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Chemistry

Caracterizando o transporte de elétrons através de biofilmes de vida

Published: June 1, 2018 doi: 10.3791/54671
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2, 3, 1, 4, 5, 1
1Center for Bio/Molecular Science and Engineering, Naval Research Laboratory, 2George Mason University, 3Chemistry Division, Naval Research Laboratory, 4Departments of Physics, Biological Sciences, and Chemistry, University of Southern California, 5Department of Chemical Engineering and Materials Science, Michigan State University

Summary

É apresentado um protocolo para medir a condutividade elétrica de biofilmes microbianos de vivos sob condições fisiologicamente relevantes.

Abstract

Aqui vamos demonstrar o método de retenção de eletroquímica usada para caracterizar a condutividade elétrica de biofilmes microbianos eletrodo-cultivadas sob condições fisiologicamente relevantes. 1 estas medições são executadas em biofilmes de viver em meio aquoso, usando a fonte e drenagem eletrodos estampados em uma superfície de vidro em uma configuração especializada referida como uma matriz de eletrodo interdigitantes (IDA). Um biofilme é cultivado que se estende através da abertura, conectando a fonte e o dreno. Potenciais são aplicadas aos eletrodos (ES e ED) gerando uma corrente de dreno-fonte (ISD) através do biofilme entre os eletrodos. A dependência da condutividade elétrica em potencial de portão (a média dos potenciais fonte e o dreno, EG = [ED + ES] / 2) é determinado sistematicamente alterando o potencial do portão e o dreno-fonte resultante de medição atual. A dependência da condutividade no portão potencial fornece informações mecanicistas sobre o processo de transporte de elétrons extracelular subjacentes a condutividade elétrica do biofilme específico sob investigação. O método de medição associada electroquímico descrito aqui é baseado diretamente no usado por M. S. Wrighton2,3 e colegas e R. W. Murray4,5,6 e colegas em da década de 1980 é para investigar os polímeros condutores de película fina.

Introduction

Transporte de elétrons extracelular (EET) é um processo que permite que certos microorganismos para o transporte de elétrons entre os processos metabólicos intracelulares e aceitadores de electrões insolúveis ou doadores que residem fora da célula, variando de minerais naturais para eléctrodos. Em alguns casos, EET permite que microorganismos formar eletricamente condutivos várias células grossos biofilmes em superfícies de eletrodo, em que as células não em contacto directo com o eléctrodo podem ainda utilizá-lo como um aceptor de elétrons metabólica ou doador. Há considerável interesse em tais biofilmes como catalisadores de eletrodo para diversas aplicações, tais como Eletrosíntese microbiana, contaminantes de detecção/remoção e geração de energia remoto e armazenamento,,7,89 ,10,11,12,13,14 devido a diversidade de processos metabólicos realizados por microorganismos e a durabilidade dos biofilmes microbianos em comparação para bioelectrodes enzimáticos. 15 , 16 além disso, EET caminhos potencialmente podem ser utilizados para mudanças eletricamente controle ou sinal de ocorrência natural ou geneticamente processos metabólicos microbianos envolvidos, por exemplo, na produção de um produto desejado ou detecção de um analito de alvo ou estímulo. A condutividade elétrica de biofilmes de electrocatalytic, que define-os para além de outros materiais biológicos, é um aspecto central de suas propriedades electrocatalytic, no entanto, entende-se pouco sobre o processo subjacente de EET no ambiente do eletrodo, e o que é conhecido é altamente contestado. 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24

Descrito aqui é um método de 2-eletrodo para medir a condutividade através da vida, eletrodo-crescido biofilmes usando matrizes de eletrodo interdigitantes (IDAs). IDAs consistem em paralelos retangulares eletrodos estampados na superfície de vidro plano, tais que todas as outras bandas é conectada em lados opostos da matriz resultante em 2 eléctrodos (a fonte e o dreno). Exame cuidadoso de uma IDA (ver, por exemplo, a Figura 6.12b de ref #1) revela que as lacunas que separam as faixas adjacentes estão também ligados em forma a forma uma única lacuna que tece e para trás através da matriz separando os dois eletrodos. O resultado é uma longa e estreita abertura separando os eléctrodos de fonte e o dreno, produzindo correntes de fonte-dreno muito alta quando um material condutor é formado, elenco, polimerizado ou crescido (no caso do tipo de biofilmes considerados aqui) sobre a matriz. Além disso, o pequeno tamanho dos eléctrodos resulta em pequeno plano atual devido a capacidade de carga e a alteração no estado de oxidação do material condutor com mudança de portão potencial, desde que a quantidade de material necessário para fazer a condutividade as medições utilizando IDAs são tão pequenas. A técnica de IDA-based gating electroquímico descrito aqui, desenvolvido para caracterizar polímeros condutores de película fina,2,3,4,25 só recentemente tem sido aplicado a sistemas vivos. 18 outra técnica usada para medir a condutividade de biofilmes de vida utilizou um grande formato dividir eletrodos fonte e dreno e fonte metros para definir o portão potenciais. 26 , 27 no entanto, preocupações com esses métodos têm sido detalhadas anteriormente. 18

O protocolo abaixo encapsula a nossa experiência com a fazer medições de condutividade de viver Geobacter sulfurreducens e biocathode MCL biofilmes. G. sulfurreducens é um eletrodo de modelo reduzindo o organismo capaz de usar materiais insolúveis, incluindo eletrodos, como o aceitador de electrões metabólico único. Além disso, formar biofilmes grossos que são capazes de transportar elétrons ao longo de vários comprimentos de célula, tornando-se um organismo modelo ideal para estudar a transferência de elétrons de longa distância extracelular anódica. Nós também incluímos detalhes para o estudo da biocathode MCL, uma comunidade mista aeróbio, autotróficas biofilme isolado do cátodo de uma célula de combustível microbiana bentônica. Biocathode MCL (nomeado para os três principais constituintes – Marinobacter, Chromatiaceaea e Labrenzia) é capaz de oxidar um eletrodo como seu doador de elétron único e transporte de elétrons ao longo de vários comprimentos de pilha, fazendo é um sistema interessante catódico para estudar. Além disso, biocathode MCL tem a mais alta condutividade relatada para um sistema vivo para data usando esses métodos. A inclusão destes biofilmes eletroativos diversa neste protocolo destina-se a destacar que esta técnica é aplicável para medir o transporte de elétrons através de qualquer biofilme de vida capaz de interagir eletricamente com eletrodos.

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Protocol

1. preparação de microeletrodos interdigitantes matriz (IDA)

  1. Obter IDA disponível comercialmente eletrodos modelados sobre um substrato não condutora ou sintetizá-los usando métodos padrão litográficas. 28
    Nota: Dimensões de IDA e/ou materiais podem ser variadas com base em condições desejadas para experiências diferentes. IDAs aqui utilizados foram obtidos comercialmente e consistia de dois microeletrodos ouro interdigitantes modelados sobre um substrato de vidro ligado às almofadas grandes eletrodo em lados opostos da matriz. Os eletrodos são expostos enquanto as linhas de ônibus ligando os eletrodos para as grandes almofadas de contato são revestidas com material isolante fino. IDAs usados aqui são compostas por dois conjuntos de 10 µm largura e 2 mm bandas de microeletrodos há muito ouro (fonte e dreno) espaçados distante 5 µm, modelada sobre uma superfície plana de vidro. IDAs usado aqui tinha 65 pares de eletrodo (130 bandas interdigitantes totais). Bandas alternadas estão ligadas às almofadas do eletrodo em lados opostos da matriz.
  2. Fio e isolar IDA
    1. Ligue um fio para cada grande eletrodos pad usando condutivo epóxi prata.
      1. Prepare-se epóxi condutora de acordo com as instruções do fabricante para o epóxi específica em uso com uma ponta de vara ou pipeta mistura (instruções podem variar conforme o fabricante).
      2. Coloque um fio em cada bloco de ouro, seguro no lugar usando fita de laboratório. Cubra o fio e a almofada com epóxi prata usando uma ponta misturadora de haste ou pipeta.
      3. Cuidadosamente mova para um forno de 80 ° C durante 1 h a cura ou cura com base nas recomendações do fabricante para o epóxi prata condutor específico usado.
      4. Após a cura da cola epoxy, use um multímetro para garantir a ligação elétrica entre a extremidade do fio e as almofadas. A resistência entre o fio e a almofada deve ser < 5 Ω. Além disso, use o multímetro para verificar que não condutivo epóxi é Conectando várias almofadas do elétrodo, como este pode entrar em curto a matriz. Se condutivo epóxi é conectando diversas pistas, use um escriba para isolar os contatos.
    2. Isole a conexão epoxied revestindo a conexão com uma térmica, elétrica e material isolante à prova d'água. Resinas de poliuretano retardantes de chamas são muitas vezes adequadas.
      1. Retire a ponta de um tubo de centrifuga conico de 15 mL (até aproximadamente a marca de 2,5 mL) como um molde para o material de isolamento. Faça dois pequenos furos na parte inferior para os fios que se projetam através da utilização de uma agulha 21G.
      2. Insira a IDA do molde e fios através dos furos na parte inferior do molde.
      3. Prepare o material de isolamento específico. Siga as instruções fornecidas com a resina específica obtida.
      4. Pipetar o isolador para o molde, para que o epóxi prateado é completamente coberto (~2.5 mL) e deixe para secar de acordo com as especificações do fabricante.

2. instalação do reator eletroquímica, testes e inoculação

  1. Configure a célula eletroquímica.
    1. Insira IDA, elétrodo contrário e eletrodo de referência a célula eletroquímica.
      Nota: O reator eletroquímico utilizado pode variar amplamente, enquanto todos os eléctrodos cabem dentro. Uma consideração é que o eléctrodo de referência deve ser tão próximo quanto possível para o eletrodo de trabalho dado os limites práticos do reator. Aqui, usamos um reator de câmara única com a referência eletrodo ~ 2-3 cm dos eletrodos de trabalho. Além disso, o elétrodo contrário deve ser maior do que o eletrodo de trabalho para garantir que isso não é limitante no sistema.
    2. Se trabalhar com uma cultura pura, esterilize o reator com o eletrodo contador dentro. Esterilizar o eléctrodo de referência por imersão em água sanitária para 10 min e água desionizada estéril durante 10 min. esterilizar a IDA por imersão em água sanitária para 5 s seguido de água desionizada estéril para 10 s antes da inserção no reator.
    3. Preencha a célula eletroquímica com estéril meio adequado para o crescimento do biofilme. Por g. sulfurreducens17,18, use água doce média excluindo fumarato. Para biocathode MCL,9 uso médio da água do mar artificial. 9
    4. Conecte os eletrodos de um bipotentiostat. Conectar-se um eletrodo de IDA para a liderança de trabalho 1, o outro eletrodo de IDA para a liderança do trabalho 2, o eletrodo de referência para a pista de referência e o eletrodo contador para a liderança de contador.
  2. Ensaios eletroquímicos de IDAs.
    Nota: O objetivo deste teste é para certificar-se de que os dois eletrodos são eletricamente isolados. Todas as técnicas eletroquímicas estão disponíveis no software usado para controlar o bipotentiostat.
    1. Realize testes de condutividade de controle (antes do crescimento do biofilme) para garantir a adequada função de IDA usando um bipotentiostat.
      1. Medida do potencial de circuito aberto de cada eletrodo para 1 min.
        Nota: Em alguns instrumentos, potencial de circuito aberto deve ser alcançado usando o programa de coleta de galvanostatic e definindo a corrente para 0 mA.
      2. Medida do potencial de circuito aberto de eletrodo 2 durante a execução de voltametria cíclica no eletrodo 1 entre + 0,2 V para +0.6 V (contra ela) a 20 mV/s.
        Nota: Outros limites e taxas de varredura para CV podem ser usadas se desejado. No entanto, Evite potenciais que resultarão na geração de hidrogênio ou oxigênio.
      3. Verifique se que o potencial de circuito aberto medido no eletrodo 2 não espelhem o potencial de eletrodo 1 durante o CV, utilizando o software potentiostat.
        Nota: O potencial de circuito aberto de eletrodo 2 pode mudar, mas deve ser independente do potencial de eletrodo 1.
      4. Repita os passos 2.2.1.1 através de 2.2.1.3 exceto controle o potencial de elétrodo 2 e medir o potencial de circuito aberto de eletrodo 1.
    2. Defina o potencial dos eletrodos de trabalho para o potencial de crescimento desejado do biofilme eletroativos relevantes utilizando o software bipotentiostat. Por exemplo, uso +-0,5 V (vs ela) para Geobacter sulfurreducens ou +0.31 V (vs ela) para biocathode MCL.
  3. Crescer o biofilme eletroativos relevantes
    1. Inocule o reator eletroquímico de um cultura/enriquecimento das ações dos microorganismos eletroquimicamente ativos desejados utilizando técnicas microbiológicas assépticas padrão. Para testes padrão, inocular em um 01:20 ratio (inóculo para volume de reactor) de um OD600 = 0,5 cultura.
    2. Definir a agitação no reator para o nível desejado (~ 200 rpm) e a incubadora / banho de água à temperatura desejada baseada sobre as condições de crescimento do biofilme de interesse. Para g. sulfurreducens, use 30 ° C para o crescimento ideal.
    3. Incube o sistema com base em requisitos específicos da microorganism(s) de interesse até o biofilme preenche a lacuna que separa os dois eletrodos. Para estacionário sulfurreducens g. biofilme, incubar ~ 7-10 dias. Para biocathode MCL, incube ~ 7 dias. Em cada caso, controlar a temperatura de 30 ° C.

3. eletroquímicos experimentos associados

  1. Selecione os parâmetros experimentais que serão usados para determinar a dependência da corrente-potencial para as medições associadas.
    1. Determine a gama de potenciais de portão que será aplicado para a IDA para obter a corrente conduzida (ISD) versus curva (EG) potencial de portão para o sistema.
      Nota: A gama de potenciais portão examinados deve abranger todas as potencialidades com atividade redox possível. Se nenhuma informação sobre o sistema de interesse está disponível, uma gama ampla de potencial deve ser utilizado (-0.55 a +0.6 V vs ela). Uma abordagem de tentativa e erro pode ser usada para ajustar o intervalo baseado no sistema sob estudo. Portão potencial é definido como:
      Equation 1
      onde a ED é o potencial do eletrodo dreno e ES é o potencial do eletrodo da fonte. A gama de potenciais portão usado é restringida pelos requisitos e limitações do sistema específico de interesse. 18
      Nota: Potenciais de fonte e o dreno que resultarão na evolução de oxigênio e hidrogênio devem ser evitados, pois estes processos podem danificar o biofilme.
    2. Determine a tensão de fonte-dreno (VSD) que será usada como a força motriz para o transporte de elétrons através do filme da fonte para o dreno. Tensão de fonte-dreno é definido como:
      Equation 2
      Nota: A tensão de fonte-dreno deve ser suficientemente pequena para que o euSD escala linearmente com VSD. 17
    3. Escolha uma taxa de varredura (v) no qual EG é alterada linearmente com o tempo que é independente do euSD para que o sistema pode ser aproximado para estar no estado estacionário para cada portão potencial.
      Nota: Uma taxa de varredura de menos de 0.002 V/s é usada frequentemente para sistemas biológicos. 29 , 30
    4. Configurar o software bipotentiostat para realizar as medições associadas (ou seja, varrer o portão potencial) ao longo do intervalo selecionado, na tensão dreno-fonte selecionada e a taxa de varredura desejado com base nas considerações acima.
      Nota: para o anteriores associada as medições utilizando sulfurreducens g.,17,19 EG =-0.55 V de 0,6 V (contra ela), VSD = 0,01 V ou 0.1 V, v = V/s 0,001. Para Biocathode MCL, EG = 0,25 V 0,7 V (contra ela), VSD = 0.002 V, v = 0,0002 V/s.
      1. Além disso, realizar uma medição da linha de base com VSD = 0.000 V (ou seja, um CV em cada eletrodo individual tomado simultaneamente) no mesmo v escolhido na etapa 3.1.3.
    5. Realize medições associadas usando as condições em 3.1.4 sob ambos os volume de negócios (com doador de elétron solúvel ou aceitador presente) e não-volume de negócios (sem doador de elétron solúvel ou aceitador).
      Nota: Non-volume de negócios são condições vantajosas porque as medidas não são obscurecidas pela oxidação ou redução de compostos solúveis para o metabolismo celular, embora resultados semelhantes devem ser obtidos independentemente de qual condição é usada após subtraindo as correntes de fundo (detalhadas no 3.1.8).
      1. Alcançar condições de volume de negócios usando o mesmo meio de reator utilizado para o crescimento bacteriano, sobre o eletrodo. Este meio contém um dador de electrões solúveis, tais como acetato de sulfurreducens g.,17 ou aceitador, tais como oxigênio para Biocathode MCL.
      2. Alcançar condições de não-volume de negócios, tornando o mesmo meio de reator usado para o crescimento bacteriano, sobre o eletrodo, exceto omitir o dador de electrões solúvel ou aceitador. Depois de se assegurar que o potentiostat está desligado, retire o meio assepticamente e adicione no meio fresco sem o doador de elétron para sistemas anódicos ou aceitador para sistemas catódico. Como alternativa, você pode configurar um sistema de fluxo contínuo para substituir lentamente o meio com o meio desejado para nonturnover condições.
        Nota: Se o oxigênio é o aceitador de electrões solúvel (quanto biocathode MCL), sparge o sistema com uma mistura de ~ 15% CO2 e 85% N2 (ou uma mistura de gás que irá manter o pH correto no meio).
    6. Após a conclusão das medições associadas, use o software potentiostat para definir o potencial de cada eletrodo voltar para o crescimento potencial para permitir que o sistema de re-estabilização (usando os mesmos valores como em 2.2.2).
    7. Se estiverem reunidas todas as condições acima descritas (SD é independente de v e escala linearmente com VSD), eu converterSD valores para condutividade usando as seguintes equações como descrito anteriormente,31
      Equation 3
      Equation 4
    8. onde G é a condutância e S é um fator de escala que é dependente de sistema e fatores em variáveis tais como tamanho do eletrodo, tamanho de abertura e altura de biofilme. Para certos sistemas, S pode ser determinado de equações pré-determinadas. 31 como alternativa, S pode ser calculada numericamente usando um software de modelagem, como detalhado anteriormente. 17
    9. Subtrai as correntes de fundo para identificar a forma e a magnitude da corrente conduzida. Ou subtrair a corrente gerada no VSD = 0,00 V da corrente gerada no VSD = 0,01 V ou subtrair o dreno atual da fonte de corrente gerado com um VSD = 0,01 V. qualquer método remove fundo correntes, deixando somente a corrente conduzida.
  2. Dependentes eletroquímica associada as medições da temperatura
    1. Determine o intervalo de temperaturas de interesse. Este intervalo é altamente dependente do sistema sob estudo, as temperaturas no entanto fisiologicamente relevantes devem ser usadas.
      Nota: Estudos anteriores usaram uma escala de temperatura de 10 ° C a 30 ° C para estudar o transporte de elétrons sob condições fisiologicamente relevantes para os microrganismos mesófilos. 17
    2. Obter um banho de água de recirculação ou incubadora para regular a temperatura do reactor e um reator de controle para garantir que o ponto de ajuste e a temperatura real do meio é o mesmo.
      1. Coloque um termómetro ou o termopar em um reator de controle onde seria a IDA.
    3. Eu fazer medições deSD (ver 3.1.4) na faixa de temperatura selecionada em volume de negócios e nonturnover (descrito na etapa 3.1.5) condições usando o bipotentiostat a seguir um dos procedimentos descritos abaixo.
      1. Eu gerarSD vs curvas EG , como descrito anteriormente (ver 3.1), para cada temperatura na faixa de temperatura de interesse. Para materiais que apresentam condutividade redox, tais como sulfurreducens g. e Biocathode MCL, o pico de corrente de cada temperatura é usado para determinar o euSD vs dependência T.
        Nota: Este método é usado para gerar um cheio euSD vs EG curva para cada temperatura, mas requer mais tempo do que a segunda opção.
      2. Alternadamente, definir e segurar a IDA no portão potencial que produz máximo conduzido atual usando o bipotentiostat (obtido a partir doSD eu curva de vs EG , passo 3.1.4) e gravar a corrente máxima conduzida usando o bipotentiostat enquanto a temperatura é um ciclo entre o intervalo de temperaturas selecionadas usando os controles a bordo do banho-maria ou incubadora.
        Nota: com a geometria do eletrodo/reator usada aqui, o que serão autorizados a estabilizar pelo menos 20 min e uma média estável euSD SD e T é usado para cada temperatura. Mais ou menos tempo de estabilização pode ser exigido com base no sistema específico. Este método é mais rápido do que o primeiro e causa menos stress para o biofilme. No entanto, cheio de curvas associadas não são geradas.
      3. A temperatura do ciclo de um conjunto de ponto para o outro e de volta novamente usando os controles a bordo da incubadora ou o banho de água para determinar a reversibilidade da reação para garantir que a temperatura de ciclismo não prejudique o biofilme.
    4. Redefinida a temperatura para a temperatura de crescimento normal usando os controles a bordo da banheira incubadora ou água e permitir que o sistema se estabilize.
      Nota: Para um condutor de redox, o euSD versus 1/T dados podem ser cabido com a expressão de taxa de Arrhenius, que permite o cálculo da energia de ativação da seguinte forma:
      Equation 5
      Equation 6
      onde Eum é a energia de ativação para a transferência de elétrons entre cofactores redox adjacentes e k é a constante de Boltzmann.

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Representative Results

IDAs foram ligadas, isoladas e testadas para garantir que os dois eletrodos eram eletricamente isolados uns dos outros (Figura 1). Reatores foram montados, inoculadas com g. sulfurreducense incubados até um biofilme construiu uma ponte sobre a abertura entre os eletrodos. O biofilme sulfurreducens g. pode ser visto visualmente para cobrir a matriz. Outros biofilmes podem exigir o pesquisador fazer um eletroquímica associada medições para ver se os dois eletrodos foram conectados eletricamente. Microscopia também deve ser usada para verificar a conexão entre os eletrodos da matriz. Eletroquímicos associados experimentos foram realizados para determinar a dependência de ISD EG (Figura 2). A condutividade do filme vida é então calculada usando a corrente conduzida medida nos experimentos associados. A precisão e a precisão dessas medições foi elevado devido a alta sinal à relação de ruído possível com a configuração de IDA. A dependência da temperatura de ISD T determinou-se, também, juntamente com uma energia de ativação para o transporte de elétrons através do biofilme (Figura 2). Os resultados obtidos aqui são similares àqueles observados anteriormente17,18 e suportam a hipótese que g. sulfurreducens e biocathode MCL biofilmes se comportam da mesma forma a condutores redox onde elétrons são transferidos através do biofilme por pulando entre cofactores redox perto na proximidade.

Figure 1
Figura 1: IDA configurar e controlar os ensaios eletroquímicos. (A) uma IDA que foi prendida e isolada. Baixo-relevo: Ampliado imagem da matriz mostrando os eléctrodos interdigitantes e uma das almofadas do eletrodo grande. Eletrodos de referência e contador separados são colocados dentro da célula eletroquímica juntamente com a IDA para realizar experimentos. (B) controle eletroquímica testes exibindo elétrica independência de cada eletrodo. O potencial de circuito aberto de eletrodo 2 não responde ao potencial do eletrodo 1 mudança durante CV, indicando que os eletrodos não são curto-circuitados e podem ser usados para medições de retenção de biofilme. (C) igual a B, exceto o potencial de eletrodo 2 deslocar durante CV do eletrodo 1, indicando que os eléctrodos estão em curto e não devem ser usados para retenção de medições. Esta IDA não foi utilizada em novas experiências. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: eletroquímica gating experimentos. (A) eletroquímicas gating medições de um vivo, eletrodo crescido sulfurreducens g. biofilme. O pico em forma de euSD-EG curva é indicativa de incoerente, várias etapa de transporte de elétrons através do biofilme. A curva atual realizada foi obtida subtraindo-se a fonte do dreno atual (e dividindo por 2) obtidos em cada potencial de portão para eliminar as correntes de fundo. Para obter exemplos de dados brutos de atuais tirados com VSD = 0 e VSD = 0,01 V, o leitor é referido o apoio informações de trabalhos anteriores. 18 (B) temperatura dependente gating measurementsover uma gama fisiologicamente relevante exibindo um aumento na condutividade como a temperatura é elevada, uma propriedade observada para condutores de redox. 4 (C) transformação doSD -T dados e ajuste para a equação de Arrhenius. O ajuste linear para a equação de Arrhenius é indicativo de um processo de transferência de electrões de várias etapas. A energia de ativação para o transporte de elétrons através de um biofilme sulfurreducens g. é calculada a partir do declive da curva de ser ~0.01 eV, que é consistente com o transporte de elétrons entre centros redox do adjacente c-digite citocromos. 32 , 33 , 34 Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Durante a configuração do IDA, é crítico para testar que a fonte e o dreno não são curto-circuitados juntos antes da eletroquímicas associadas medições, como isso irá alterar o euSD vs EG curva e pode levar a interpretações e resultados errados. Também é fundamental para selecionar VSD e v tal que a corrente é linearmente dependente VSD e independente de v. Se isso não for o caso, então, as equações acima descritas não podem ser utilizadas para calcular a condutividade.

Pelo menos duas correntes de fundo devem ser consideradas e retiradas realizadas medições de corrente. O primeiro é o fundo atual devido a Faradaic de carregamento/descarregamento de cofactores o redox como o potencial de portão é varrido. Neste contexto atual é muito afetado pela quantidade de cofactores que são acessíveis eletricamente conectados à superfície do eletrodo de redox. Um segundo plano de fundo atual é a capacitância da dupla camada. Um terceiro plano de fundo atual é devido ao volume de negócios de aceitadores/doadores de elétrons metabólica pelas células. Neste contexto atual só é aplicável em condições de volume de negócios. Correntes de fundo neste estudo foram eliminadas subtraindo-se a fonte atual da corrente de dreno obtida no VSD = 0,01 V. Este método assume que as correntes de fundo são iguais em ambos os eletrodos e fonte-dreno correntes são iguais em magnitude em ambos os eletrodos, mas de sinal contrário. Subtrair-se neste caso as correntes de fonte e o dreno produz um duplo atual realizado em magnitude e deve ser dividido por dois. Note-se que esta hipótese somente se aplica no limite de um pequeno VSD, que é dependente de sistema (por g. sulfurreducens, VSD< 0.05 V). Valores maiores VSD muitas vezes resulta em condições díspares em cada eletrodo e impede que esse método de subtração de fundo sejam usados. Alternativamente, as correntes de fundo pode ser removidas subtraindo fonte e drenar correntes obtidas no VSD = 0,0 V daqueles obtidos em VSD = 0,01 V. Este método não assume que as correntes de linha de base de cada eletrodo são os mesmos.

A técnica descrita aqui é flexível. A maioria dos parâmetros descritos no protocolo é dependente do sistema em estudo e pode ser alterada. Por exemplo, o material e dimensões de IDA podem ser variadas, a escala de temperatura e gama de potenciais de portão, entre outros parâmetros, podem ser alteradas para atender às necessidades do estudo específico. Além disso, padrão técnicas microbiológicas e eletroquímicas são adaptadas e utilizados, fazendo isso o protocolo apropriado para pesquisadores de várias áreas de estudo.

Aqui descrevemos um protocolo para o estudo de transporte de elétrons na vida, eletrodo crescido, biofilmes eletroativos usando IDAs. IDAs foram usadas anteriormente para caracterizar o transporte de elétrons em película fina realização de polímeros e podem ser fabricadas usando uma variedade de materiais do padrão de eletrodo e fotolitográfica técnicas. 2 a principal vantagem de IDAs é o sinal elevado à relação devido i) o longa serpentina fosso que separa a fonte alternada de ruído e drenar bandas de eletrodo e ii) a área de superfície de eletrodo total relativamente pequeno em comparação com o tamanho da lacuna. A geometria do eletrodo é importante considerar na retenção de medições porque as dimensões de eletrodo e gap tem um grande efeito na relação sinal / ruído e, portanto, sobre a precisão das medições efectuadas condutividade. 18

Eletroquímico de retenção de experiências de vida, eletrodo-crescido sulfurreducens g. biofilmes exposição um pico claro em forma de dependência do euSD na EG, sugerindo que os elétrons são transportados através do biofilme através de incoerente, várias etapas pulando, como em polímeros condutores redox. 4 , 35 a condutividade de pico do biofilme sulfurreducens g. foi encontrada para ser ~ 4 µS/cm, de acordo com os resultados anteriores obtidos em condições semelhantes. 17 além disso, o portal potencial para condutividade de pico é semelhante ao ponto médio potencial observado para sulfurreducens g. biofilmes durante volume CV17 isto também tem sido observado anteriormente e é postulado para dizer que o mesmo carreadoras de elétrons utilizadas pelas células para o transporte de elétrons resultante acetato metabolismo também são usadas para transportar carga do elétrodo fonte ao eléctrodo de drenagem através do biofilme. Outras dependências do euSD na EG, tais como foram observadas em materiais diferentes e sugerem um mecanismo diferente de transferência de elétrons. Por exemplo, aSD vs EG curva de poly(methylthiophene) o polímero mostra uma curva em s e sugere a condução metálica, como elétron. 36 , 37

A dependência de temperatura de corrente conduzida é um parâmetro crítico em determinar o mecanismo de transporte de elétrons através de materiais condutores. Até recentemente, apenas as amostras ex situ tinham sido usadas para investigar a dependência de temperatura da corrente conduzida através de um biofilme. 22 resultados recentes apresentados aqui e alhures17 obteve um diferente euSD – dependência T usando medições associadas e, portanto, prever um mecanismo de várias etapa, incoerente salto de transporte de elétrons através de G. sulfurreducens biofilmes, que é diferentes de um mecanismo proposto anteriormente. 22

A principal limitação dessa técnica e outras geometrias semelhantes ao avaliar o transporte de elétrons através de um biofilme microbiano é que a carga se move lateralmente entre os eletrodos de fonte e o dreno colocados no mesmo plano sobre uma superfície plana. O fluxo natural de elétrons através do biofilme, no entanto, é perpendicular à superfície do eletrodo. Usando esta técnica e o modelo, podemos aproximar o biofilme como um filme homogêneo e interrogar o fluxo de elétrons através de apenas uma parte do biofilme. Validação experimental da heterogeneidade espacial do biofilme é ainda necessária validar ainda mais essa técnica. No entanto, como descrito acima, esse método permite medições in situ, com o mais alto sinal à relação de ruído disponível até à data. Esta técnica pode ser usada para estudar a carga transporte de qualquer material que seja capaz de interagir com um eletrodo.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

M.D.Y, S.M.G-S. e LMT reconheceram o escritório de pesquisa Naval (prêmio #N0001415WX01038 e N0001415WX00195), o laboratório de pesquisa Naval e o Naval Research Laboratory nanociências Institute; M.Y.E.-N. é suportado por os E.U. departamento de energia Grant DE-FG02-13ER16415.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IDAs CH Instruments 012125 Manufactured by ALS-Japan; sold by CH Instruments
Wire Digikey W7-ND
Conductive silver epoxy Electron microscopy sciences 12670-EE
Insulating material 3M 2131-B Scotchast flame retardant compound
15 mL conical centrifuge tube VWR 89004-368
21g needle VWR BD-305165
5 mL pipette tips VWR 82018-842
5 mL pipettor VWR 89079-976
Freshwater medium components Sigma Aldrich All standard laboratory chemicals
    Ammonium chloride
    Sodium phosphate monobasic
    Sodium bicarbonate
Artificial seawater medium components Sigma Aldrich All standard laboratory chemicals
    Sodium chloride
    Magnesium chloride hexahydrate
    Magnesium sulfate heptahydrate
    Potassium chloride
    Sodium bicarbonate
    Calcium chloride dihydrate
    Ammonium chloride
    Potassium phosphate dibasic
Ag/AgCl reference electrode Basi MF-2079
Graphite rod counter electrode Electron microscopy sciences 70230
Recirculating water bath Thermo Scientific 152-5256
Bipotentiostat Pine Instruments WD-20 http://www.voltammetry.net/pine/aftermath/user
Stir bars VWR 58947-114
G. sulfurreducens culture ATCC 51573
Jacketed reactor Pine Instruments RRPG085

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References

  1. Boyd, D. A., et al. Biofilms in Bioelectrochemical Systems. , John Wiley & Sons, Inc. 177-210 (2015).
  2. Natan, M. J., Wrighton, M. S. Chemically modified microelectrode arrays. Prog Inorg Chem. 7, 391-494 (1990).
  3. Paul, E. W., Ricco, A. J., Wrighton, M. S. Resistance of polyaniline films as a function of electrochemical potential and the fabrication of polyaniline-based microelectronic devices. J Phys Chem-US. 89, 1441-1447 (1985).
  4. Dalton, E. F., et al. Charge transport in electroactive polymers consisting of fixed molecular redox sites. Chem Phys. 141, 143-157 (1990).
  5. Chidsey, C. E. D., Murray, R. W. Electroactive Polymers and Macromolecular Electronics. Science. 231, 25-31 (1986).
  6. Chidsey, C. E. D., Murray, R. W. Redox capacity and direct current electron conductivity in electroactive materials. J Phys Chem-US. 90, 1479-1484 (1986).
  7. Gregoire, K. P., Glaven, S. M., Hervey, J., Lin, B., Tender, L. M. Enrichment of a High-Current Density Denitrifying Microbial Biocathode. J Electrochem Soc. 161, H3049-H3057 (2014).
  8. Siegert, M., Yates, M. D., Spormann, A. M., Logan, B. E. Methanobacterium dominates biocathodic Archaeal communities in methanogenic microbial electrolysis cells. ACS Sus Chem Eng. 3, 1668-1676 (2015).
  9. Wang, Z., et al. A previously uncharacterized, nonphotosynthetic member of the Chromatiaceae is the primary CO2-fixing constituent in a self-regenerating biocathode. Appl Environ Microbiol. 81, 699-712 (2015).
  10. Marshall, C. W., Ross, D. E., Fichot, E. B., Norman, R. S., May, H. D. Long-term Operation of Microbial Electrosynthesis Systems Improves Acetate Production by Autotrophic Microbiomes. Environ Sci Technol. 47, 6023-6029 (2013).
  11. Strik, D. P. B. T. B., Picot, M., Buisman, C. J. N., Barrière, F. pH and Temperature Determine Performance of Oxygen Reducing Biocathodes. Electroanalysis. 25, 652-655 (2013).
  12. Strycharz, S. M., et al. Reductive dechlorination of 2-chlorophenol by Anaeromyxobacter dehalogenans with an electrode serving as the electron donor. Environ Microbiol Report. 2, 289-294 (2010).
  13. Yates, M. D., et al. Microbial Electrochemical Energy Storage and Recovery in a Combined Electrotrophic and Electrogenic Biofilm. Environ Sci Technol Lett. 4, 374-379 (2017).
  14. Tender, L. M., et al. Harnessing microbially generated power on the seafloor. Nature Biotechnology. 20, 821-825 (2002).
  15. Yates, M. D., Siegert, M., Logan, B. E. Hydrogen evolution catalyzed by viable and non-viable cells on biocathodes. Int J Hydrogen Energ. 39, 16841-16851 (2014).
  16. Fokina, O., Eipper, J., Winandy, L., Kerzenmacher, S., Fischer, R. Improving the performance of a biofuel cell cathode with laccase-containing culture supernatant from Pycnoporus sanguineus. Bioresource Technol. 175, 445-453 (2015).
  17. Yates, M. D., et al. Thermally activated long range electron transport in living biofilms. Phys Chem Chem Phys. 17, 32564-32570 (2015).
  18. Yates, M. D., et al. Measuring conductivity of living Geobacter sulfurreducens biofilms. Nat Nano. 11, 910-913 (2016).
  19. Snider, R. M., Strycharz-Glaven, S. M., Tsoi, S. D., Erickson, J. S., Tender, L. M. Long-range electron transport in Geobacter sulfurreducens biofilms is redox gradient-driven. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 15467-15472 (2012).
  20. Strycharz-Glaven, S. M., Snider, R. M., Guiseppi-Elie, A., Tender, L. M. On the electrical conductivity of microbial nanowires and biofilms. Energ Environ Sci. 4, 4366-4379 (2011).
  21. Malvankar, N. S., Tuominen, M. T., Lovley, D. R. Comment on "On electrical conductivity of microbial nanowires and biofilms" by S. M. Strycharz-Glaven, R. M. Snider, A. Guiseppi-Elie and L. M. Tender, Energy Environ. Sci., 2011, 4, 4366. Energy Environ. Sci. 5, 6247-6249 (2012).
  22. Malvankar, N. S., et al. Tunable metallic-like conductivity in microbial nanowire networks. Nat Nanotechnol. 6, 573-579 (2011).
  23. Strycharz-Glaven, S. M., Tender, L. M. Reply to the 'Comment on "On electrical conductivity of microbial nanowires and biofilms"' by N. S. Malvankar, M. T. Tuominen and D. R. Lovley, Energy Environ. Sci., 2012, 5. Energy Environ. Sci. 5, 6250-6255 (2012).
  24. Strycharz-Glaven, S. M., et al. Electron Transport through Early Exponential-Phase Anode-Grown Geobacter sulfurreducens Biofilms. Chem Electro Chem. 1, 1957-1965 (2014).
  25. Chidsey, C. E., Feldman, B. J., Lundgren, C., Murray, R. W. Micrometer-spaced platinum interdigitated array electrode: fabrication, theory, and initial use. Anal Chem. 58, 601-607 (1986).
  26. Li, C., Lesnik, K. L., Fan, Y., Liu, H. Redox Conductivity of Current-Producing Mixed Species Biofilms. PLOS ONE. 11, e0155247 (2016).
  27. Malvankar, N. S., et al. Tunable metallic-like conductivity in microbial nanowire networks. Nat Nano. 6, 573-579 (2011).
  28. Ing, N. L., Nusca, T. D., Hochbaum, A. I. Geobacter sulfurreducens pili support ohmic electronic conduction in aqueous solution. Phys Chem Chem Phys. 19, 21791-21799 (2017).
  29. Fricke, K., Harnisch, F., Schröder, U. On the use of cyclic voltammetry for the study of anodic electron transfer in microbial fuel cells. Energ Environ Sci. 1, 144-147 (2008).
  30. Marsili, E., Rollefson, J. B., Baron, D. B., Hozalski, R. M., Bond, D. R. Microbial biofilm voltammetry: direct electrochemical characterization of catalytic electrode-attached biofilms. Appl Environ Microbiol. 74, 7329-7337 (2008).
  31. Kankare, J., Kupila, E. -L. In-situ conductance measurement during electropolymerization. J Electroanal Chem. 322, 167-181 (1992).
  32. Byun, H. S., Pirbadian, S., Nakano, A., Shi, L., El-Naggar, M. Y. Kinetic Monte Carlo Simulations and Molecular Conductance Measurements of the Bacterial Decaheme Cytochrome MtrF. Chem Electro Chem. 1, 1932-1939 (2014).
  33. El Kasmi, A., Wallace, J. M., Bowden, E. F., Binet, S. M., Linderman, R. J. Controlling interfacial electron-transfer kinetics of cytochrome c with mixed self-assembled monolayers. J Am Chem Soc. 120, 225-226 (1998).
  34. Bortolotti, C. A., et al. The Reorganization Energy in Cytochrome c is Controlled by the Accessibility of the Heme to the Solvent. J Phys Chem Lett. 2, 1761-1765 (2011).
  35. Gallaway, J. W., Calabrese Barton, S. A. Kinetics of Redox Polymer-Mediated Enzyme Electrodes. J Am Chem Soc. 130, 8527-8536 (2008).
  36. Thackeray, J. W., White, H. S., Wrighton, M. S. Poly(3-methylthiophene)-coated electrodes: optical and electrical properties as a function of redox potential and amplification of electrical and chemical signals using poly(3-methylthiophene)-based microelectrochemical transistors. J Phys Chem-US. 89, 5133-5140 (1985).
  37. Jugnet, Y., Tourillon, G., Duc, T. M. Evidence of Intrinsic Extended π-Bonding Band and Metalliclike Behavior in Undoped and Doped Electropolymerized Poly (3-methylthiophene) Films. Phys Rev Lett. 56, 1862-1865 (1986).

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