukes her ble innhentet kommersielt og besto av to interdigitated gull microelectrodes mønster fra en barometer substrate koblet til store elektrode pads på motsatte ender av matrisen. Elektrodene er utsatt mens busslinjer kobler elektrodene til de store kontakt pads er belagt med tynne isolasjonsmateriale. IDAs brukes her består av to sett av 10 µm hele og 2 mm lange gull microelectrode band (source og) linjeavstand 5 µm apart mønstret på en flat glassoverflaten. IDAs brukes her hadde 65 elektrode par (130 total interdigitated band). Vekslende band er koblet til elektroden pads på motsatte ender av matrisen.
  2. Wire og isolere IDA
    1. Koble en ledning til hver store elektrode pad bruker ledende sølv epoxy.
      1. Forberede ledende epoxy i henhold til produsentens instruksjoner for bestemte epoxy i bruk med blande stang eller pipette tips (instruksjoner kan variere fra produsent).
      2. Plass en ledning på hver gull pad, sikker på plass med lab tape. Dekke ledningen og pute med sølv epoxy benytter en blande stang eller pipette tips.
      3. Flytt forsiktig til 80 ° C ovn 1t å kurere eller kur basert på produsentens anbefalinger for bestemte ledende sølv epoxy brukes.
      4. Etter epoxy kurer, kan du bruke et multimeter for å sikre elektrisk tilkobling mellom slutten av ledningen og pads. Motstanden mellom ledningen og puten skal < 5 Ω. Også bruke multimeter for å kontrollere at ingen ledende epoxy kobler flere elektrode pads, som dette kan korte matrisen. Hvis ledende epoxy kobler flere kundeemner, kan du bruke en skriver isolere fører.
    2. Isolere epoxied tilkoblingen av belegg tilkoblingen med en termiske, elektriske, og vanntett isolerende materiale. Flammehemmende polyuretan harpiks er ofte egnet.
      1. Fjerne spissen av en 15-mL konisk sentrifuge tube (på ca 2,5 mL merket) som en form for isolerende materialet. Gjøre to små hull i bunnen for ledningene til stikker ut gjennom bruker en 21g nål.
      2. Sett inn IDA i mold og ledningene gjennom hullene i bunnen av mold.
      3. Forberede den bestemte isolasjonsmateriale. Følg instruksjonene som fulgte med bestemte harpiks innhentet.
      4. Pipetter isolator i mold slik at sølv epoxy er helt dekket (~2.5 mL) og la det tørke i henhold til produsentens spesifikasjoner.

2. elektrokjemiske reaktoren oppsett, testing og vaksinasjon

  1. Definer den elektrokjemiske cellen.
    1. Sett inn IDA, counter elektrode og referanse elektrode i den elektrokjemiske cellen.
      Merk: Elektrokjemiske reaktoren brukt kan variere mye, så lenge alle elektrodene passer inni. En vurdering er at referanse elektroden så nær som mulig til arbeider elektroden gis praktiske grensene av reaktoren. Her, bruker vi en enkelt kammer reaktor med referanse elektrode ~ 2-3 cm fra arbeider elektrodene. Også bør counter elektroden være større enn arbeider elektroden å sikre at det ikke begrenser i systemet.
    2. Hvis arbeider med en ren kultur, sterilisere reaktoren med counter elektroden inni. Sterilisere referanse elektroden av soaking i blekemiddel for 10 min og sterile deionisert vann i 10 min. sterilisere IDA av dipping i blekemiddel 5 s etterfulgt av sterilt deionisert vann for 10 før innsetting reaktoren.
    3. Fyll den elektrokjemiske cellen med sterilt middels egnet for biofilm vekst. G. sulfurreducens17,18, bruke ferskvann medium unntatt fumarate. Biocathode MCL bruke9 kunstig sjøvann medium. 9
    4. Koble til elektrodene til en bipotentiostat. Koble en IDA elektrode til arbeid ledelsen 1, andre IDA elektroden til arbeid ledelsen 2, referanse elektrode til referanse kundeemnet og counter elektroden til counter ledelsen.
  2. Elektrokjemiske testing av IDAs.
    Merk: Det store målet med denne testen er å sikre at de to elektrodene er elektrisk isolert. Alle elektrokjemiske teknikker finnes i programvaren som brukes til å kontrollere bipotentiostat.
    1. Utføre kontroll ledningsevne tester (før biofilm vekst) for å sikre riktig IDA funksjon med en bipotentiostat.
      1. Mål åpen krets potensialet for hver elektrode for 1 min.
        Merk: På noen instrumenter,-åpen krets potensielle, må oppnås ved å bruke programmet galvanostatic samling og angi gjeldende til 0 mA.
      2. Mål åpen krets potensialet av elektroden 2 ved utføring av syklisk voltammetry på elektroden 1 mellom +0.2 V til +0.6 V (g. hun) på 20 mV/s.
        Merk: Andre grenser og skanning priser for CV kan brukes hvis ønskelig. Imidlertid unngå potensialer som fører til hydrogen eller oksygen generasjon.
      3. Kontroller at åpen krets potensielle målt på elektroden 2 ikke gjenspeile potensialet i elektrode 1 under CV ved hjelp av potentiostat programvare.
        Merk: Åpen krets potensialet av elektroden 2 kan endre, men det bør være uavhengig av potensialet i elektrode 1.
      4. Gjenta trinn 2.2.1.1 gjennom 2.2.1.3 unntatt kontroll potensialet av elektroden 2 og måle åpen krets potensialet av elektroden 1.
    2. Angi potensialet i arbeider elektroder ønsket vekst potensialet i den relevante electroactive biofilm ved hjelp av bipotentiostat programvare. Bruk for eksempel 0,5 V (g. hun) for Geobacter sulfurreducens eller +0.31 V (g. hun) for biocathode MCL.
  3. Vokse relevante electroactive biofilm
    1. Vaksinere elektrokjemiske reaktoren fra et lager kultur/anriking av ønsket electrochemically aktive mikroorganismer aseptiske mikrobiologisk teknikker. For standard tester, vaksinere i en 1:20 forholdet (inoculum til reaktor volum) et OD600 = 0,5 kultur.
    2. Angi omrøring i reaktoren ønsket nivå (~ 200 rpm) og inkubator / vannbad til ønsket temperatur basert på vekst forholdene i biofilm rundt. G. sulfurreducens, bruke 30 ° C for optimal vekst.
    3. Inkuber systemet basert på spesifikke krav microorganism(s) rundt før biofilm broer gapet mellom de to elektrodene. For stasjonære G. sulfurreducens biofilm, ruge ~ 7-10 dager. For biocathode MCL, ruge ~ 7 dager. I hvert tilfelle, kontrollere temperaturen på 30 ° C.

3. elektrokjemiske gating eksperimenter

  1. Velg eksperimentelle parameterne som brukes til å fastslå den nåværende potensial avhengigheten for gating målingene.
    1. Bestem omfanget av gate potensialer som skal brukes til IDA å få gjennomført gjeldende (ISD) versus gate potensielle (EG) kurven for systemet.
      Merk: Utvalget av gate potensialer undersøkt bør dekke alle potensialene med mulig redoks aktivitet. Hvis ingen informasjon om systemet rundt er tilgjengelig, skal et bredt potensielle utvalg brukes (-0.55 å +0.6 V vs hun). En prøving og feiling tilnærming kan brukes å finjustere området basert på systemet under studien. Gate potensielle defineres som:
      Equation 1
      hvor ED er potensialet for avløp elektroden og ES er potensialet for kilden elektroden. Utvalget av gate potensialer brukes er begrenset av kravene og begrensningene for det aktuelle systemet rundt. 18
      Merk: Source og potensialer som fører til oksygen og hydrogen utvikling bør unngås siden disse prosessene kan skade biofilm.
    2. Angi kilde-avløpet spenningen (VSD) som skal brukes som drivkraft for elektronet transport gjennom filmen fra kilden til avløpet. Kilde-avløpet spenningen defineres som:
      Equation 2
      Merk: Kilde-avløpet spenningen bør være tilstrekkelig små slik at ISD skalerer lineært VSD. 17
    3. Velg en avsøkingshastigheten (v) som EG endres lineært med tid som er uavhengig av ISD slik at systemet kan tilnærmes skal på steady state på hver gate potensielle.
      Merk: En avsøkingshastigheten mindre enn 0.002 V/s er ofte brukt til biologiske systemer. 29 , 30
    4. Definere bipotentiostat programvaren utføre gating målene (dvs. feie porten potensielle) over det merkede området, ved valgte kilde-avløpet spenningen og ønsket avsøkingshastigheten basert på de ovennevnte hensyn.
      Merk: For forrige gating mål med G. sulfurreducens,17,19 EG =-0.55 V til 0,6 V (g. hun), VSD = 0,01 V eller 0,1 V v = 0,001 V/s. For Biocathode MCL, EG = 0,25 V 0.7 V (g. hun), VSD = 0,002 V v = 0,0002 V/s.
      1. I tillegg utfører en opprinnelig plan måling med VSD = 0.000 V (dvs. en CV på hver individuelle elektrode tatt samtidig) på samme v valgt i trinn 3.1.3.
    5. Utføre gating mål med betingelsene i 3.1.4 under både omsetning (med løselig elektron donor eller acceptor nåværende) og ikke-omsetning (uten løselig elektron donor eller acceptor) forhold.
      Merk: Ikke-omsetning betingelser er en fordel fordi målingene ikke er skjult av oksidasjon eller reduksjon av løselig forbindelser for cellenes stoffskifte, selv om lignende resultater skal oppnås uansett hvilken tilstand brukes etter trekke bakgrunn strøm (detaljert i 3.1.8).
      1. Oppnå omsetningen forhold med samme reaktoren mediet som brukes for bakterievekst på elektroden. Dette mediet inneholder en løselig elektron donor, som acetate G. sulfurreducens,17 eller acceptor, som oksygen for Biocathode MCL.
      2. Oppnå ikke-omsetning forhold ved å gjøre det samme reaktor mediet brukes for bakterievekst på elektroden, unntatt utelate løselig elektron donor eller acceptor. Kontroller at potentiostat er av, fjerner mediet tas aseptisk og legge i frisk medium uten elektron giver for anodic systemer eller godkjenner for Katodisk systemer. En kontinuerlig system kan eventuelt settes opp sakte erstatte mediet med ønsket mediet for nonturnover forhold.
        Merk: Hvis oksygen er løselig elektron acceptor (som biocathode MCL), sparge systemet med en blanding av ~ 15% CO2 og 85% N2 (eller en gassblanding som opprettholder riktig pH i medium).
    6. Etter ferdigstillelse av gating målinger, bruke potentiostat programvaren angi potensialet i hver elektrode tilbake til vekst potensial til å la systemet å stabilisere (med de samme verdiene som i 2.2.2).
    7. Hvis alle forholdene beskrevet ovenfor er oppfylt (jegSD er uavhengig av v og skalerer lineært VSD), konvertere jegSD verdier til ledningsevne bruker følgende ligningene som beskrevet tidligere31
      Equation 3
      Equation 4
    8. hvor G er konduktans og S er en skaleringsprosenten faktor som er avhengig av system, og faktorer i variabler som elektrode størrelse, mellomrom størrelse og biofilm høyde. For enkelte systemer, kan S bestemmes fra forhåndsbestemt likninger. 31 eventuelt S kan beregnes numerisk med en modellering programvare, som beskrevet tidligere. 17
    9. Trekk bakgrunn strøm for å identifisere den formen og størrelsen på gjennomført gjeldende. Enten trekke gjeldende generert på VSD = 0,00 V fra gjeldende generert på VSD = 0,01 V eller trekke avløpet gjeldende fra kilden gjeldende generert med en VSD = 0,01 V. enten metoden fjerner bakgrunn strøm, etterlot bare gjennomført gjeldende.
  2. Avhengige elektrokjemiske gating temperaturmålinger
    1. Fastslå rekkevidden for temperaturer rundt. Dette området er svært avhengig av systemet under studien, men fysiologisk relevante temperaturer skal brukes.
      Merk: Tidligere studier har brukt et temperaturområde på 10 ° C til 30 ° C for å studere elektronet transport fysiologisk relevante vilkår for mesophilic mikroorganismer. 17
    2. Få et resirkulerende vannbad eller inkubator å regulere reaktoren temperatur og kontroll reaktoren slik at settpunkt og faktisk temperatur av mediet er den samme.
      1. Sett et termometer eller thermocouple i kontroll reaktoren der IDA skulle.
    3. GjørSD målinger (se 3.1.4) over temperaturer valgt under omsetning og nonturnover (beskrevet i trinn 3.1.5) forhold med bipotentiostat ett av to fremgangsmåtene nedenfor.
      1. Generere jegSD vs EG kurver, som beskrevet ovenfor (se 3.1) for hver temperatur over temperaturområde rundt. For materialer som utstillingen redoks ledningsevne, som G. sulfurreducens og Biocathode MCL, toppen gjeldende fra hver temperatur brukes til å bestemme ISD vs T avhengighet.
        Merk: Denne metoden brukes til å generere en full jegSD vs EG kurve for hver temperatur, men krever mer tid enn det andre alternativet.
      2. Eventuelt angi og hold IDA gate potensielle som gir maksimal gjennomført gjeldende bruker bipotentiostat (fra ISD vs EG kurve, trinn 3.1.4) og registrere maksimum gjennomført gjeldende bruker bipotentiostat mens temperaturen er syklet området av temperaturer med de innebygde kontrollene vannbad eller inkubator.
        Merk: med elektroden/reactor geometrien brukt her, ISD og T tillates å stabilisere for minst 20 min og gjennomsnittlig stabil jegSD brukes for hver temperatur. Mer eller mindre kan stabilisering tid være nødvendig basert på det aktuelle systemet. Denne metoden er raskere enn først, og forårsaker mindre stress til biofilm. Men genereres full gating kurver ikke.
      3. Syklus temperaturen fra ett sett punkt til den andre og tilbake igjen med de innebygde kontrollene inkubator eller vannbad å bestemme Reversibilitet av reaksjonene mot at temperaturen sykling ikke skade biofilm.
    4. Tilbakestille temperaturen til normal vekst temperaturen bruke innebygde kontrollene på badet inkubator eller vann og la systemet å stabilisere.
      Merk: For redoks dirigent, ISD versus 1/T data kan være passe med Arrhenius rate uttrykket som gjør beregningen av aktivisering energi som følger:
      Equation 5
      Equation 6
      hvor Een er aktivisering energi elektron overføring mellom tilstøtende redoks kofaktorer og k er ladninger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

IDAs var kablet, isolert og testet for å sikre at de to elektrodene var elektrisk isolert fra hverandre (figur 1). Reaktorer var samlet, inokulert med G. sulfurreducens, og inkubert til en biofilm Brokoblet gapet mellom elektrodene. G. sulfurreducens biofilm sees visuelt skal dekke matrisen. Andre biofilm kan kreve forskeren å gjøre en elektrokjemisk gating mål å se om de to elektrodene har elektrisk koblet. Mikroskopi bør også brukes til å bekrefte tilkobling mellom elektrodene i matrisen. Elektrokjemiske gating eksperimenter ble gjennomført for å fastslå avhengigheten av ISD EG (figur 2). Ledningsevne levende filmen beregnes med gjennomført gjeldende målt i gating eksperimenter. Presisjon og nøyaktighet av disse målingene var høy på grunn av høy signalet til støyforhold mulig med IDA konfigurasjonen. Temperatur avhengigheten av ISD T identifiserte også sammen med en aktivisering energi for elektronet transport gjennom biofilm (figur 2). Resultatene her ligner de tidligere observert17,18 og støtte hypotesen at G. sulfurreducens og biocathode MCL biofilm fungerer på samme måte redoks dirigenter hvor elektronene overført gjennom biofilm av hopper mellom redoks kofaktorer tett i nærhet.

Figure 1
Figur 1: IDA definere og kontrollere elektrokjemiske tester. (A) en IDA som er kablet og isolert. Innfelt: Utvidet fotografert i matrisen viser interdigitated elektrodene og en av de store elektrode pads. Egen teller og referanse elektroder blir plassert i den elektrokjemiske cellen med IDA å utføre eksperimenter. (B) elektrokjemiske kontroll testene viser elektrisk uavhengighet av hver elektroden. Åpen krets potensialet av elektroden 2 svarer ikke til skiftende potensialet av elektroden 1 under CV, at elektrodene ikke er kortsluttet og kan brukes for biofilm gating målinger. (C) samme som B, bortsett fra potensialet i elektrode 2 skifte under CV av elektroden 1, at elektrodene er kortsluttet og bør ikke brukes for gating målinger. Denne IDA ble ikke brukt i videre studier. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: elektrokjemiske gating eksperimenter. (A) elektrokjemiske gating målinger av en levende, elektrode vokst G. sulfurreducens biofilm. Toppen formet jegSD-EG kurven er veiledende usammenhengende, flere trinn elektronet transport gjennom biofilm. Gjennomført gjeldende kurven ble oppnådd ved å trekke kilden fra avløpet gjeldende (og dele med 2) på hver gate potensial til å fjerne bakgrunnen strømninger. Eksempler på gjeldende rådata tatt med VSD = 0 og VSD = 0,01 V, leseren kalles støtte informasjonen av tidligere arbeid. 18 (B) temperatur avhengig gating measurementsover en fysiologisk relevante området viser en økning i ledningsevne som temperaturen er økt, en egenskap observert i redoks dirigenter. 4 (C) transformasjon av ISD -T data og passer til Arrhenius ligningen. Lineær Tilpass til Arrhenius ligningen er et tegn på en flertrinns elektron overføringsprosessen. Aktivisering energi for elektronet transport gjennom en G. sulfurreducens biofilm beregnes fra hellingen til buen ~0.01 eV, som samsvarer med elektronet transport mellom redoks sentre tilstøtende c-skriver cytochromes. 32 , 33 , 34 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Under installasjonen av IDA er det viktig å teste at kilden og avløpet ikke er kortsluttet sammen før elektrokjemiske gating målinger, da dette vil endre ISD vs EG kurve og kan føre til feilaktige resultater og tolkninger. Det er også viktig å velge VSD og v slik at gjeldende lineært avhengig av VSD og uavhengig av v. Hvis dette ikke er tilfelle, kan ikke deretter ligningene beskrevet ovenfor brukes til å beregne ledningsevne.

Minst to bakgrunn strøm må bli vurdert og fjernet fra gjennomført gjeldende mål. Først er bakgrunnen gjeldende på grunn av Faradaic lading/lossing av redoks kofaktorer som gate potensialet er blåst. Denne bakgrunn gjeldende er sterkt påvirket av mengden av redoks kofaktorer som er elektrisk tilgjengelige koblet til elektroden overflaten. Andre bakgrunn gjeldende er dobbeltlag kapasitans. En tredje bakgrunn gjeldende er omsetning på metabolske elektron acceptors/givere av celler. Denne bakgrunn gjeldende gjelder bare under omsetning forhold. Bakgrunn strømninger i denne studien ble eliminert ved å trekke kilden gjeldende fra avløpet dagens på VSD = 0,01 V. Denne metoden forutsetter at bakgrunnen strøm er lik på begge elektrodene og kilde strømforbruk strøm er lik størrelsen på både elektroder, men motsatt fortegn. I dette tilfellet trekke source og strøm gir en gjennomført gjeldende dobbel i omfanget og bør deles av to. Det bør bemerkes at denne antakelsen kun gjelder for i grensen på en liten VSD, som er avhengig av system (for G. sulfurreducens, VSD< 0,05 V). Større VSD verdier ofte resulterer i ulike forholdene på hver elektrode og hindrer denne metoden for bakgrunnen subtraksjon brukes. Alternativt bakgrunn strømmer kan fjernes ved å trekke kilde og avløp strøm på VSD = 0,0 V fra de på VSD = 0,01 V. Denne metoden ikke anta at planlagte strøm av hver elektroden er de samme.

Teknikken er beskrevet her er fleksibel. De fleste parameterne som beskrives i protokollen er avhengig av systemet under studien og kan endres. For eksempel materiale og dimensjoner av IDA kan varieres, kan temperaturområde, og rekke gate potensialene, blant andre parametere, endres for å passe behovene til bestemte studien. Videre, standard mikrobiologiske og elektrokjemiske teknikker er tilpasset og utnyttet, gjør dette protokollen egnet for forskere fra en rekke fagfelt.

Her har vi beskrev en protokoll for å studere elektronet transport i levende, elektrode vokst, electroactive biofilm bruker IDAs. IDAs har brukt tidligere å karakterisere elektronet transport i tynnfilm gjennomføre polymerer og kan være fabrikasjon benytter en rekke standard elektrode materialer og teknikker som photolithographic. 2 den primære fordelen med IDAs er høy signal til støy forhold på grunn av i) lenge serpentin gapet som skiller vekslende kilden og avløp elektrode band og ii) relativt liten totale elektrode overflaten sammenlignet gapet størrelsen. Elektroden geometrien er viktig å vurdere i gating målinger fordi elektroden og gapet dimensjonene har stor effekt på signalet til støyforhold og derfor på nøyaktigheten av ledningsevne målingene gjort. 18

Elektrokjemiske gating eksperimenter av levende, elektrode dyrket G. sulfurreducens biofilm utstillingen en klar topp formet avhengighet av ISD på EG, antyder at elektroner transporteres gjennom biofilm via usammenhengende, flere trinn hopper, som redoks ledende polymerer. 4 , 35 peak ledningsevne G. sulfurreducens biofilm ble funnet for å være ~ 4 µS/cm, med tidligere resultatene under like forhold. 17 videre porten potensielle for topp ledningsevne er lik midtpunktet potensielle observert for G. sulfurreducens biofilm under omsetning CV.17 dette er også observert tidligere og er postulert for å bety det samme elektron lagringsmediene av cellene for transport elektroner fra acetate metabolisme brukes også til å bære ansvaret fra kilden elektroden til avløp elektroden gjennom biofilm. Andre avhengigheter av ISD på EG, som er observert i ulike materialer og foreslå en annen mekanisme av elektron overføring. For eksempel ISD vs EG kurven av polymer poly(methylthiophene) viser en s-formet kurve og foreslår metallic-lignende elektron ledning. 36 , 37

Temperatur avhengigheten av gjennomført gjeldende er en viktig parameter ved mekanisme elektronet transport gjennom ledende materialer. Inntil nylig var bare ex-situ prøver brukt til å undersøke temperatur avhengigheten av gjennomført gjeldende gjennom en biofilm. 22 siste resultatene presentert her og andre steder17 fått en annen jegSD -T avhengighet bruker gating målinger og derfor forutsi en flertrinns, usammenhengende hopping mekanismen for elektronet transport gjennom G. sulfurreducens biofilm, som er forskjellig fra en tidligere foreslåtte mekanisme. 22

Stor begrensning av denne teknikken og andre lignende geometrier når du vurderer elektronet transport gjennom en mikrobiell biofilm er at tillegget beveger seg sidelengs mellom source og elektrodene i samme plan på en flat overflate. Den naturlige flyten av elektroner gjennom biofilm, men er vinkelrett på elektroden overflaten. Bruker denne teknikken og modell, vi anslå biofilm som en homogen film og avhøre elektron strømme gjennom bare en del av biofilm. Eksperimentelle validering av den romlige heterogeniteten i biofilm er fortsatt nødvendig for å fremme godkjenne denne teknikken. Men som beskrevet ovenfor, kan denne metoden i situ målinger med høyeste signalet til støyforhold tilgjengelig ennå. Denne teknikken kan brukes til å studere gratis transport av materiale som kan samhandle med en elektrode.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

M.D.Y og S.M.G-S. LMT erkjenner den Office of Naval Research (Award #N0001415WX01038 og N0001415WX00195), den Naval Research Laboratory og den Naval Research Laboratory Nanosciences Institute; M.Y.E.-N. støttes av den amerikanske avdelingen av energi Grant DE-FG02-13ER16415.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IDAs CH Instruments 012125 Manufactured by ALS-Japan; sold by CH Instruments
Wire Digikey W7-ND
Conductive silver epoxy Electron microscopy sciences 12670-EE
Insulating material 3M 2131-B Scotchast flame retardant compound
15 mL conical centrifuge tube VWR 89004-368
21g needle VWR BD-305165
5 mL pipette tips VWR 82018-842
5 mL pipettor VWR 89079-976
Freshwater medium components Sigma Aldrich All standard laboratory chemicals
    Ammonium chloride
    Sodium phosphate monobasic
    Sodium bicarbonate
Artificial seawater medium components Sigma Aldrich All standard laboratory chemicals
    Sodium chloride
    Magnesium chloride hexahydrate
    Magnesium sulfate heptahydrate
    Potassium chloride
    Sodium bicarbonate
    Calcium chloride dihydrate
    Ammonium chloride
    Potassium phosphate dibasic
Ag/AgCl reference electrode Basi MF-2079
Graphite rod counter electrode Electron microscopy sciences 70230
Recirculating water bath Thermo Scientific 152-5256
Bipotentiostat Pine Instruments WD-20 http://www.voltammetry.net/pine/aftermath/user
Stir bars VWR 58947-114
G. sulfurreducens culture ATCC 51573
Jacketed reactor Pine Instruments RRPG085

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boyd, D. A., et al. Biofilms in Bioelectrochemical Systems. , John Wiley & Sons, Inc. 177-210 (2015).
  2. Natan, M. J., Wrighton, M. S. Chemically modified microelectrode arrays. Prog Inorg Chem. 7, 391-494 (1990).
  3. Paul, E. W., Ricco, A. J., Wrighton, M. S. Resistance of polyaniline films as a function of electrochemical potential and the fabrication of polyaniline-based microelectronic devices. J Phys Chem-US. 89, 1441-1447 (1985).
  4. Dalton, E. F., et al. Charge transport in electroactive polymers consisting of fixed molecular redox sites. Chem Phys. 141, 143-157 (1990).
  5. Chidsey, C. E. D., Murray, R. W. Electroactive Polymers and Macromolecular Electronics. Science. 231, 25-31 (1986).
  6. Chidsey, C. E. D., Murray, R. W. Redox capacity and direct current electron conductivity in electroactive materials. J Phys Chem-US. 90, 1479-1484 (1986).
  7. Gregoire, K. P., Glaven, S. M., Hervey, J., Lin, B., Tender, L. M. Enrichment of a High-Current Density Denitrifying Microbial Biocathode. J Electrochem Soc. 161, H3049-H3057 (2014).
  8. Siegert, M., Yates, M. D., Spormann, A. M., Logan, B. E. Methanobacterium dominates biocathodic Archaeal communities in methanogenic microbial electrolysis cells. ACS Sus Chem Eng. 3, 1668-1676 (2015).
  9. Wang, Z., et al. A previously uncharacterized, nonphotosynthetic member of the Chromatiaceae is the primary CO2-fixing constituent in a self-regenerating biocathode. Appl Environ Microbiol. 81, 699-712 (2015).
  10. Marshall, C. W., Ross, D. E., Fichot, E. B., Norman, R. S., May, H. D. Long-term Operation of Microbial Electrosynthesis Systems Improves Acetate Production by Autotrophic Microbiomes. Environ Sci Technol. 47, 6023-6029 (2013).
  11. Strik, D. P. B. T. B., Picot, M., Buisman, C. J. N., Barrière, F. pH and Temperature Determine Performance of Oxygen Reducing Biocathodes. Electroanalysis. 25, 652-655 (2013).
  12. Strycharz, S. M., et al. Reductive dechlorination of 2-chlorophenol by Anaeromyxobacter dehalogenans with an electrode serving as the electron donor. Environ Microbiol Report. 2, 289-294 (2010).
  13. Yates, M. D., et al. Microbial Electrochemical Energy Storage and Recovery in a Combined Electrotrophic and Electrogenic Biofilm. Environ Sci Technol Lett. 4, 374-379 (2017).
  14. Tender, L. M., et al. Harnessing microbially generated power on the seafloor. Nature Biotechnology. 20, 821-825 (2002).
  15. Yates, M. D., Siegert, M., Logan, B. E. Hydrogen evolution catalyzed by viable and non-viable cells on biocathodes. Int J Hydrogen Energ. 39, 16841-16851 (2014).
  16. Fokina, O., Eipper, J., Winandy, L., Kerzenmacher, S., Fischer, R. Improving the performance of a biofuel cell cathode with laccase-containing culture supernatant from Pycnoporus sanguineus. Bioresource Technol. 175, 445-453 (2015).
  17. Yates, M. D., et al. Thermally activated long range electron transport in living biofilms. Phys Chem Chem Phys. 17, 32564-32570 (2015).
  18. Yates, M. D., et al. Measuring conductivity of living Geobacter sulfurreducens biofilms. Nat Nano. 11, 910-913 (2016).
  19. Snider, R. M., Strycharz-Glaven, S. M., Tsoi, S. D., Erickson, J. S., Tender, L. M. Long-range electron transport in Geobacter sulfurreducens biofilms is redox gradient-driven. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 15467-15472 (2012).
  20. Strycharz-Glaven, S. M., Snider, R. M., Guiseppi-Elie, A., Tender, L. M. On the electrical conductivity of microbial nanowires and biofilms. Energ Environ Sci. 4, 4366-4379 (2011).
  21. Malvankar, N. S., Tuominen, M. T., Lovley, D. R. Comment on "On electrical conductivity of microbial nanowires and biofilms" by S. M. Strycharz-Glaven, R. M. Snider, A. Guiseppi-Elie and L. M. Tender, Energy Environ. Sci., 2011, 4, 4366. Energy Environ. Sci. 5, 6247-6249 (2012).
  22. Malvankar, N. S., et al. Tunable metallic-like conductivity in microbial nanowire networks. Nat Nanotechnol. 6, 573-579 (2011).
  23. Strycharz-Glaven, S. M., Tender, L. M. Reply to the 'Comment on "On electrical conductivity of microbial nanowires and biofilms"' by N. S. Malvankar, M. T. Tuominen and D. R. Lovley, Energy Environ. Sci., 2012, 5. Energy Environ. Sci. 5, 6250-6255 (2012).
  24. Strycharz-Glaven, S. M., et al. Electron Transport through Early Exponential-Phase Anode-Grown Geobacter sulfurreducens Biofilms. Chem Electro Chem. 1, 1957-1965 (2014).
  25. Chidsey, C. E., Feldman, B. J., Lundgren, C., Murray, R. W. Micrometer-spaced platinum interdigitated array electrode: fabrication, theory, and initial use. Anal Chem. 58, 601-607 (1986).
  26. Li, C., Lesnik, K. L., Fan, Y., Liu, H. Redox Conductivity of Current-Producing Mixed Species Biofilms. PLOS ONE. 11, e0155247 (2016).
  27. Malvankar, N. S., et al. Tunable metallic-like conductivity in microbial nanowire networks. Nat Nano. 6, 573-579 (2011).
  28. Ing, N. L., Nusca, T. D., Hochbaum, A. I. Geobacter sulfurreducens pili support ohmic electronic conduction in aqueous solution. Phys Chem Chem Phys. 19, 21791-21799 (2017).
  29. Fricke, K., Harnisch, F., Schröder, U. On the use of cyclic voltammetry for the study of anodic electron transfer in microbial fuel cells. Energ Environ Sci. 1, 144-147 (2008).
  30. Marsili, E., Rollefson, J. B., Baron, D. B., Hozalski, R. M., Bond, D. R. Microbial biofilm voltammetry: direct electrochemical characterization of catalytic electrode-attached biofilms. Appl Environ Microbiol. 74, 7329-7337 (2008).
  31. Kankare, J., Kupila, E. -L. In-situ conductance measurement during electropolymerization. J Electroanal Chem. 322, 167-181 (1992).
  32. Byun, H. S., Pirbadian, S., Nakano, A., Shi, L., El-Naggar, M. Y. Kinetic Monte Carlo Simulations and Molecular Conductance Measurements of the Bacterial Decaheme Cytochrome MtrF. Chem Electro Chem. 1, 1932-1939 (2014).
  33. El Kasmi, A., Wallace, J. M., Bowden, E. F., Binet, S. M., Linderman, R. J. Controlling interfacial electron-transfer kinetics of cytochrome c with mixed self-assembled monolayers. J Am Chem Soc. 120, 225-226 (1998).
  34. Bortolotti, C. A., et al. The Reorganization Energy in Cytochrome c is Controlled by the Accessibility of the Heme to the Solvent. J Phys Chem Lett. 2, 1761-1765 (2011).
  35. Gallaway, J. W., Calabrese Barton, S. A. Kinetics of Redox Polymer-Mediated Enzyme Electrodes. J Am Chem Soc. 130, 8527-8536 (2008).
  36. Thackeray, J. W., White, H. S., Wrighton, M. S. Poly(3-methylthiophene)-coated electrodes: optical and electrical properties as a function of redox potential and amplification of electrical and chemical signals using poly(3-methylthiophene)-based microelectrochemical transistors. J Phys Chem-US. 89, 5133-5140 (1985).
  37. Jugnet, Y., Tourillon, G., Duc, T. M. Evidence of Intrinsic Extended π-Bonding Band and Metalliclike Behavior in Undoped and Doped Electropolymerized Poly (3-methylthiophene) Films. Phys Rev Lett. 56, 1862-1865 (1986).

Tags

Kjemi problemet 136 mikrobielle elektrokjemi mikrobielle Electrosynthesis Biofilm ledningsevne ekstracellulære elektronet Transport tynnfilm elektrokjemiske Gating
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yates, M., Strycharz-Glaven, S.,… More

Yates, M., Strycharz-Glaven, S., Golden, J., Roy, J., Tsoi, S., Erickson, J., El-Naggar, M., Calabrese Barton, S., Tender, L. Characterizing Electron Transport through Living Biofilms. J. Vis. Exp. (136), e54671, doi:10.3791/54671 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter