Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Характеризуя переноса электронов через биоплёнки жизни

Published: June 1, 2018 doi: 10.3791/54671
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2, 3, 1, 4, 5, 1
1Center for Bio/Molecular Science and Engineering, Naval Research Laboratory, 2George Mason University, 3Chemistry Division, Naval Research Laboratory, 4Departments of Physics, Biological Sciences, and Chemistry, University of Southern California, 5Department of Chemical Engineering and Materials Science, Michigan State University

Summary

Протокол для измерения электропроводности живых микробной биоплёнки физиологически соответствующих условиях представлена.

Abstract

Здесь мы продемонстрировать методом электрохимического стробирования используется для характеристики электрической проводимости электрод выросли микробной биоплёнки физиологически соответствующих условиях. 1 эти измерения выполняются на живых биопленки в водной среде с помощью источника и слейте электродов на поверхности стекла в специализированные конфигурации, упоминаемый как массив штыревой электрода (Ида). Биопленки выращивается, простирается через разрыв, соединяющий источник и сток. Потенциалы применяются к электродам (ES иDE) создание источника стока тока (ISD) через биопленки между электродами. Зависимость электропроводности на ворота потенциал (в среднем источник и сток потенциалов, EG = [ED + ES] / 2) определяется систематически изменяя потенциал ворота и измерения полученный источник сток текущий. Зависимость проводимости на ворота потенциал обеспечивает механистический сведения о процессе внеклеточного переноса электронов, лежащие в основе электропроводности конкретных биопленки под следствием. Электрохимическим шлюзовые метод измерения, описанный здесь, основан прямо на используемой M. S. Wrighton2,3 и коллег и р. у. Мюррей4,5,6 и коллег в 1980's в том, чтобы расследовать тонкопленочных проводящих полимеров.

Introduction

Внеклеточные переноса электронов (EET) является процессом, который позволяет некоторых микроорганизмов для транспорта электронов между внутриклеточного метаболизма и нерастворимых электрона акцепторов или доноров, которые проживают за пределами ячейки, начиная от природных минералов электроды. В некоторых случаях EET позволяет микроорганизмов сформировать электропроводных многоячеечного толстые биопленки на поверхности электрода, в которых клетки не в прямом контакте с электродом все еще можете использовать его как метаболические электрон акцептора или доноров. Существует значительный интерес к таким биоплёнки электрода катализаторов для различных приложений, таких как микробной электросинтеза, загрязнения зондирования/удаления и удаленного энергии генерации и хранения,7,8,9 ,10,11,12,,1314 ввиду разнообразия метаболических процессов, выполняемых микроорганизмов и долговечность микробной биоплёнки по сравнению в основе фермента bioelectrodes. 15 , 16 Кроме того, пути EET потенциально могут быть использованы для электрически управления или сигнал изменения в естественных или генетически микробной метаболические процессы, участвует, например, в производстве желаемого продукта или обнаружения Целевой исследуемое вещество или стимул. Электрическая проводимость электрокаталитическая биопленки, которая отличает их от других биологических материалов, является центральным аспектом их свойств электрокаталитические, но мало понято о базовой EET процесса в среде электрода, и то, что известно весьма спорным. 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24

Описанные здесь является 2-электродный метод для измерения проводимости через живой, электрод выросли биопленки, используя массивы штыревой электрода (МДО). МДО состоят из параллельных прямоугольных электродов, узорные на плоской стеклянной поверхности, таким образом, что каждый другой группы подключен на противоположных сторонах результирующего массива в 2 электроды (источник и сток). Тщательное изучение Ида (см. Например, рисунок 6.12b ref #1) показывает, что пробелы, разделения смежные полосы являются также связаны таким образом, чтобы форма один пробел, который ткет взад и вперед через массив, разделяющей два электрода. Результатом является длинный и узкий разрыв, разделяющий источник и сток электродов, уступая токи очень высокого источника стока, когда проводящего материала сформирована, литые, полимеризуется или растет (в случае тип биопленки, здесь рассматривается) массива. Кроме того небольшой размер электродов приводит к небольшой фона текущего благодаря емкость зарядки и изменить в окисления из электропроводящего материала с изменением в ворота потенциал, поскольку количество материала необходимо сделать проводимости измерения с использованием ИДАС настолько мал. Техника на базе Ида электрохимических стробирования описанных здесь, развитые характеризовать тонкопленочных электропроводящие полимеры,2,3,4,25 лишь недавно был применен для живых систем. 18 другой метод, используемый для измерения проводимости жизни биоплёнки использовали Сплит источник и сток электродов и источник метров установить ворота потенциал большого формата. 26 , 27 однако, обеспокоенность по поводу этих методов были подробно ранее. 18

Инкапсулирует протокол ниже наш опыт с делать измерения проводимости жизни биоплёнки MCL Geobacter sulfurreducens и biocathode. G. sulfurreducens является модель электрода, уменьшение организма могут воспользоваться нерастворимых материалов, включая электроды, как единственная метаболически электрон акцептора. Кроме того он образует густой биопленки, способный перевозить электронов через несколько клеток длины, что делает его организма идеальная модель для изучения анодное междугородной внеклеточного электрона передачи. Мы также включать детали для изучения biocathode MCL, аэробика, автотрофных смешанных сообщества биопленки, изолированы от катода бентических микробных топливных элементов. MCL Biocathode (назван в честь трех основных составляющих – Marinobacter, Chromatiaceaea и Labrenzia) способен окисляющих электрода в качестве своего единственного электрона донора и транспортировки электронов через несколько клеток длины, делая Это интересная система катодной учиться. Кроме того biocathode MCL имеет наивысший сообщил проводимости для живой системы на сегодняшний день с помощью этих методов. Включение этих разнообразных Электроактивные биопленки в этот протокол призван подчеркнуть, что этот метод применим для измерения транспорта электронов через любой жизни биопленки электрически взаимодействовать с электродами.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. штыревой микроэлектродные массив (Ида) подготовка

  1. Получения коммерчески доступных Ида электродов на непроводящих субстрата или синтезировать их с помощью стандартных методов литографии. 28
    Примечание: Размеры Ида и/или материалы могут быть разнообразны основе желаемых условий для различных экспериментов. МДО используется здесь были получены коммерчески и состояла из двух штыревой золото микроэлектродов на стеклянной подложке, подключенных к большой электрода колодки на противоположных концах массива. Электроды, подвергаются в то время как автобус линии, соединяющие электроды с большой контактной колодки покрыты тонким изоляционным материалом. МДО используется здесь состоят из двух наборов полос 10 мкм широкий и 2 мм длиной золото микроэлектродные (источник и сток) интервалом 5 мкм друг от друга рисунком на поверхности плоского стекла. МДО используется здесь было 65 пар электродов (130 всего штыревой полос). Чередование полос связаны с электрода колодки на противоположных концах массива.
  2. Проволока и изолировать Ида
    1. Прикрепите провод к каждой большой электрода колодки с помощью проводящая Серебряная эпоксидной.
      1. Подготовьте Проводящие эпоксидной согласно инструкции производителя для конкретных эпоксидной используется с наконечник для смешивания стержня или пипетки (инструкции могут различаться от производителя).
      2. Поместите провод на каждой золотой пластинкой, безопасное место с помощью ленты лаборатории. Покрытия проволоки и pad с серебряной эпоксидной, используя наконечник для смешивания стержня или пипетки.
      3. Осторожно двигаться до 80 ° C духовку за 1 ч до лечения или лечения на основе рекомендаций изготовителя для конкретных проводящая Серебряная эпоксидной используется.
      4. После эпоксидной лечит, используйте мультиметр для обеспечения электрической связи между накладками и конце провода. Сопротивление между проводом и колодки должны быть < 5 Ω. Кроме того используйте мультиметр для проверки, что не проводящие эпоксидной подключается несколько электрода колодки, как это можно короткие массива. Если Проводящие эпоксидной подключается несколько версий, с помощью палочки для изоляции провода.
    2. Изолируйте epoxied подключение путем покрытия связь с тепловых, электрических и водонепроницаемый изоляционного материала. Часто подходят огнезащитного полиуретановых смол.
      1. Выньте кончик трубки 15 мл конические центрифуги (отметке приблизительно 2,5 мл) как прессформы для изоляционного материала. Сделайте два маленьких отверстия в нижней части для провода к выступать через иглой 21g.
      2. Вставьте Ида в плесени и провода через отверстия в нижней части формы.
      3. Подготовьте конкретные изоляционный материал. Следуйте инструкциям с конкретных смолы получены.
      4. Пипетка изолятора в форму так, что серебро эпоксидной полностью покрыты (~2.5 мл) и дайте высохнуть согласно требованиям производителя спецификации.

2. электрохимических реактора установки, тестирования и прививки

  1. Настройка электрохимической ячейки.
    1. Вставьте в электрохимическом Ида, счетчик электрода и электрод сравнения.
      Примечание: Электрохимический реактор используется может широко варьировать, до тех пор, пока все электродов поместиться внутри. Одно соображение это то, что электрод сравнения должна быть как можно ближе к рабочих электродом практические пределы реактора. Здесь мы используем однокамерные реактора с ссылка электрода ~ 2-3 см от рабочих электродов. Кроме того счетчик электрода должна быть больше, чем рабочих электродом для обеспечения, что это не ограничение в системе.
    2. При работе с чистой культуры, стерилизуйте реактора с электродом счетчика, внутрь. Стерилизовать электрод сравнения путем замачивания в Отбеливатель для 10 мин и стерильные деионизированной воды за 10 мин стерилизовать Ида путем погружения в Отбеливатель для 5 s следуют стерильной обессоленной воды для 10 s перед вставкой в реактор.
    3. Заполните электрохимической ячейки с стерильной средой для роста биопленки. G. sulfurreducens17,18используйте пресной воды среднего, за исключением фумарата. Для biocathode MCL9 использовать искусственный морской среды. 9
    4. Подключите электроды к bipotentiostat. Подключите один Ида электрода к рабочей ведущий 1, другой электрод Ида возглавить рабочую 2, электрод сравнения ссылка свинца и Счетчик электрода к счетчик свинца.
  2. Электрохимический тестирование ИДАС.
    Примечание: Основная цель этого испытания заключается в том, чтобы убедиться, что два Электроды электрически изолированы. Все электрохимические методы доступны в программное обеспечение, используемое для управления bipotentiostat.
    1. Выполните тесты контроля проводимости (до биопленки роста) для обеспечения надлежащего функционирования Ида, с помощью bipotentiostat.
      1. Мера открытой цепи потенциал каждого электрода на 1 мин.
        Примечание: На некоторых инструментах, обрыв потенциальных должна достигаться с помощью программы коллекции гальваностатического и установка текущего 0 мА.
      2. Мера потенциал открытой цепи электрода 2 во время выполнения циклической вольтамперометрии на электрод 1 между 0,2 V до + 0,6-+ V (против она) на 20 м/сек.
        Примечание: Другие границы и сканирования тарифы на CV может использоваться при необходимости. Однако Избегайте потенциалы, которые приведут к генерации водорода и кислорода.
      3. Убедитесь, что обрыв потенциальных измеряется на электрод 2 не зеркало потенциал электрод 1 во время CV, используя программное обеспечение потенцио.
        Примечание: Обрыв потенциал электрод 2 могут изменяться, но она должна быть независимой от потенциала электрода 1.
      4. Повторите шаги 2.2.1.1 через 2.2.1.3 за исключением управления потенциал электрод 2 и меру возможности открытой цепи электрода 1.
    2. Установите потенциальных рабочих электродов для желаемого роста потенциала соответствующих Электроактивные биопленки, с использованием программного обеспечения bipotentiostat. Например используйте + 0,5 V (против она) для Geobacter sulfurreducens или +0.31 V (против она) для biocathode ПДК.
  3. Расти соответствующих Электроактивные биопленки
    1. Прививать электрохимический реактор от запасов культура/обогащения желаемого электрохимически активных микроорганизмов, с использованием стандартных асептических микробиологических методов. Для стандартных тестов, прививать в 1:20 соотношение (посевным материалом к объему реактора) OD600 = 0.5 культуры.
    2. Установите перемешивания в реакторе на желаемый уровень (~ 200 об/мин) и инкубатор / водяной бане до желаемой температуры на основе условий роста биопленки интерес. Для G. sulfurreducensиспользуйте 30 ° C для оптимального роста.
    3. Инкубируйте системы, основанной на конкретных требований microorganism(s) интерес, до тех пор, пока биопленки Мосты разрыв между двумя электродами. Для стационарных биопленки G. sulfurreducens , Проинкубируйте ~ 7-10 дней. Для biocathode MCL Инкубируйте ~ 7 дней. В каждом случае контроль температуры в 30 ° C.

3. электрохимическим шлюзовые эксперименты

  1. Выберите экспериментальные параметры, которые будут использоваться для определения зависимость тока потенциал для стробирования измерений.
    1. Определите диапазон ворота потенциалов, которые будут применяться к Ида для получения проводимых ток (ISD) против ворот потенциальной кривой (EG) для системы.
      Примечание: Спектр ворота потенциалов изучены должна охватывать все потенциалы с возможных окислительно-восстановительной деятельности. Если никакой информации о системе интерес, широкий потенциальный диапазон должен быть используется (-0.55 до + 0,6-+ V против она). Метод проб и ошибок может использоваться для тонкой настройки диапазона, основанные на системе в рамках исследования. Ворота потенциал определяется как:
      Equation 1
      где ED является потенциальная утечка электрода и ES является потенциальным источником электрода. Спектр ворота потенциалов используется ограничивается требования и ограничения системы конкретных интересов. 18
      Примечание: Источник и сток потенциалы, которые приведут к кислорода и водорода эволюции следует избегать, поскольку эти процессы может повредить биопленки.
    2. Определите напряжение источника стока (SDV), который будет использоваться в качестве движущей силы для переноса электронов через фильм из источника в канализацию. Напряжение источника стока определяется как:
      Equation 2
      Примечание: Напряжения источника стока должна быть достаточно небольшой, так что яSD масштабируется линейно с VSD. 17
    3. Выберите скорость сканирования (v), на котором EG линейно изменяется с течением времени, независимо от яSD так, что системы могут быть аппроксимированы в устойчивом состоянии для каждого потенциального ворот.
      Примечание: Скорость сканирования менее 0,002 V/s часто используется для биологических систем. 29 , 30
    4. Настройка программного обеспечения bipotentiostat для выполнения стробирования измерений (т.е. развертки ворота потенциальных) над выбранного диапазона, при напряжении выбранного источника стока и темпами желаемого сканирования, на основе изложенных выше соображений.
      Примечание: для предыдущих стробирования измерений с помощью G. sulfurreducens,17,19 EG = -0.55 V 0,6 V (против она), VSD = 0.01 V или 0,1 V, v = 0,001 V/s. Для Biocathode MCL, EG = 0.25 V до 0,7 V (против она), VSD = 0,002 V, v = 0.0002 V/s.
      1. Кроме того, выполнять базовые измерения с VSD = 0,000 V (т.е., CV на каждый отдельным электроде, принятые одновременно) в том же v, выбранный на шаге 3.1.3.
    5. Выполняют стробирования измерения, с помощью условий в 3.1.4 под оба оборот (с растворимых электрона доноров или акцептора настоящее) и условий-оборота (без растворимых электрона доноров или акцептор).
      Примечание:-Оборот условия выгодно потому, что измерения не закрывались на окисление или сокращение растворимых соединений для клеточного метаболизма, хотя аналогичные результаты должны быть получены независимо от состояния используется после вычитание фона токов (подробно в 3.1.8).
      1. Достичь оборота условий с помощью той же среде реактора используется для роста бактерий на электроде. Это средство содержит водорастворимые электрона доноров, например ацетат G. sulfurreducens,17 или акцептор, такие как кислород для Biocathode MCL.
      2. Достижения-оборот условий, делая же реактор средство используется для роста бактерий на электроде, за исключением опустить растворимых электрона доноров или акцептора. Убедившись, что потенцио выключен, удалите средство асептически и добавить в свежих средних без доноров электронов для анодных систем или акцептора катодная систем. Кроме того можно настроить систему непрерывного потока медленно замените требуемой среды для nonturnover условий среды.
        Примечание: Если кислород растворимых электрон акцептора (что касается biocathode ПДК), sparge системы со смесью2 CO ~ 15% и 85% N2 (или газовой смеси, которая будет поддерживать правильный баланс pH в среде).
    6. После завершения стробирования измерений используйте потенцио программного обеспечения для установки потенциал каждого электрода обратно к росту потенциал, чтобы позволить системе вновь стабилизировать (используя те же значения как 2.2.2).
    7. Если выполнены все условия, описанные выше (яSD является независимым от v и масштабируется линейно с VSD), яSD значения преобразуются проводимости, с помощью следующих уравнений как описано31
      Equation 3
      Equation 4
    8. где G — проводимость и S — коэффициент масштабирования, который зависит от системы и факторы в переменных, таких как размер электрода, разрыв размера и высоты биопленки. Для некоторых систем S может быть определено из заранее уравнений. 31 в качестве альтернативы, S может быть рассчитана численно с помощью моделирования программного обеспечения, как описано ранее. 17
    9. Вычитание фона течений определить форму и масштабы проводимых ток. Либо вычесть ток, приданный VSD = 0.00 V от текущей на VSD = 0.01 V или вычесть сливной текущей из текущего источника с VSD = 0.01 V. либо метод удаляет фон токов, оставляя только проводимых ток.
  2. Зависимые электрохимическим шлюзовые измерения температуры
    1. Определите диапазон температур интерес. Этот диапазон является сильно зависит от системы изучается, однако физиологически соответствующих температур должны быть использованы.
      Примечание: Предыдущие исследования использовали в диапазоне температур от 10 ° C до 30 ° C для изучения электронного транспорта физиологически соответствующих условиях для мезофильных микроорганизмов. 17
    2. Получите рециркуляционный водяной бане или инкубатор регулировать температуру реактора и управления реактор, убедитесь, что набор точек и фактическая температура среды, то же самое.
      1. Поместите термометр или термопара в реакторе управления где бы Ида.
    3. Сделайте яSD измерения (см. 3.1.4) в диапазоне температур выбран под оборот и nonturnover (описано в шаге 3.1.5) условия использования bipotentiostat, после одной из двух процедур, описанных ниже.
      1. Генерировать яSD против EG кривых, как описано выше (см. 3.1), для каждой температуры в диапазоне температур интерес. Для материалов, выставку редокс проводимости, такие как G. sulfurreducens и Biocathode MCL, пиковый ток от каждой температуры используется для определения ISD против T зависимость.
        Примечание: Этот метод используется для генерации полный яSD против EG кривой для каждой температуры, но требует больше времени, чем второй вариант.
      2. Поочередно, установите и удерживайте Ида у ворот потенциальных, обеспечивающий максимальный провели текущего с использованием bipotentiostat (полученные от яSD против EG кривой, шаг 3.1.4) и записать максимальный ток проводится с использованием bipotentiostat во время Температура циклическое между диапазон температур, выбранные с помощью встроенного управления водяной бане или инкубатора.
        Примечание: С электродом/реактор геометрия, используемая здесь я разрешено стабилизации для по крайней мере 20 мин и в среднем стабильные яSD SD и T используется для каждой температуры. Более или менее стабилизации может потребоваться время на основе конкретной системы. Этот метод быстрее, чем первый и вызывает меньше стресса в биопленки. Однако, полная стробирования кривых не создаются.
      3. Цикла температура от одной точки набор к другой и обратно, снова с помощью встроенных элементов управления инкубатора или водяной бане для определения обратимости реакции для обеспечения того, чтобы температура Велоспорт не вредит биопленки.
    4. Восстановить нормальный рост температуры, с использованием бортового управления инкубатора или воды ванны температура и позволяют для стабилизации системы.
      Примечание: Для дирижера редокс, яSD против 1/T данных может поместиться с выражением ставка Аррениус, которая позволяет расчета энергии активации следующим образом:
      Equation 5
      Equation 6
      где E — энергия активации для переноса электрона между смежными редокс кофакторы и k — постоянная Больцмана.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

МДО были проводные, изоляцией и протестированы, чтобы гарантировать, что два электрода были электрически изолированы друг от друга (рис. 1). Реакторы были собраны, привиты с G. sulfurreducensи инкубировали пока биопленки преодолен разрыв между электродами. G. sulfurreducens биопленки визуально видно охватывающих массива. Другие биоплёнки может потребовать исследователь сделать электрохимических стробирования измерения если электрически связаны два электрода. Микроскопия должен также использоваться для проверки соединения между электродами массива. Электрохимическим шлюзовые эксперименты были проведены для определения зависимости яSD на EG (рис. 2). Проводимость жизни фильм затем вычисляется с помощью проводимых ток измеряется в шлюзовой экспериментов. Точность и правильность этих измерений был высоким из-за высокое соотношение сигнал-шум с Ида конфигурации. Зависимость от температуры яSD на T было также установлено вместе с энергии активации переноса электронов через биопленки (рис. 2). Результаты, полученные здесь, аналогичны ранее наблюдали17,18 и поддерживаем гипотезу, что биоплёнки MCL G. sulfurreducens и biocathode ведут себя аналогично редокс проводников где электроны находятся переданные через биопленки скачкообразной между редокс кофакторов близко в близости.

Figure 1
Рисунок 1: Ида настроить и контролировать электрохимических тесты. (A) Ида, что проводной и изоляцией. Вставка: Расширен фотосъемка массива показаны штыревой электродов и один большой электрода колодки. Отдельный счетчик и ссылка электроды помещаются в электрохимическом наряду с IDA для выполнения экспериментов. (B) электрохимический контрольных испытаний экспонируется электрические независимость каждого электрода. Обрыв потенциал электрод 2 не реагировать меняющегося потенциала электрода 1 во время резюме, указав, что электроды не замкнуты и могут быть использованы для биопленки стробирования измерений. (C) так же, как B, за исключением потенциал электрод 2 сдвиг во время CV электрода 1, указав, что электроды замкнуты и не должен использоваться для стробирования измерений. Этот Ида не используется в дальнейших экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: Электрохимический стробирования экспериментов. (A) электрохимических стробирования измерения жизни, электрод вырос G. sulfurreducens биопленки. Пик формы яSD-EG кривая свидетельствует о бессвязные, многоступенчатый переноса электронов через биопленки. Проведение текущего кривой был получен путем вычитания источник из умов текущей (и деления на 2) получены на каждом ворота потенциал для ликвидации фон течений. Для примеров сырья текущих данных, сделанные с VSD = 0 и VSD = 0.01 V, читатель отсылался к информации поддержки предыдущих работ. 18 (B) зависит от стробирования measurementsover физиологически соответствующих диапазона экспонирования увеличение проводимости, увеличением температуры температуры, свойство отмечено для проводников редокс. 4 (C) преобразование яSD – T данных и подогнать уравнение Аррениуса. Линейный fit в уравнение Аррениуса свидетельствует электрона многоэтапного процесса передачи. Энергия активации для переноса электронов через G. sulfurreducens биопленки рассчитывается от наклон кривой, чтобы быть ~0.01 eV, который согласуется с переноса электронов между редокс центров рядом c-тип цитохромов. 32 , 33 , 34 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Во время установки Ида важно проверить, что источник и сток являются не замкнуты вместе до электрохимическим шлюзовые измерений, как это изменит яSD против EG кривой и может привести к ошибочным результатам и толкований. Важно также, чтобы выбратьSD V и v таким образом, что текущий линейно зависит от VSD и независимой от v. Если это не так, тогда уравнения описанных выше не могут быть использованы для расчета теплопроводности.

По крайней мере два фона течений должны рассматриваться и удалены из проведенных текущих измерений. Во-первых, фон текущего благодаря Faradaic зарядки/разрядки из кофакторов редокс как ворота потенциал заметен. Этот фон текущего сильно зависит от количества редокс кофакторов, которые доступны электрически подключен к поверхности электрода. Второй фон текущего является двойной слой емкости. Третий фона текущего объясняется оборот метаболических электрона акцепторов/доноров клеток. Этот фон текущего применяется только в условиях оборот. Фоне течения в этом исследовании были устранены путем вычитания источник ток от ток стока, полученные на VSD = 0.01 V. Этот метод предполагает, что фон течения равны в обоих электродов и источника стока токи равны по величине на обоих электродов, но противоположными по знаку. В этом случае вычитания источник и сток токи дает проводится текущий double в масштабах и должны быть разделены на два. Следует отметить, что это предположение только справедливо в пределе малых VSD, который зависит от системы (для G. sulfurreducens, VSD< 0,05 V). Большие значения VSD часто приводит к в различных условиях на каждый электрод и предотвращает этот метод вычитание фона используется. Кроме того, фон токи могут быть удалены путем вычитания источник и слейте течений, полученные на VSD = 0.0 V от полученных в VSD = 0.01 V. Этот метод не предполагается базовый течения каждого электрода то же самое.

Метод, описанный здесь является гибким. Большинство параметров, описанных в протоколе зависит от системы изучаются и могут быть изменены. Для например, материал и размеры Мар может изменяться, температурный диапазон и ворота потенциалов, среди других параметров, могут быть изменены в соответствии с потребностями конкретного исследования. Кроме того, стандартные микробиологических и электрохимические методы адаптированы и использованы, делая это протокол для исследователей из различных дисциплин.

Здесь мы описали протокол для изучения переноса электронов в жизни, электрод, выращенных, Электроактивные биоплёнки с помощью ИДАС. МДО ранее использовались для характеристики переноса электронов в тонкопленочных электропроводных полимеров и могут быть изготовлены с помощью различных стандартных электродных материалов и фотолитографический методов. 2 основное преимущество МДО является высокий сигнал шум соотношение благодаря i длинный серпантин разрыв, который отделяет переменного источника и слейте электрода полос и ii) относительно небольшой общий электрод площадь поверхности по сравнению с размер интервала. Геометрия электрода важно учитывать в стробирования измерения, поскольку измерения электрода и разрыв имеют большое влияние на соотношение сигнал-шум и, следовательно, на точность измерений проводимости. 18

Электрохимический стробирования эксперименты жизни, электрод выросли G. sulfurreducens биоплёнки экспонат четкий пик формы зависимости яSD на EG, предполагая, что электроны перевозятся через биопленки через бессвязные, многоступенчатый прыжка, как редокс проводящих полимеров. 4 , 35 пик проводимости биопленки G. sulfurreducens оказался ~ 4 мкСм/см, по согласованию с предыдущие результаты, полученные в аналогичных условиях. 17 , ворота потенциал для пик проводимости похож на середину потенциальных отмечено для G. sulfurreducens биоплёнки во время оборота CV.17 это наблюдается также ранее и постулируется означает, что то же самое электрон перевозчиков, используемые ячейки для переноса электронов в результате метаболизма ацетат также используются для нести заряд от исходного электрода к электроду утечка через биопленки. Другие зависимости яSD на EG, таких как наблюдается в различных материалах и предложить другой механизм переноса электрона. Например яSD против EG кривой полимера poly(methylthiophene) показывает s образной кривой и предлагает металлические как электронов проводимости. 36 , 37

Температурная зависимость проводимых ток — это критический параметр в определении механизм переноса электронов через проводящие материалы. До недавнего времени, только ex-situ образцы были использованы для изучения температурная зависимость проводимых ток через биопленки. 22 последние результаты, представленные здесь и в других местах17 получил другой яSD – T зависимость, использование стробирования измерений и поэтому предсказать многоступенчатый, бессвязные прыжковой механизм переноса электронов через G. sulfurreducens биопленки, который отличается от ранее предложенного механизма. 22

Основным ограничением этой техники и другие аналогичные геометрии при оценке переноса электронов через микробной биопленки является, что заряд движется горизонтально между источник и сток электродов, расположенных в одной плоскости на плоской поверхности. Однако, естественный поток электронов через биопленки, перпендикулярно поверхности электрода. С помощью этой техники и модели, мы приблизительное биопленки как однородных фильм и допросить поток электронов через только часть биопленки. Экспериментальная проверка пространственная неоднородность биопленки все еще необходим для дальнейшей проверки этой техники. Однако как указывалось выше, этот метод позволяет измерений in situ с высоким соотношение сигнал-шум на сегодняшний день. Этот метод может использоваться для изучения заряда транспорта любого материала, который может взаимодействовать с электрода.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

M.D.Y, S.M.G-S. и L.M.T. признать управлением военно-морских исследований (премия #N0001415WX01038 и N0001415WX00195), военно-морской научно-исследовательской лаборатории и военно-морской институт нанонауки лабораторных исследований; M.Y.E.-Н. поддерживается в США Департамент по энергии Грант де-FG02-13ER16415.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IDAs CH Instruments 012125 Manufactured by ALS-Japan; sold by CH Instruments
Wire Digikey W7-ND
Conductive silver epoxy Electron microscopy sciences 12670-EE
Insulating material 3M 2131-B Scotchast flame retardant compound
15 mL conical centrifuge tube VWR 89004-368
21g needle VWR BD-305165
5 mL pipette tips VWR 82018-842
5 mL pipettor VWR 89079-976
Freshwater medium components Sigma Aldrich All standard laboratory chemicals
    Ammonium chloride
    Sodium phosphate monobasic
    Sodium bicarbonate
Artificial seawater medium components Sigma Aldrich All standard laboratory chemicals
    Sodium chloride
    Magnesium chloride hexahydrate
    Magnesium sulfate heptahydrate
    Potassium chloride
    Sodium bicarbonate
    Calcium chloride dihydrate
    Ammonium chloride
    Potassium phosphate dibasic
Ag/AgCl reference electrode Basi MF-2079
Graphite rod counter electrode Electron microscopy sciences 70230
Recirculating water bath Thermo Scientific 152-5256
Bipotentiostat Pine Instruments WD-20 http://www.voltammetry.net/pine/aftermath/user
Stir bars VWR 58947-114
G. sulfurreducens culture ATCC 51573
Jacketed reactor Pine Instruments RRPG085

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boyd, D. A., et al. Biofilms in Bioelectrochemical Systems. , John Wiley & Sons, Inc. 177-210 (2015).
  2. Natan, M. J., Wrighton, M. S. Chemically modified microelectrode arrays. Prog Inorg Chem. 7, 391-494 (1990).
  3. Paul, E. W., Ricco, A. J., Wrighton, M. S. Resistance of polyaniline films as a function of electrochemical potential and the fabrication of polyaniline-based microelectronic devices. J Phys Chem-US. 89, 1441-1447 (1985).
  4. Dalton, E. F., et al. Charge transport in electroactive polymers consisting of fixed molecular redox sites. Chem Phys. 141, 143-157 (1990).
  5. Chidsey, C. E. D., Murray, R. W. Electroactive Polymers and Macromolecular Electronics. Science. 231, 25-31 (1986).
  6. Chidsey, C. E. D., Murray, R. W. Redox capacity and direct current electron conductivity in electroactive materials. J Phys Chem-US. 90, 1479-1484 (1986).
  7. Gregoire, K. P., Glaven, S. M., Hervey, J., Lin, B., Tender, L. M. Enrichment of a High-Current Density Denitrifying Microbial Biocathode. J Electrochem Soc. 161, H3049-H3057 (2014).
  8. Siegert, M., Yates, M. D., Spormann, A. M., Logan, B. E. Methanobacterium dominates biocathodic Archaeal communities in methanogenic microbial electrolysis cells. ACS Sus Chem Eng. 3, 1668-1676 (2015).
  9. Wang, Z., et al. A previously uncharacterized, nonphotosynthetic member of the Chromatiaceae is the primary CO2-fixing constituent in a self-regenerating biocathode. Appl Environ Microbiol. 81, 699-712 (2015).
  10. Marshall, C. W., Ross, D. E., Fichot, E. B., Norman, R. S., May, H. D. Long-term Operation of Microbial Electrosynthesis Systems Improves Acetate Production by Autotrophic Microbiomes. Environ Sci Technol. 47, 6023-6029 (2013).
  11. Strik, D. P. B. T. B., Picot, M., Buisman, C. J. N., Barrière, F. pH and Temperature Determine Performance of Oxygen Reducing Biocathodes. Electroanalysis. 25, 652-655 (2013).
  12. Strycharz, S. M., et al. Reductive dechlorination of 2-chlorophenol by Anaeromyxobacter dehalogenans with an electrode serving as the electron donor. Environ Microbiol Report. 2, 289-294 (2010).
  13. Yates, M. D., et al. Microbial Electrochemical Energy Storage and Recovery in a Combined Electrotrophic and Electrogenic Biofilm. Environ Sci Technol Lett. 4, 374-379 (2017).
  14. Tender, L. M., et al. Harnessing microbially generated power on the seafloor. Nature Biotechnology. 20, 821-825 (2002).
  15. Yates, M. D., Siegert, M., Logan, B. E. Hydrogen evolution catalyzed by viable and non-viable cells on biocathodes. Int J Hydrogen Energ. 39, 16841-16851 (2014).
  16. Fokina, O., Eipper, J., Winandy, L., Kerzenmacher, S., Fischer, R. Improving the performance of a biofuel cell cathode with laccase-containing culture supernatant from Pycnoporus sanguineus. Bioresource Technol. 175, 445-453 (2015).
  17. Yates, M. D., et al. Thermally activated long range electron transport in living biofilms. Phys Chem Chem Phys. 17, 32564-32570 (2015).
  18. Yates, M. D., et al. Measuring conductivity of living Geobacter sulfurreducens biofilms. Nat Nano. 11, 910-913 (2016).
  19. Snider, R. M., Strycharz-Glaven, S. M., Tsoi, S. D., Erickson, J. S., Tender, L. M. Long-range electron transport in Geobacter sulfurreducens biofilms is redox gradient-driven. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 15467-15472 (2012).
  20. Strycharz-Glaven, S. M., Snider, R. M., Guiseppi-Elie, A., Tender, L. M. On the electrical conductivity of microbial nanowires and biofilms. Energ Environ Sci. 4, 4366-4379 (2011).
  21. Malvankar, N. S., Tuominen, M. T., Lovley, D. R. Comment on "On electrical conductivity of microbial nanowires and biofilms" by S. M. Strycharz-Glaven, R. M. Snider, A. Guiseppi-Elie and L. M. Tender, Energy Environ. Sci., 2011, 4, 4366. Energy Environ. Sci. 5, 6247-6249 (2012).
  22. Malvankar, N. S., et al. Tunable metallic-like conductivity in microbial nanowire networks. Nat Nanotechnol. 6, 573-579 (2011).
  23. Strycharz-Glaven, S. M., Tender, L. M. Reply to the 'Comment on "On electrical conductivity of microbial nanowires and biofilms"' by N. S. Malvankar, M. T. Tuominen and D. R. Lovley, Energy Environ. Sci., 2012, 5. Energy Environ. Sci. 5, 6250-6255 (2012).
  24. Strycharz-Glaven, S. M., et al. Electron Transport through Early Exponential-Phase Anode-Grown Geobacter sulfurreducens Biofilms. Chem Electro Chem. 1, 1957-1965 (2014).
  25. Chidsey, C. E., Feldman, B. J., Lundgren, C., Murray, R. W. Micrometer-spaced platinum interdigitated array electrode: fabrication, theory, and initial use. Anal Chem. 58, 601-607 (1986).
  26. Li, C., Lesnik, K. L., Fan, Y., Liu, H. Redox Conductivity of Current-Producing Mixed Species Biofilms. PLOS ONE. 11, e0155247 (2016).
  27. Malvankar, N. S., et al. Tunable metallic-like conductivity in microbial nanowire networks. Nat Nano. 6, 573-579 (2011).
  28. Ing, N. L., Nusca, T. D., Hochbaum, A. I. Geobacter sulfurreducens pili support ohmic electronic conduction in aqueous solution. Phys Chem Chem Phys. 19, 21791-21799 (2017).
  29. Fricke, K., Harnisch, F., Schröder, U. On the use of cyclic voltammetry for the study of anodic electron transfer in microbial fuel cells. Energ Environ Sci. 1, 144-147 (2008).
  30. Marsili, E., Rollefson, J. B., Baron, D. B., Hozalski, R. M., Bond, D. R. Microbial biofilm voltammetry: direct electrochemical characterization of catalytic electrode-attached biofilms. Appl Environ Microbiol. 74, 7329-7337 (2008).
  31. Kankare, J., Kupila, E. -L. In-situ conductance measurement during electropolymerization. J Electroanal Chem. 322, 167-181 (1992).
  32. Byun, H. S., Pirbadian, S., Nakano, A., Shi, L., El-Naggar, M. Y. Kinetic Monte Carlo Simulations and Molecular Conductance Measurements of the Bacterial Decaheme Cytochrome MtrF. Chem Electro Chem. 1, 1932-1939 (2014).
  33. El Kasmi, A., Wallace, J. M., Bowden, E. F., Binet, S. M., Linderman, R. J. Controlling interfacial electron-transfer kinetics of cytochrome c with mixed self-assembled monolayers. J Am Chem Soc. 120, 225-226 (1998).
  34. Bortolotti, C. A., et al. The Reorganization Energy in Cytochrome c is Controlled by the Accessibility of the Heme to the Solvent. J Phys Chem Lett. 2, 1761-1765 (2011).
  35. Gallaway, J. W., Calabrese Barton, S. A. Kinetics of Redox Polymer-Mediated Enzyme Electrodes. J Am Chem Soc. 130, 8527-8536 (2008).
  36. Thackeray, J. W., White, H. S., Wrighton, M. S. Poly(3-methylthiophene)-coated electrodes: optical and electrical properties as a function of redox potential and amplification of electrical and chemical signals using poly(3-methylthiophene)-based microelectrochemical transistors. J Phys Chem-US. 89, 5133-5140 (1985).
  37. Jugnet, Y., Tourillon, G., Duc, T. M. Evidence of Intrinsic Extended π-Bonding Band and Metalliclike Behavior in Undoped and Doped Electropolymerized Poly (3-methylthiophene) Films. Phys Rev Lett. 56, 1862-1865 (1986).

Tags

Химия выпуск 136 микробной электрохимии микробной электросинтеза биопленки проводимости внеклеточная переноса электронов тонкой пленки электрохимических стробирования
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yates, M., Strycharz-Glaven, S.,… More

Yates, M., Strycharz-Glaven, S., Golden, J., Roy, J., Tsoi, S., Erickson, J., El-Naggar, M., Calabrese Barton, S., Tender, L. Characterizing Electron Transport through Living Biofilms. J. Vis. Exp. (136), e54671, doi:10.3791/54671 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter