Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Elektron taşıma yaşayan biyofilmler ile karakterize

Published: June 1, 2018 doi: 10.3791/54671
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2, 3, 1, 4, 5, 1
1Center for Bio/Molecular Science and Engineering, Naval Research Laboratory, 2George Mason University, 3Chemistry Division, Naval Research Laboratory, 4Departments of Physics, Biological Sciences, and Chemistry, University of Southern California, 5Department of Chemical Engineering and Materials Science, Michigan State University

Summary

Fizyolojik olarak ilgili koşullar altında yaşayan mikrobiyal biyofilmler elektriksel iletkenlik ölçüm için bir protokol sunulmuştur.

Abstract

Burada biz elektrokimyasal perdeleme yöntemini elektrot-yetiştirilen mikrobiyal biyofilmler fizyolojik ilgili koşullar altında elektriksel iletkenlik karakterize etmek için kullanılan göstermektedir. 1 bu ölçümler kaynağı kullanılarak sulu ortamda yaşayan biyofilmler üzerinde gerçekleştirilen ve elektrotlar cam yüzeyi interdigitated elektrot (IDA) dizi olarak adlandırılan özel bir yapılandırma desenli drenaj. Bir biyofilm drenaj ve kaynak bağlama boşluğu arasında uzanan büyüyor. Potansiyeller için elektrotlar (ES ve ED) için geçerli olan bir kaynak tüketen akım (ıSD) aracılığıyla elektrot arasındaki biyofilm oluşturma. Elektriksel iletkenlik kapısı potansiyel üzerinde bağımlılık (kaynak ve drenaj potansiyelleri, EG ortalama = [ED + ES] / 2) sistematik olarak kapıyı potansiyel değiştirme ve elde edilen kaynak tüketen ölçme tarafından belirlenir geçerli. İletkenlik kapıya potansiyel bağımlılık mekanik soruşturma altında belirli biyofilm elektriksel iletkenlik temel hücre dışı elektron taşıma işlemi hakkında bilgi sağlar. Burada açıklanan elektrokimyasal gating ölçüm yöntemiyle alan doğrudan M. S. Wrighton2,3 ve meslektaşları ve R. W. Murray4,5,6 ve meslektaşları tarafından kullanılan tarih ince film iletken polimerler araştırmak için 1980's.

Introduction

Hücre dışı elektron taşıma (EET) elektron hücre içi metabolik süreçleri ve çözünmez elektron alıcısı veya doğal mineraller arasında değişen hücre dışında bulunan bağışçılar arasında taşımak bazı mikroorganizmalar sağlayan bir süreçtir elektrotlar. Bazı durumlarda, EET mikroorganizmaların elektrot yüzeylerinde hangi hücreleri elektrot ile doğrudan temas halinde değil hala bu bir metabolik elektron alıcısı veya donör olarak kullanabilir, elektriksel olarak iletken çok hücreli kalın biyofilmler oluşturmak sağlar. Böyle biyofilmler elektrot katalizörler mikrobiyal electrosynthesis, kirletici algılama/kaldırma ve Uzaktan enerji üretimi ve depolama,7,8,9 gibi çeşitli uygulamalar için olarak büyük ilgi ,10,11,12,13,14 mikroorganizmalar ve mikrobiyal biyofilmler karşılaştırıldığında dayanıklılığını tarafından gerçekleştirilen metabolik süreçleri çeşitliliği nedeniyle enzim tabanlı bioelectrodes için. 15 , 16 Ayrıca, EET yolları potansiyel elektrikle denetimi veya sinyal doğal olarak meydana gelen değişiklikler için kullanılması gereken veya genetik olarak söz konusu, örneğin, istediğiniz ürün veya algılama üretiminde mikrobiyal metabolik süreçleri bir hedef analit veya uyarıcı. Onları diğer biyolojik malzemeler dışında setleri, electrocatalytic biyofilmler elektriksel iletkenlik electrocatalytic özellikleri merkezi bir yönüdür henüz küçük elektrot ortamda temel EET işlemi hakkında anlaşılmaktadır, ve bu da bilinen son derece tartışmalı. 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24

Burada açıklanan iletkenlik ile yaşayan, elektrot-yetiştirilen biyofilmler interdigitated elektrot dizilerin (Idas) kullanarak ölçmek için bir 2-elektrot yöntemidir. Idas oluşur her diğer grup dizi elde edilen ters tarafı bağlı öyle ki düz cam yüzeyde desenli paralel dikdörtgen elektrot 2 elektrotlar (kaynak ve drenaj) içinde. Bir Ida dikkatli incelenmesi (örneğin, bkz: Şekil 6.12b ref #1) da bitişik grup ayıran boşluklar olan bu formu olarak böyle bir şekilde ileri geri iki elektrot ayıran dizi örgüleri tek bir boşluk bağlı ortaya koymaktadır. Sonuç bir iletken malzeme oluşmuş, döküm, polimerli veya (burada kabul biyofilmler türü söz konusu olduğunda) dizi üzerinde yetiştirilen çok yüksek kaynak tüketen akımları verimli kaynak ve drenaj elektrotlar ayıran uzun ve dar bir boşluğudur. Buna ek olarak, elektrotlar küçük boyutu küçük arka planda kapasitans şarj nedeniyle ve malzeme miktarını iletkenlik yapmak için gerekli beri geçit potansiyel, değişiklik ile iletken malzeme oksidasyon durumunu değiştirmek için geçerli sonuçlar Idas kullanarak ölçüleri öyle küçük ki. Ida tabanlı tekniği elektrokimyasal çoğunluğuna burada, açıklanan ince film iletken polimerler karakterize etmek için geliştirilen,2,3,4,25 ancak son zamanlarda yaşayan sistemler için uygulanmıştır. 18 başka bir tekniği yaşam biyofilmler iletkenlik ölçmek için kullanılan kaynak ve drenaj elektrotlar ve kapıyı potansiyel ayarlamak için kaynak metre büyüklüğündeki kullanılmıştır. 26 , 27 ancak, bu yöntemler üzerinde endişeler daha önce ayrıntılı. 18

İletişim kuralı aşağıdaki yaşam iletkenlik ölçümler yaparak ile deneyimlerimiz Kapsüller Geobacter sulfurreducens ve biocathode MCL biyofilmler. G. sulfurreducens bir modeli elektrot organizma elektrotlar, tek metabolik elektron alıcısı olarak çözünmez materyalleri kullanmak mümkün azaltmak olduğunu. Ayrıca, birden çok hücre uzunlukları yapım o anodik uzun mesafe ekstraselüler Elektron transferi çalışmaya bir ideal model organizma üzerinde elektron taşıma edebiliyoruz kalın biyofilmler oluşturur. Biz de biocathode MCL, bentik mikrobik yakıt hücresi katot izole bir aerobik, otortorfiktir karışık topluluk biyofilm çalışma ayrıntılarını içerir. Biocathode (üç birincil bileşenlerinin için – Marinobacter, Chromatiaceaea ve Labrenziaadlı) MCL yapma bir elektrot onun tek elektron donör olarak oksitleyici ve birden çok hücre uzunlukları üzerinde elektron taşıma özelliği olan Bu çalışma için ilginç bir katodik sistem. Buna ek olarak, bu yöntemleri kullanarak bugüne kadar canlı bir sistem için bildirilen en yüksek iletkenlik biocathode MCL vardır. Bu iletişim kuralı bu çeşitli electroactive biyofilmler eklenmesi bu teknik herhangi bir yaşam biyofilm elektrikle elektrotlar ile etkileşim mümkün aracılığıyla elektron taşıma ölçmek için uygulanabilir olduğunu vurgulamak içindir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. interdigitated elektrot dizi (IDA) hazırlık

  1. Piyasada bulunan Ida nonconductive substrat desenli elektrotlar elde etmek veya onları sentez standart tekniğinde yöntemleri kullanarak. 28
    Not: IDA boyutları ve/veya malzemeleri farklı deneyler için istenen koşullara göre değiştirilebilir. Idas kullanılan burada ticari olarak elde edilen ve iki interdigitated altın microelectrodes büyük elektrot pedleri dizinin ters ucunda bağlı bir cam alt katman üzerinde desenli ibaretti. Elektrotlar büyük kişi yastıkları bağlama otobüs hatları ince yalıtım malzeme ile kaplı iken elektrotlar maruz kalır. Idas kullanılan burada iki oluşmaktadır setleri 10 µm çapında ve 2 mm kadar altın elektrot grup (kaynak ve drenaj) aralıklı 5 mikron ayrı bir düz cam yüzeye desenli. Idas kullanılan burada 65 elektrot çiftleri (130 Toplam interdigitated bantları) vardı. Alternatif bantları elektrot pedleri dizinin ters ucunda bağlı.
  2. Tel ve Ida izole
    1. Bir tel iletken gümüş epoksi kullanarak her büyük elektrot pad iliştirin.
      1. Karıştırıcı çubuk veya pipet ucu ile kullanılan belirli epoksi için (talimatlar üreticisi tarafından değişiklik) üreticinin yönergelerine uygun iletken epoksi hazırlayın.
      2. Bir tel altın her pad, laboratuvar bant kullanarak yerde güvenli yerleştirin. Tel ve yastık karıştırıcı çubuk veya pipet ucu kullanarak gümüş epoksi ile kapağı.
      3. Dikkatle tedavi için 1 h 80 ° C fırında taşımanız veya üreticisinin önerileri için kullanılan belirli iletken gümüş epoksi tedavi temel.
      4. Epoksi tedaviler sonra telin ucunda ve yastıkları arasında elektrik bağlantısını sağlamak için bir multimetre kullanın. Tel ve paneli arasında direnç < 5 Ω olmalıdır. Ayrıca, multimetre bu dizi kısa gibi hiçbir iletken epoksi birden fazla elektrot pedleri, bağlandığını doğrulamak için kullanın. İletken epoksi birden çok müşteri adayları bağlanırsa, müşteri adaylarını belirlemek için bir katip kullanın.
    2. Epoxied bağlantı bağlantı bir termal, elektrik ve su geçirmez malzeme yalıtım ile kaplama tarafından izole. Ateşe dayanıklı poliüretan reçine kez uygundur.
      1. 15 mL konik santrifüj tüpü (, yaklaşık 2.5 mL işareti) ucu yalıtım malzeme için bir kalıp olarak kaldırın. İki küçük delik içinde belgili tanımlık dip 21 g iğne kullanarak aracılığıyla çıkıntı teller için yapmak.
      2. Ida kalıp ve kalıp dibindeki deliklerden teller takın.
      3. Özel yalıtım malzemesi hazır olun. Elde edilen özel reçine ile sağlanan yönergeleri izleyin.
      4. Böylece gümüş epoksi tamamen yalıtkan kalıp içine pipette (~2.5 mL) kaplı ve üreticisinin teknik özelliklerine kurumasını sağlar.

2. elektrokimyasal reaktör kurulum, test etme ve aşılama

  1. Elektrokimyasal hücre kadar ayarla.
    1. Ida, sayaç elektrot ve referans elektrot elektrokimyasal hücre yerleştirin.
      Not: tüm elektrotlar sığacak sürece kullanılan elektrokimyasal reaktör yaygın olarak değişebilir. Referans elektrot çalışma elektrot olabildiğince yakın olarak reaktör pratik sınırlarını verilmelidir bir noktadır. Burada, çalışma elektrotlar referans elektrot ~ 2-3 cm ile bir tek odası reaktör kullanırız. Ayrıca, sayaç elektrot içinde belgili tanımlık sistem sınırlama değil emin olmak için çalışma elektrot daha büyük olmalıdır.
    2. Eğer saf bir kültürü ile çalışma, reaktör içinde sayaç elektrot ile sterilize. 10 dakika ve 10 dakika süreyle steril deiyonize su içinde 5 için çamaşır suyu daldırma BESİNDE sterilize etmek için çamaşır suyu içinde ıslatarak referans elektrot sterilize 10 için steril deiyonize su tarafından takip s s önce reaktörün içine ekleme.
    3. Elektrokimyasal hücre steril orta biyofilm büyüme için uygun ile doldurun. G. sulfurreducens17,18için temiz su orta fumarat hariç olmak üzere kullanın. MCL biocathode için9 yapay deniz suyu orta kullanın. 9
    4. Elektrotlar bir bipotentiostat bağlayın. Bir Ida elektrot çalışma kurşun 1, çalışma kurşun 2 diğer Ida elektrot, referans müşteri adayıyla referans elektrot ve sayaç elektrot sayaç adayına bağlayın.
  2. Elektrokimyasal Idas test.
    Not: Bu testin ana amacı iki elektrot elektriksel olarak yalıtılmış olduğundan emin hale getirmektir. Tüm elektrokimyasal teknikler bipotentiostat denetlemek için kullanılan yazılım mevcuttur.
    1. Ida düzgün bir bipotentiostat kullanarak emin olmak için kontrol iletkenlik testleri (önce biyofilm büyüme) gerçekleştirin.
      1. Elektroda 1 dk. için açık devre olasılığını ölçüsü.
        Not: bazı aletleri üzerinde açık devre potansiyel galvanostatic koleksiyon programı kullanarak ve mevcut 0 olarak ayarlayarak elde etmeliyim anne.
      2. Açık devre olasılığını ölçüsü 20 mV/s elektrot 1 0,2 V +0.6 V için arasında (SHE) vs üzerinde döngüsel voltammetry getirirken elektrot 2.
        Not: Arzu edilirse diğer sınırları ve tarama oranları CV için kullanılabilir. Ancak, hidrojen veya oksijen üretiminde sonuçlanacaktır potansiyelleri kaçının.
      3. Açık devre potansiyel elektrot 2 ölçülen elektrot 1 potansiyelini potansiyostat yazılımını kullanarak CV sırasında ayna değil doğrulayın.
        Not: Elektrot 2 açık devre potansiyelini değişebilir ama elektrot 1 potansiyelini bağımsız olmalıdır.
      4. 2.2.1.1 2.2.1.3 aracılığıyla denetim dışında elektrot 2 ve elektrot 1 açık devre olasılığını ölçüsü potansiyelini tamamlayana.
    2. Çalışma elektrot potansiyeli bipotentiostat yazılımını kullanarak ilgili electroactive biyofilm istenilen büyüme potansiyelini ayarlayın. Örneğin, 0,5 V (SHE) vs Geobacter sulfurreducens veya +0.31 V biocathode MCL için (o) vs için kullanın.
  3. İlgili electroactive biyofilm büyümek
    1. Bir hisse senedi kültür/zenginleştirme standart aseptik mikrobiyolojik yöntemlerle istenilen mamüllerinin etkin mikroorganizmaların gelen elektrokimyasal reaktör aşılamak. 1: 20'si standart testler için aşılamak oranı (inoculum reaktör birim için) bir OD600 = 0.5 kültür.
    2. Karıştırma istenen seviyeye (~ 200 devir/dakika) ve kuluçka makinesi reaktöre set / su banyosu istenilen sıcaklığa faiz biyofilm büyüme koşula dayanarak. G. sulfurreducensiçin 30 ° C en uygun büyüme için kullanın.
    3. Biyofilm köprü iki elektrot ayıran boşluğu kadar ilgi microorganism(s) belirli gereksinimleri temel alarak sistem kuluçkaya. Sabit G. sulfurreducens biyofilm, ~ 7-10 gün kuluçkaya. MCL biocathode için ~ 7 gün kuluçkaya. Her durumda da sıcaklığı 30 ° C'de kontrol

3. elektrokimyasal gating deneyler

  1. Perdeleme ölçümler için mevcut potansiyel bağımlılığı belirlemek için kullanılan deneysel parametreleri seçin.
    1. Ida kapısı potansiyel (EG) eğrisi sistemi için karşı yürütülen akım (ıSD) elde etmek için uygulanan kapısı potansiyelleri aralığını belirlemek.
      Not: Muayene kapısı potansiyelleri aralığını tüm potansiyelleri mümkün redoks aktivitesiyle kapsamalıdır. Faiz sistemi hakkında hiçbir bilgi varsa, geniş potansiyel bir Aralık +0.6 V o vs. için kullanılan (-0.55) olmalıdır. Bir deneme yanılma yaklaşım altında eğitim sistemine göre aralığı ince ayar yapmak için kullanılabilir. Kapı potansiyel olarak tanımlanır:
      Equation 1
      Burada ED drenaj elektrot potansiyeli ve ES Kaynak elektrot potansiyelidir. Kapı potansiyelleri kullanılan çeşitli ilgi belirli sisteminin sınırlamaları ve gereksinimleri tarafından sınırlanır. 18
      Not: Bu işlemler biyofilm zarar verebilir gibi oksijen ve hidrojen evrime neden olur kaynak ve drenaj potansiyelleri kaçınılmalıdır.
    2. İtici güç kaynak film drenaj ile elektron taşıma için kullanılacak olan kaynak tüketen voltaj (VSD) belirlemek. Kaynak tüketen gerilim olarak tanımlanır:
      Equation 2
      Not: BenSD VSDile doğrusal olarak ölçeklendirir böylece kaynak tüketen gerilim yeterince küçük olmalıdır. 17
    3. Hangi EG doğrusal olarak benSD bağımsızdır, böylece sistem kararlı duruma her gate potansiyel için olmak yaklaşık zamanla değişti bir tarama hızı (v) seçin.
      Not: Tarama hızı az 0.002 V/s kez biyolojik sistemleri için kullanılır. 29 , 30
    4. Perdeleme ölçümleri gerçekleştirmek için bipotentiostat yazılımı kurar (Yani kapıyı potansiyel süpürme) seçili aralığında seçili kaynak tüketen gerilim ve yukarıdaki önemli noktalara göre istenen tarama hızı.
      Not: G. sulfurreducens,17,19 EG kullanarak önceki gating ölçüleri için 0,6 V (o), vs için-0.55 V = VSD = 0,01 V veya 0,1 V, v = 0,001 V/s. Biocathode MCL, EG için 0.7 V (o), vs için 0,25 V = VSD = 0,002 V, v = 0,0002 V/s.
      1. Ayrıca, bir temel ölçüm VSD ile gerçekleştirmek 0.000 V (yani, aynı anda alınan her bireysel elektrot, CV) = adım 3.1.3 seçilen aynı v.
    5. Perdeleme ölçümleri (olmadan çözünür elektron donör veya alıcısı) ciro koşul ve koşullar altında her iki ciro (çözünür elektron donör veya alıcısı mevcut ile) 3.1.4 kullanarak gerçekleştirin.
      Not: ölçüler oksidasyon veya azaltma için hücre metabolizması, çözünen bileşikler tarafından gizlenmiş değil çünkü benzer sonuçlar ne olursa olsun durumu sonra kullanıldığı alınmalıdır ciro koşulları avantajlı olmakla birlikte arka plan akımları (3.1.8 içinde ayrıntılı) çıkarılarak.
      1. Ciro koşullar aynı reaktör orta kullanılan elektrot bakteriyel büyüme için kullanarak elde. Bu orta asetat, G. sulfurreducens,17 veya alıcısı, Biocathode MCL için oksijen gibi için gibi bir çözünür elektron verici içerir.
      2. Cirosu olmayan koşullar çözünür elektron donör veya alıcısı dışında elektrot, bakteriyel büyüme için kullanılan aynı reaktör orta yaparak elde etmek. Potansiyostat kapalıdır olduktan sonra orta aseptik kaldırın ve anodik sistemleri için elektron verici veya katodik sistemler alıcısı olmadan taze ortamda ekleyin. Alternatif olarak, yavaş yavaş nonturnover koşulları için istenen orta orta yerine sürekli akış sistemi ayarlanabilir.
        Not: sistem ~ % 15 CO2 ve %85 N2 (veya orta doğru pH koruyacak bir gaz karışımı) karışımı ile oksijen çözünür elektron alıcısı (gelince biocathode MCL) ise, sparge.
    6. Perdeleme ölçümler tamamlandıktan sonra potansiyostat yazılım elektroda potansiyel büyüme için potansiyel (2.2.2 olduğu gibi aynı değerleri kullanarak) yeniden dengelemek sistemin izin vermek için ayarlamak için kullanın.
    7. Yukarıda açıklanan tüm koşullar sağlanırsa (ıSD v. bağımsızdır ve VSDile doğrusal olarak ölçeklenir), dönüştürmek benSD değerleri aşağıdaki denklemler yukarıda açıklanan31 kullanarak iletkenlik
      Equation 3
      Equation 4
    8. G gürültülerinden ve S nerede sistem bağımlı ve değişkenleri elektrot boyutu, boşluk boyutu ve biyofilm yüksekliği gibi faktörler ölçekleme bir faktördür. Bazı sistemlerde, önceden belirlenmiş denklemler S belirlenebilir. 31 alternatif olarak, S sayısal olarak bir modelleme yazılımı detaylı olarak daha önce kullanılarak hesaplanabilir. 17
    9. Şekli ve büyüklüğü yapılan geçerli tanımlamak için arka plan akımları çıkarma. Ya VSD oluşturulan geçerli çıkarma 0,00 V VSD oluşturulan akımdan = 0,01 V = veya VSD ile oluşturulan drenaj geçerli geçerli kaynak çıkarma bırakarak iki yöntemi kaldırır arka plan akımları V. 0,01 = Sadece yürütülen mevcut.
  2. Sıcaklık bağımlı elektrokimyasal gating ölçümleri
    1. Sıcaklıklar ilgi aralığını belirlemek. Bu Aralık altında eğitim, ancak fizyolojik ilgili sıcaklıklarda kullanılması gereken sistem son derece bağlıdır.
      Not: Önceki çalışmalarda 10 ° C ile 30 ° C arasında bir sıcaklık aralığı elektron taşıma mesophilic mikroorganizmalar için fizyolojik ilgili koşullar altında çalışmaya kullandık. 17
    2. Bir dolaşım su banyosu veya Reaktör sıcaklığı ve ayar noktası ve orta gerçek sıcaklık aynı olduğundan emin olmak için denetim reaktör düzenleyen kuluçka makinesi almak.
      1. Bir termometre veya ısıl bir denetim reaktörde BESİNDE nerede olacağını yerleştirin.
    3. BenSD ölçümleri (bkz: 3.1.4) üzerinden yapmak ciro altında seçili sıcaklık ve nonturnover (3.1.5. adımda açıklanan) aşağıda açıklanan iki yordamdan birini takip bipotentiostat kullanarak koşulları.
      1. Oluşturmak benSD EG eğrileri (bkz. yukarıda 3.1), açıklandığı gibi her sıcaklık sıcaklık aralığında ilgi için. Gibi G. sulfurreducens ve Biocathode MCL, her sıcaklık maksimum akım kullanılır belirlemek için benSD T bağımlılığı malzemeler için bu redoks iletkenlik, sergi.
        Not: Bu yöntem benSD EG vs için her sıcaklık eğrisi, ancak ikinci seçenek daha fazla zaman gerektirir tam oluşturmak için kullanılır.
      2. Alternatif olarak, ayarlayın ve yürütülen maksimum verim Ida potansiyel kapısında bipotentiostat kullanarak geçerli tutun (ben--danSD elde vs EG eğrisi, adım 3.1.4) ve kaydı sırasında bipotentiostat kullanarak en fazla yapılan geçerli kayıt sıcaklık sıcaklık su banyosu veya inkübatör onboard denetimleri kullanarak seçili aralığı arasında tekrar ediyor.
        Not: burada, kullanılan elektrot/reaktör geometri ile benSD ve T için en az 20 dk ve ortalama istikrarlı benSD stabilize etmek için izin verilir her sıcaklık için kullanılır. Az ya da sabitleme zaman belirli sistemine göre gerekli olabilir. Bu yöntem ilk daha hızlı ve daha az stres biyofilm için neden olur. Ancak, tam gating eğrileri oluşturulmaz.
      3. Sıcaklık bir set noktasından diğerine geçiş yapmak ve geri tekrar onboard denetimleri kullanarak inkübatöre veya sıcaklık sağlamak için tepki reversibility belirlemek için su banyosu Bisiklete binme biyofilm zarar vermez.
    4. Sıcaklık inkübatöre veya su banyosu onboard denetimleri kullanarak normal büyüme sıcaklığı geri sıfırlamak ve stabilize sistemin izin verin.
      Not: bir redoks iletken için benSD 1/T veri karşı harekete geçirmek enerji hesaplanması aşağıdaki gibi sağlar Arrhenius oranı ifade ile uygun olabilir:
      Equation 5
      Equation 6
      Ebir bitişik redoks kofaktör ve k arasındaki Elektron transferi için etkinleştirme enerji Boltzmann sabiti orada.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Idas kablolu, yalıtımlı ve iki elektrot birbirinden (Şekil 1) elektriksel olarak yalıtılmış emin olmak için test edilmiştir. Reaktörler, G. sulfurreducensile aşılanmış, monte ve bir biyofilm elektrot arasındaki boşluğu köprü kadar inkübe. G. sulfurreducens biyofilm dizi kapsayan için görsel olarak görülebilir. Diğer biyofilmler iki elektrot elektrikle bağlı olmadığını görmek için bir elektrokimyasal gating ölçümleri yapmak araştırmacı gerektirebilir. Mikroskobu, dizi elektrot arasındaki bağlantıyı doğrulamak için de kullanılmalıdır. BenSD bağımlılığının EG (Şekil 2) belirlemek için elektrokimyasal gating deneyler yapılmıştır. İletkenlik yaşam filmin ardından gating deneylerde ölçülen yürütülen mevcut kullanılarak hesaplanır. Hassasiyet ve doğruluk bu ölçümlerin yüksek nedeniyle yüksek sinyal gürültü oranı Ida yapılandırma ile mümkün. T ıSD sıcaklık bağımlılığını da bir etkinleştirme enerji için elektron taşıma biyofilm (Şekil 2) ile birlikte tespit edilmiştir. Burada elde edilen sonuçlar daha önce17,18 gözlenen benzer ve G. sulfurreducens ve biocathode MCL biyofilmler benzer şekilde davranır redoks iletkenler elektron nerede hipotezini destek biyofilm redoks Kofaktörler yakın bir mesafede arasında atlamalı tarafından transfer.

Figure 1
Şekil 1: Ida kurmak ve elektrokimyasal testleri kontrol. (A) kablolu ve yalıtılmış bir Ida. İç metin: interdigitated elektrotlar ve büyük elektrot pedleri biri gösterilen dizi görüntülü genişlemiş. Ayrı sayaç ve referans elektrotlar ile birlikte deneyler gerçekleştirmek için Ida elektrokimyasal hücre içine yerleştirilir. (B) elektrokimyasal kontrol testleri elektroda elektrik bağımsızlığı sergilenmesi. Elektrot 2 açık devre potansiyelini elektrot 1 değişen potansiyeline CV, elektrotlar değil kısa devre ve ölçümler çoğunluğuna biyofilm için kullanılabilir olduğunu gösteren sırasında yanıt vermiyor. (C) elektrot 2 potansiyeli sırasında elektrotlar kısa devre ve ölçümler geçişi için kullanılmaması gerektiğini belirten CV elektrot 1, vardiya dışında B, aynı. Bu Ida daha fazla deneylerde kullanılan değildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: elektrokimyasal deneyler geçişi. (A) ölçümleri bir yaşam çoğunluğuna elektrokimyasal, G. sulfurreducens biyofilm elektrot büyüdü. En üst nokta şeklinde benSD-EG eğrisi tutarsız, çok adımlı elektron taşıma biyofilm aracılığıyla göstergesidir. Geçerli (ve 2 bölme) drenaj kaynaktan çıkararak yapılan geçerli eğrisi elde edildi arka plan akımları ortadan kaldırmak için her kapı potansiyel elde. VSD ile alınan ham geçerli veri örnekleri için = 0 ve VSD = 0,01 V, okuyucu önceki çalışma için destekleyici bilgi denir. 18 (B) sıcaklık sıcaklık arttıkça bir artış içinde iletkenlik sergileyen bir fizyolojik ilgili Aralık measurementsover geçişi bağımlı, redoks iletkenler için bir özellik görülmektedir. 4 (C) dönüşümü benSD -T veri ve Arrhenius denklem Sığdır. Arrhenius denklem doğrusal Sığdır bir çok adım Elektron transferi süreci göstergesidir. Elektron taşıma G. sulfurreducens biyofilm aracılığıyla etkinleştirme enerji ~0.01 olmak eğrinin eğimini hesaplanır redoks merkezi bitişik carasında elektron taşıma ile tutarlıdır eV-yazın cytochromes. 32 , 33 , 34 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ida kurulumu sırasında bu değiştirmek benSD EG eğrisi ve hatalı sonuçlar ve yorumlara neden olabilir gibi kaynak ve drenaj birlikte elektrokimyasal gating ölçümleri önce kısa devre değil olduğunu test etmek için önemlidir. Öyle ki doğrusal olarak VSD bağımlı ve bağımsız olarak v geçerli VSD ve v seçmek için önemlidir. Yoksa, yukarıda açıklanan denklemler iletkenlik hesaplamak için kullanılan olamaz.

En az iki arka plan akımları olarak kabul ve yürütülen geçerli ölçümler kaldırılması gerekir. Kapı potansiyel süpürüldü olarak arka plan geçerli Faradaic şarj/deşarj nedeniyle, redoks Kofaktörler ilkidir. Bu arka plan geçerli büyük ölçüde elektriksel olarak erişilebilir Kofaktörler elektrot yüzeyine bağlı redoks miktarını etkiler. İkinci bir arka plan geçerli çift katmanlı kapasite olduğunu. Üçüncü bir arka plan geçerli metabolik elektron alıcısı/bağış hücreleri tarafından ciro kaynaklanmaktadır. Bu arka plan geçerli yalnızca ciro koşullar altında geçerlidir. Bu çalışma arka plan akımlar ortadan VSD elde edilen drenaj akımdan geçerli kaynak çıkararak 0,01 V =. Bu yöntem arka plan akımları her iki elektrot eşit ve kaynak tüketen akımları büyüklüğü hem elektrotlar, ama tersi işareti arasında eşit olduğu varsayılır. Bu durumda kaynak ve drenaj akımları çıkarılarak yapılan geçerli duble büyüklüğü arasında verimleri ve ikiye bölünmüş olmalıdır. Bu varsayım sadece sistemi bağımlı olan bir küçük VSD, sınırı içinde gerçek tutar unutulmamalıdır ( G. sulfurreducens, VSDiçin < 0,05 V). Daha büyük VSD değerler kez elektroda farklı koşullara sonuçlanır ve bu yöntemi, arka plan çıkarma kullanılmasını engeller. Alternatif olarak, arka plan akımları kaynak çıkarılarak temizlenebilir ve akımlar VSD elde edilen drenaj 0.0 V VSD elde edilen bu = 0,01 V =. Bu yöntem elektroda temel akımları da aynı olduğunu kabul etmez.

Burada açıklanan teknik esnektir. Çoğu iletişim kuralında tanımlanan parametreleri altında eğitim sistemine bağlı ve değiştirilebilir. Örneğin, malzeme ve Ida boyutları farklı olabilir için sıcaklık aralığı ve diğer parametreler arasında geçit potansiyelleri dizi belirli çalışma gereksinimlerini karşılamak için değiştirilebilir. Ayrıca, standart mikrobiyolojik ve elektrokimyasal teknikler uyarlanmış ve kullanılan, yapım bu protokolü çalışma alanlarında çeşitli araştırmacılar için uygundur.

Burada elektron taşıma yaşayan, elektrot, yetiştirilen electroactive biyofilmler Idas kullanarak eğitim için bir protokol anlatmıştık. Idas ince film iletken polimerler elektron taşıma karakterize etmek için daha önce kullanılmış ve çeşitli standart elektrot malzemeler ve photolithographic teknikleri kullanarak fabrikasyon. 2 Idas birincil avantajı olduğunu alternatif kaynak ayıran i) uzun serpantin boşluğu nedeniyle oran gürültü ve elektrot bantları ve gap boyuta göre II) nispeten küçük Toplam elektrot yüzey alanı boşaltmak için yüksek sinyal. Elektrot geometri elektrot ve boşluk boyutları sinyal gürültü oranı üzerinde büyük bir etkiye sahip çünkü ölçümler çoğunluğuna dikkate almak önemlidir ve bu nedenle yapılan iletkenlik ölçüm doğruluğunu. 18

Elektrokimyasal deneyler yaşayan, elektrot-yetiştirilen G. sulfurreducens biyofilmler sergisinin çoğunluğuna açık bir tepe ben bağımlılığıSD EG, elektron biyofilm aracılığıyla taşınır düşündüren şeklinde tutarsız, çok adımlı, atlamalı redoks iletken polimerler olduğu gibi. 4 , 35 G. sulfurreducens biyofilm en yüksek iletkenlik ~ 4 µS/cm, benzer koşullar altında oluşturulan önceki sonuçları ile anlaşma bulundu. 17 en yüksek iletkenlik potansiyel orta noktasına benzer olduğu için daha fazla, kapıyı potansiyel G. sulfurreducens biyofilmler için ciro CV.17 sırasında bu aynı zamanda daha önce gözlenmiştir ve aynı kastetmiş olmasını öne gözlenen hücreler tarafından asetat metabolizma sonuçlanan elektron taşınmasında kullanılan elektron taşıyıcıları aracılığıyla biyofilm drenaj elektrot için kaynak elektrot üzerinden ücretsiz taşıma için de kullanılır. BenSD diğer bağımlılıklara EG, gibi farklı malzemeler gözlemledim ve Elektron transferi farklı bir mekanizma öneririz. Örneğin, benSD polimer poly(methylthiophene) EG eğrisini vs s şeklinde bir eğri gösterir ve metalik gibi elektron iletim öneriyor. 36 , 37

Yürütülen bu mevcut sıcaklığı bağımlılığı iletken malzemeler ile elektron taşıma mekanizması belirlemede kritik bir parametredir. Yakın zamana kadar sadece eski-situ örnekleri bir biyofilm aracılığıyla yapılan geçerli sıcaklık bağımlılığının araştırmak için kullanılmaya başlanmış. 22 son sonuçları burada ve başka yerlerde17 sunulan farklı bir elde benSD -gating ölçüler kullanarak T bağımlılık ve bu nedenle elektron taşıma G. aracılığıyla bir çok adım, tutarsız atlamalı mekanizması tahmin sulfurreducens daha önce önerilen bir mekanizma farklı biyofilmler. 22

Önemli Bu teknik ve diğer benzer geometrileri elektron taşıma yoluyla bir mikrobiyal biyofilm değerlendirirken şarj yanal düz bir yüzeye aynı düzlemde yer kaynak ve drenaj elektrotlar arasında hamle kısıtlamasıdır. Elektron biyofilm yoluyla doğal akışını ancak, elektrot yüzeyine dik. Bu tekniği ve modeli kullanarak, biz biyofilm homojen bir film olarak yaklaşık ve biyofilm yalnızca bir bölümünü ile elektron akışı sorguya. Biyofilm kayma heterojen deneysel doğrulanmasını yine bu tekniği daha da doğrulamak gereklidir. Ancak, yukarıda açıklandığı gibi bu yöntem en yüksek sinyal gürültü oranı bugüne kadar mevcut ile yerinde ölçümler sağlar. Bu teknik yetkili eğitim için kullanılan taşıma yapabiliyor herhangi bir malzemenin bir elektrot ile etkileşim.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

M.D.Y, S.M.G-s ve L.M.T. Office deniz araştırma (Ödülü #N0001415WX01038 ve N0001415WX00195), deniz araştırma laboratuvarı ve deniz araştırma laboratuvarı Nanobilimler Enstitüsü kabul; M.Y.E.-N. ABD bölümü, enerji Grant DE-FG02-13ER16415 tarafından desteklenir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IDAs CH Instruments 012125 Manufactured by ALS-Japan; sold by CH Instruments
Wire Digikey W7-ND
Conductive silver epoxy Electron microscopy sciences 12670-EE
Insulating material 3M 2131-B Scotchast flame retardant compound
15 mL conical centrifuge tube VWR 89004-368
21g needle VWR BD-305165
5 mL pipette tips VWR 82018-842
5 mL pipettor VWR 89079-976
Freshwater medium components Sigma Aldrich All standard laboratory chemicals
    Ammonium chloride
    Sodium phosphate monobasic
    Sodium bicarbonate
Artificial seawater medium components Sigma Aldrich All standard laboratory chemicals
    Sodium chloride
    Magnesium chloride hexahydrate
    Magnesium sulfate heptahydrate
    Potassium chloride
    Sodium bicarbonate
    Calcium chloride dihydrate
    Ammonium chloride
    Potassium phosphate dibasic
Ag/AgCl reference electrode Basi MF-2079
Graphite rod counter electrode Electron microscopy sciences 70230
Recirculating water bath Thermo Scientific 152-5256
Bipotentiostat Pine Instruments WD-20 http://www.voltammetry.net/pine/aftermath/user
Stir bars VWR 58947-114
G. sulfurreducens culture ATCC 51573
Jacketed reactor Pine Instruments RRPG085

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boyd, D. A., et al. Biofilms in Bioelectrochemical Systems. , John Wiley & Sons, Inc. 177-210 (2015).
  2. Natan, M. J., Wrighton, M. S. Chemically modified microelectrode arrays. Prog Inorg Chem. 7, 391-494 (1990).
  3. Paul, E. W., Ricco, A. J., Wrighton, M. S. Resistance of polyaniline films as a function of electrochemical potential and the fabrication of polyaniline-based microelectronic devices. J Phys Chem-US. 89, 1441-1447 (1985).
  4. Dalton, E. F., et al. Charge transport in electroactive polymers consisting of fixed molecular redox sites. Chem Phys. 141, 143-157 (1990).
  5. Chidsey, C. E. D., Murray, R. W. Electroactive Polymers and Macromolecular Electronics. Science. 231, 25-31 (1986).
  6. Chidsey, C. E. D., Murray, R. W. Redox capacity and direct current electron conductivity in electroactive materials. J Phys Chem-US. 90, 1479-1484 (1986).
  7. Gregoire, K. P., Glaven, S. M., Hervey, J., Lin, B., Tender, L. M. Enrichment of a High-Current Density Denitrifying Microbial Biocathode. J Electrochem Soc. 161, H3049-H3057 (2014).
  8. Siegert, M., Yates, M. D., Spormann, A. M., Logan, B. E. Methanobacterium dominates biocathodic Archaeal communities in methanogenic microbial electrolysis cells. ACS Sus Chem Eng. 3, 1668-1676 (2015).
  9. Wang, Z., et al. A previously uncharacterized, nonphotosynthetic member of the Chromatiaceae is the primary CO2-fixing constituent in a self-regenerating biocathode. Appl Environ Microbiol. 81, 699-712 (2015).
  10. Marshall, C. W., Ross, D. E., Fichot, E. B., Norman, R. S., May, H. D. Long-term Operation of Microbial Electrosynthesis Systems Improves Acetate Production by Autotrophic Microbiomes. Environ Sci Technol. 47, 6023-6029 (2013).
  11. Strik, D. P. B. T. B., Picot, M., Buisman, C. J. N., Barrière, F. pH and Temperature Determine Performance of Oxygen Reducing Biocathodes. Electroanalysis. 25, 652-655 (2013).
  12. Strycharz, S. M., et al. Reductive dechlorination of 2-chlorophenol by Anaeromyxobacter dehalogenans with an electrode serving as the electron donor. Environ Microbiol Report. 2, 289-294 (2010).
  13. Yates, M. D., et al. Microbial Electrochemical Energy Storage and Recovery in a Combined Electrotrophic and Electrogenic Biofilm. Environ Sci Technol Lett. 4, 374-379 (2017).
  14. Tender, L. M., et al. Harnessing microbially generated power on the seafloor. Nature Biotechnology. 20, 821-825 (2002).
  15. Yates, M. D., Siegert, M., Logan, B. E. Hydrogen evolution catalyzed by viable and non-viable cells on biocathodes. Int J Hydrogen Energ. 39, 16841-16851 (2014).
  16. Fokina, O., Eipper, J., Winandy, L., Kerzenmacher, S., Fischer, R. Improving the performance of a biofuel cell cathode with laccase-containing culture supernatant from Pycnoporus sanguineus. Bioresource Technol. 175, 445-453 (2015).
  17. Yates, M. D., et al. Thermally activated long range electron transport in living biofilms. Phys Chem Chem Phys. 17, 32564-32570 (2015).
  18. Yates, M. D., et al. Measuring conductivity of living Geobacter sulfurreducens biofilms. Nat Nano. 11, 910-913 (2016).
  19. Snider, R. M., Strycharz-Glaven, S. M., Tsoi, S. D., Erickson, J. S., Tender, L. M. Long-range electron transport in Geobacter sulfurreducens biofilms is redox gradient-driven. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 15467-15472 (2012).
  20. Strycharz-Glaven, S. M., Snider, R. M., Guiseppi-Elie, A., Tender, L. M. On the electrical conductivity of microbial nanowires and biofilms. Energ Environ Sci. 4, 4366-4379 (2011).
  21. Malvankar, N. S., Tuominen, M. T., Lovley, D. R. Comment on "On electrical conductivity of microbial nanowires and biofilms" by S. M. Strycharz-Glaven, R. M. Snider, A. Guiseppi-Elie and L. M. Tender, Energy Environ. Sci., 2011, 4, 4366. Energy Environ. Sci. 5, 6247-6249 (2012).
  22. Malvankar, N. S., et al. Tunable metallic-like conductivity in microbial nanowire networks. Nat Nanotechnol. 6, 573-579 (2011).
  23. Strycharz-Glaven, S. M., Tender, L. M. Reply to the 'Comment on "On electrical conductivity of microbial nanowires and biofilms"' by N. S. Malvankar, M. T. Tuominen and D. R. Lovley, Energy Environ. Sci., 2012, 5. Energy Environ. Sci. 5, 6250-6255 (2012).
  24. Strycharz-Glaven, S. M., et al. Electron Transport through Early Exponential-Phase Anode-Grown Geobacter sulfurreducens Biofilms. Chem Electro Chem. 1, 1957-1965 (2014).
  25. Chidsey, C. E., Feldman, B. J., Lundgren, C., Murray, R. W. Micrometer-spaced platinum interdigitated array electrode: fabrication, theory, and initial use. Anal Chem. 58, 601-607 (1986).
  26. Li, C., Lesnik, K. L., Fan, Y., Liu, H. Redox Conductivity of Current-Producing Mixed Species Biofilms. PLOS ONE. 11, e0155247 (2016).
  27. Malvankar, N. S., et al. Tunable metallic-like conductivity in microbial nanowire networks. Nat Nano. 6, 573-579 (2011).
  28. Ing, N. L., Nusca, T. D., Hochbaum, A. I. Geobacter sulfurreducens pili support ohmic electronic conduction in aqueous solution. Phys Chem Chem Phys. 19, 21791-21799 (2017).
  29. Fricke, K., Harnisch, F., Schröder, U. On the use of cyclic voltammetry for the study of anodic electron transfer in microbial fuel cells. Energ Environ Sci. 1, 144-147 (2008).
  30. Marsili, E., Rollefson, J. B., Baron, D. B., Hozalski, R. M., Bond, D. R. Microbial biofilm voltammetry: direct electrochemical characterization of catalytic electrode-attached biofilms. Appl Environ Microbiol. 74, 7329-7337 (2008).
  31. Kankare, J., Kupila, E. -L. In-situ conductance measurement during electropolymerization. J Electroanal Chem. 322, 167-181 (1992).
  32. Byun, H. S., Pirbadian, S., Nakano, A., Shi, L., El-Naggar, M. Y. Kinetic Monte Carlo Simulations and Molecular Conductance Measurements of the Bacterial Decaheme Cytochrome MtrF. Chem Electro Chem. 1, 1932-1939 (2014).
  33. El Kasmi, A., Wallace, J. M., Bowden, E. F., Binet, S. M., Linderman, R. J. Controlling interfacial electron-transfer kinetics of cytochrome c with mixed self-assembled monolayers. J Am Chem Soc. 120, 225-226 (1998).
  34. Bortolotti, C. A., et al. The Reorganization Energy in Cytochrome c is Controlled by the Accessibility of the Heme to the Solvent. J Phys Chem Lett. 2, 1761-1765 (2011).
  35. Gallaway, J. W., Calabrese Barton, S. A. Kinetics of Redox Polymer-Mediated Enzyme Electrodes. J Am Chem Soc. 130, 8527-8536 (2008).
  36. Thackeray, J. W., White, H. S., Wrighton, M. S. Poly(3-methylthiophene)-coated electrodes: optical and electrical properties as a function of redox potential and amplification of electrical and chemical signals using poly(3-methylthiophene)-based microelectrochemical transistors. J Phys Chem-US. 89, 5133-5140 (1985).
  37. Jugnet, Y., Tourillon, G., Duc, T. M. Evidence of Intrinsic Extended π-Bonding Band and Metalliclike Behavior in Undoped and Doped Electropolymerized Poly (3-methylthiophene) Films. Phys Rev Lett. 56, 1862-1865 (1986).

Tags

Kimya sayı: 136 mikrobiyal elektrokimya mikrobiyal Electrosynthesis biyofilm iletkenlik hücre dışı elektron taşıma İnce Film elektrokimyasal geçişi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yates, M., Strycharz-Glaven, S.,… More

Yates, M., Strycharz-Glaven, S., Golden, J., Roy, J., Tsoi, S., Erickson, J., El-Naggar, M., Calabrese Barton, S., Tender, L. Characterizing Electron Transport through Living Biofilms. J. Vis. Exp. (136), e54671, doi:10.3791/54671 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter