Introduction
La estructura cuaternaria de una proteína juega un papel crucial en muchos procesos celulares. Vías de señalización, la expresión del gen de la enzima, y la activación / desactivación de todos se basan en el correcto montaje de complejos de proteínas 1-4. Este proceso también conocido como homo- o hetero-oligomerización se debe a covalente irreversible o interacciones proteína-proteína electrostáticas e hidrofóbicas reversibles. La oligomerización no sólo diversifica los diferentes procesos celulares sin aumentar el tamaño del genoma, sino que también proporciona una estrategia para las proteínas para construir complejos estables que son más resistentes a la desnaturalización y la degradación 5. Los defectos en la oligomerización tienen un impacto en la función de las proteínas y pueden conducir al desarrollo de enfermedades. Por ejemplo, la enzima fenilalanina hidroxilasa forma un complejo tetrámero. Algunas mutaciones dentro del complejo de proteínas pueden debilitar la formación de tetrámeros y conducir a la enfermedad fenilcetonuria 6.
7. Pertenece a la superfamilia de GTPasas grandes dynamin-como y tiene la capacidad de formar grandes estructuras oligoméricas in vitro 8. La oligomerización se ha sugerido para proteger MxA de degradación rápida 9,10. A pesar de intensos esfuerzos de muchos grupos de investigación, el mecanismo molecular de acción sigue siendo difícil de alcanzar en gran medida y el papel del estado de oligomerización de MxA para su función antiviral es objeto de debate 9,11,12. En este sentido, Gao y colaboradores propusieron un modelo en el que MxA ejerce su actividad antiviral mediante la interacción con nucleoproteínas virales en forma de grandes estructuras oligoméricas de anillo 11. Sin embargo, más recientemente, hemos demostrado que los dímeros MXa exhiben actividad antiviral e interactuar con la nucleoproteína del virus de influenza A 12. segundoobre la base de la estructura cristalina de MxA, Gao y colaboradores identificaron varios residuos de aminoácidos en las regiones de interfaz que son críticos para su oligomerización in vitro y su función antiviral 11,13. Por lo tanto, con el fin de dilucidar el cual oligomérica estado de MxA ejerce una actividad antiviral, hemos tratado de establecer un protocolo sencillo para determinar rápidamente el estado oligmeric de mutantes de interfaz MXa expresadas en las células humanas, así como endógenas MxA expresó después de la estimulación IFN.
Aunque hay muchas técnicas que se utilizan comúnmente para investigar la interacción entre las proteínas tales como la proteína de split-verde fluorescente (split-GFP) ensayo de complementación 14, la resonancia de plasmón de superficie 15 y Förster de transferencia de energía de resonancia (FRET) 16, que no proporcionan la información de la estequiometría exacta de un complejo de proteínas oligoméricas. Para la investigación de este aspecto particular, las técnicas tales comodispersión de luz multiángulo (MALS) 17 y 18 de ultracentrifugación analítica son muy útiles. Por lo general, las proteínas analizadas usando estos métodos son proteínas purificadas. procesos de oligomerización también pueden depender de otros factores celulares. Si estos factores son desconocidos, el análisis es más difícil. Además, algunas proteínas son difíciles de expresar en E. coli y de purificar. Por lo tanto, estos métodos no son la elección óptima para analizar la oligomerización de proteínas en el medio ambiente celular. Además, estas técnicas requieren instrumentos caros que no son fácilmente disponibles.
La no electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida (PAGE), cromatografía de exclusión por tamaño o reticulación química seguido de dodecil sulfato de sodio convencional -PAGE (SDS) son herramientas útiles para la caracterización de la formación de oligómeros a partir de lisados de células 2,19,20. Estos métodos no requieren equipo especializado y pueden ser fácilmente performed en un laboratorio estándar. Inicialmente se evaluaron varios protocolos de reticulación químicos que invariantly llevaron a la agregación y precipitación de MxA no específica. Por lo tanto, próximo a prueba los protocolos PAGE no desnaturalizante. Como PAGE no desnaturalizante excluye el uso de SDS, la migración de las proteínas depende de su carga nativo. PÁGINA Blue-nativo utiliza Coomassie G250 azul brillante para cargar las proteínas con una carga global negativa, similar a SDS, pero no desnaturaliza la proteína 21. Desafortunadamente, Coomassie precipitados azules brillantes de la presencia de niveles altos de sales y cationes divalentes (por ejemplo, Mg 2+) que a menudo se incluyen en tampones de lisis. Dependiendo de los tampones usados, puede ser difícil de analizar la muestra sin una mayor optimización de pasos que podrían tener un efecto en el complejo de proteína oligomérica.
Aquí se presenta un protocolo simple basado en un método previamente publicado 22 para determinar oligomerización deMxA proteína humana derivada de lisados celulares usando PAGE no desnaturalizante.
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Protocol
NOTA: Este protocolo se basa en el protocolo de PAGE no desnaturalizante publicado previamente 12. En ese estudio, el estado oligomérico de la proteína MxA se evaluó mediante cualquiera de las células Vero que sobreexpresan MxA o células A549 IFN-alfa estimulada que expresan endógeno MxA. El protocolo se describe a continuación se puede utilizar para analizar el estado oligomérico de cualquier proteína, además de MxA. Sin embargo, puede ser necesaria una mayor optimización.
1. Preparación de la célula lisado de PAGE no desnaturalizante
NOTA: Para analizar el estado oligomérico de la proteína MxA humana en células Vero o A549, se recogieron 1,0 x 10 6 células. Dependiendo del tipo de célula o la abundancia de la proteína a analizar, el número de células se debe ajustar. También es importante proteger el tampón de lisis de exposición a la luz, tan pronto como se añade el yodoacetamida sensible a la luz.
- Seed 0,3 x 10 6 A549 o Vero células por pocillo en6 pocillos platos. Mantener las células en 2 ml de medio de crecimiento por pocillo (véase la Tabla 1). Se incuban las células durante la noche en una incubadora de cultivo celular (37 ° C, 5% de CO 2).
- Recoger las células por lavado con 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y separar por adición de ácido etilendiaminotetraacético tripsina 0,5 ml de 0,25% (EDTA) 1x solución durante aproximadamente 5 min a temperatura ambiente.
- Tan pronto como las células desprenden de la placa, añadir 0,5 ml de medio de crecimiento y se mezcla cuidadosamente con la pipeta arriba y abajo.
- Transferencia de las células de cada pocillo en un tubo de 2 ml y sedimentar ellos utilizando una centrífuga de mesa (5000 xg, 4 ° C, 5 min).
- Retirar con cuidado el sobrenadante mediante pipeteo y sin alterar el sedimento celular.
- Se lavan las células con PBS 1 ml de hielo-frío pipeteando cuidadosamente la suspensión de células arriba y abajo.
- Precipitar las células en una centrífuga de mesa (5.000 xg, 4 ° C, 5 min).
- Retirar con cuidado el sobrenadante con la pipeta wiThout separar el sedimento celular.
- Resuspender las células en 200 helado buffer de lisis l (véase la Tabla 1) pipeteando arriba y abajo y poner en hielo.
- Inmediatamente, proteger lisado de la luz cubriendo los tubos usando papel de aluminio y se incuba durante 30 minutos en hielo.
NOTA: Después de la incubación durante 30 min en hielo, ya no es esencial para proteger el lisado de exposición a la luz, ya que la protección de los grupos tiol libres es irreversible. - Eliminar los restos celulares por centrifugación en una centrífuga de mesa de pre-enfriado (13.000 xg, 4 ° C, 20 min).
- Equilibrar columnas de diálisis en tampón de diálisis (Tabla 1) en el cuarto frío a 4 ° C durante 20 min durante la etapa de centrifugación. Utilizar una columna con un corte de peso molecular de 10.000.
- Una las columnas a una boya flotante y ponerlos en un vaso lleno de tampón de diálisis. Para asegurar una agitación suave, usar un agitador magnético. No toque la membrana.
NOTA: Dialysse columnas se pueden comprar o preparar a partir de tubos de 1,5 ml de acuerdo con el protocolo descrito por Fiala y compañeros de trabajo 19.
- Una las columnas a una boya flotante y ponerlos en un vaso lleno de tampón de diálisis. Para asegurar una agitación suave, usar un agitador magnético. No toque la membrana.
- Retirar las columnas del tampón de diálisis y la boya de flotación. La transferencia de los lisados de inmediata disposición en la columna de la diálisis preparada con la pipeta sin tocar la membrana. Una las columnas a una boya flotante y volver a ponerlos en el vaso lleno de tampón de diálisis.
- Se dializa el lisado en un vaso de precipitados que contiene tampón de diálisis enfriado con hielo (Tabla 1) durante al menos 4 h (o preferiblemente durante la noche) a 4 ° C mientras se agitaba cuidadosamente usando un agitador magnético. Use al menos 100 ml de tampón de diálisis durante un lisado de 200 l.
- Transferir la muestra dializada en un tubo de 1,5 ml. Eliminar precipitados por centrifugación en una centrífuga de mesa (13.000 xg, 4 ° C, 20 min). Para evitar la disociación de la proteína oligomérica complejos continúan con el protocolo (sección 2) inmediatamente después de la diálisis. No congelarlos lisados preparados.
2. Electroforesis
NOTA: La electroforesis se realizó como se ha descrito antes con algunas modificaciones 22. En el protocolo descrito a continuación, se utilizaron geles de gradiente premoldeados (4-15% de gradiente). Alternativamente, los geles se pueden preparar en el laboratorio. Es muy importante excluir cualquier agente desnaturalizante tal como SDS para evitar la disociación de los complejos de proteínas oligoméricas. Tiempo de electroforesis se ha optimizado para los diferentes estados oligoméricos de la proteína MxA humano. Sin embargo, puede variar para otras proteínas, dependiendo del tamaño del complejo oligomérico, así como la gama de separación que se supone que deben alcanzarse para analizar el complejo. Por lo tanto, el momento óptimo de la electroforesis se debe determinar empíricamente. Para una resolución óptima de los oligómeros a analizar la corriente no debe exceder de 25 mA.
- Montar el gel PAGE no desnaturalizante en gel de la cámara. llenar tél cámara interior y exterior con tampón de pre-enfriado (Tabla 1).
- Pre-ejecutar el gel con tampón de funcionamiento previamente enfriada a 25 mA por gel durante 15 minutos en la sala fría a 4 ° C.
- Mezclar 15 l de los lisados preparados anteriormente con 5 l de tampón de muestra 4x (Tabla 1). No hierva la muestra.
- Cargar 15 l de muestra y un estándar de proteína nativa de elección en el gel. Correr el gel a 25 mA durante 4 horas en la cámara frigorífica a 4 ° C.
NOTA: Para los análisis semi-cuantitativo, un protocolo de cuantificación de proteínas (por ejemplo, un ensayo de proteínas Bradford 23) se puede realizar con el fin de asegurar una carga de cantidades iguales de proteína total por carril.
3. Western Blot
NOTA: A continuación se describe el protocolo de un sistema de transferencia de western húmedo. Cualquier membrana de transferencia se puede utilizar. Activar fluoruro de polivinilideno (PVDF) membranas en 100% de metanol antes de la equilibración en secante buffer. La técnica de western blot semi-seco se puede utilizar como alternativa, pero tiene que ser optimizado para grandes complejos oligoméricos.
- Desmontar el gel y transferir con cuidado en tampón SDS (Tabla 1).
- Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente mientras se agita suavemente.
- Preparar 2 esponjas, 4 hojas de papel de filtro de celulosa y una membrana de transferencia por gel. Remojar en tampón secante (Tabla 1).
- Montar el sándwich de la siguiente manera (abajo a arriba): 1 esponja, hojas de papel de filtro 2 de celulosa, membrana, gel, hojas de papel de filtro de celulosa 2, 1 esponja.
- Ponga el sándwich en el tanque de transferencia. Asegúrese de que la membrana se enfrenta al polo positivo, mientras que el gel se enfrenta al polo negativo.
- Llenar el depósito secante con tampón de transferencia enfriado previamente.
- Seque a 90 mA durante la noche a 4 ° C para obtener los mejores resultados de la transferencia de proteínas.
- Desmontar el sándwich y visualizar el nivel de proteínas mediante la incubación de la membrana en Poncsolución eau S durante 5 min a temperatura ambiente.
- Destain la membrana lavando cuidadosamente el Ponceau S con agua desionizada hasta que pueda ver claramente las bandas de la proteína estándar.
- Marcar las bandas del patrón de proteína utilizando una pluma.
NOTA: Residual Ponceau S puede interferir con la inmunotinción. Para evitar esto, la membrana se puede destiñó además por incubación en NaOH 0,1 M durante 1 min y posterior lavado con agua desionizada. - Bloquear la membrana con tampón de bloqueo (véase la Tabla 1) durante al menos 1 hora a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C.
- Visualizar proteína (s) de interés mediante inmunotinción usando anticuerpos dirigidos contra la proteína a analizar.
NOTA: La proteína MxA humano se visualizó utilizando el anticuerpo policlonal de conejo específico para Mx1 humano diluido 1: 1000 en tampón de bloqueo (Tabla 1). La solución de anticuerpo se incubó durante la noche a 4 ° C. Alternativamente, el monoclonal unanti-MxA anticuerpo (clon 143) se puede utilizar (datos no mostrados) 24.
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Representative Results
Usando PAGE no desnaturalizante, se analizó el estado oligomérico de la naturaleza humana tipo MxA, los mutantes de interfaz dimérica MxA (R640A) y MxA (L617D), así como el mutante interfaz monomérica MxA (M527D) a partir de lisados celulares 12. Las células se lisaron en un tampón que contiene 1% octilfenoxipolietoxietanol (NP-40) y yodoacetamida para asegurar la solubilización de proteínas y la protección de los grupos tiol libres (véase la figura 1). Como se ha descrito antes, la sal y pequeños metabolitos se eliminaron por diálisis 19. Separación de proteínas se llevó a cabo mediante PAGE no desnaturalizante. Para facilitar el Western Blot eficiente, el gel se incubó en tampón de SDS antes de secante. Las proteínas se visualizaron MXa por inmunotinción usando un anticuerpo policlonal de conejo dirigido contra MxA. El flujo de trabajo se describe en la Figura 2.
Para comparar el estado oligomérico de la proteína MxA humana endógena de IFN-α ; células A549 estimuladas, se transfectaron células Vero (que carecen de endógeno MxA) con tipo salvaje recombinante, variantes MXa monoméricas y diméricas. Este tipo salvaje recombinante, monomérica y dimérica MxA variantes de forma tetrámeros estables, monómeros y dímeros, respectivamente, en comparación con un marcador de proteína nativa sin teñir (figura 3A). Por lo tanto, hemos utilizado estas proteínas recombinantes para evaluar el estado oligomérico de la proteína MxA endógeno humano derivado de IFN-α estimula las células A549. La Figura 3B muestra que el tamaño de MxA en lisados de células A549 IFN-alfa estimulada corresponde a un tetrámero.
Tomados en conjunto, se describe un método para determinar el estado oligomérico de la proteína humana MxA de lisado celular. Nuestro enfoque PAGE no desnaturalizante también se puede utilizar para evaluar el estado oligomérico de otros complejos de proteínas oligoméricas.
83 / 54683fig1.jpg "/>
Figura 1:. Estructura y esquema de reacción de yodoacetamida yodoacetamida protege irreversible del grupo tiol de cisteínas libres mediante la formación de un enlace tioéter. Esta modificación estables resulta de la sustitución nucleófila del yodo con el átomo de azufre de la cisteína. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2:. Workflow diagrama de PAGE no desnaturalizante Una representación sistemática del enfoque PAGE no desnaturalizante de lisados celulares. Durante la lisis celular, detergentes solubilizar las proteínas y los grupos tiol están protegidos por yodoacetamida para prevenir la agregación de proteínas. La diálisis elimina pequeños metabolitos y sales que podrían interferir con PAGE no desnaturalizante
Figura 3: Determinación del estado oligomérico de la proteína MxA humano usando PAGE no desnaturalizante y Western Blot (A) recombinante MxA variantes expresó ectópica en células Vero.. Los complejos de tipo salvaje MxA (tetrámero) mutantes interfaz MxA (R640A), MxA (L617D) (dímeros) y MxA (M527D) migran a sus pesos moleculares esperados, lo que confirma su estado oligomérico. (B) células A549 se estimularon con 1000 UI por ml de IFN-α para inducir la expresión MxA. El sh MxA endógenaOWS una banda que corresponde a la forma tetramérica. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| nombre del búfer | Contenido | comentarios | ||
| tampón de lisis | 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), NaCl 150 mM, 5 mM de MgCl 2, 100 yodoacetamida mu M, NaF 50 mM, 1 mM Na 3 VO 4, 1% NP-40, 50 mM β-glicerofosfato, 1 comprimido por cada 50 ml de tampón de lisis de EDTA libre de cóctel inhibidor de la proteasa | Añadir iodacetamide, NaF, Na 3 VO 4, octilfenoxipolietoxietanol (NP-40), β-glicerofosfato y proteasa inhibitor cóctel justo antes de la lisis celular Iodacetamide es sensible a la luz e inestable cuando está en solución. Evitar la exposición de la luz y disolver justo antes de su uso. | ||
| tampón de diálisis | 20 mM Tris-HCl (pH 6,8), 10% de glicerol, 0,1% de CHAPS, DTT 0,5 mM | CHAPS se pueden raplaced por otros detergentes no desnaturalizantes | ||
| tampón de desarrollo | 25 mM Tris-HCl (pH 8,3), glicina 192 mM, 0,1% de CHAPS, DTT 0,5 mM | A pH 8,3, la mayoría de las proteínas tienen carga negativa. Sin embargo, para proteínas básicas, un pH ácido se debe utilizar. De lo contrario, las proteínas se ejecutará en la dirección opuesta y se perderán. CHAPS se pueden sustituir por otros detergentes no desnaturalizantes | ||
| tampón de muestra | 310 mM Tris-HCl (pH 6,8), 0,05% de azul de bromofenol, 50% de glicerol | |||
| tampón SDS | 25 mM Tris-HCl (pH 8,3), glicina 192 mM, 0,1% de SDS | |||
| tampón de transferencia | Tris 25 mM, glicina 192 mM, 20% de metanol | Para los complejos muy grandes, Metanol puede omitirse | ||
| tampón de bloqueo | 50 mM Tris-HCl (pH 7,4) NaCl 150 mM 0,05% de Tween 20 5% de leche en polvo | |||
| Medio de crecimiento | medio modificado de Dulbecco 1x penicilina / estreptomicina La glutamina 2 mM 10% suero fetal de ternera | |||
Tabla 1: recetas de almacenamiento intermedio necesario para PAGE no desnaturalizante.
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Discussion
Aquí se describe un método sencillo que permite la rápida determinación del estado oligomérico de proteínas expresadas en células de mamífero por PAGE no desnaturalizante seguido de análisis de transferencia de Western. La principal ventaja de este enfoque es que el estado oligomérico de una proteína dada se puede determinar a partir de lisados de células enteras sin purificación de la proteína anterior. Esto puede ser importante para las proteínas que oligomerizar o ejercen su función en asociación con factores auxiliares. Además, las proteínas todavía están en su estado nativo y si se extrajo de nuevo a partir del gel, la actividad enzimática u otras funciones de la proteína pueden ser determinados y correlacionados con el estado oligomérico.
Un aspecto crítico de este protocolo es la elección de detergentes durante la preparación de la muestra. Esto es de particular importancia para las proteínas asociadas con las membranas celulares. MxA parece estar asociada principalmente con las membranas del retículo endoplásmico liso 25 19 la presencia de 0,1% 3 - [(3-colamidopropil) dimetilamonio] -1-se requería propanosulfonato (CHAPS) para evitar la precipitación de MxA durante gel electroforesis. Además, CHAPS no interfiere con la actividad enzimática de MxA como se determina con la proteína MxA recombinante purificada expresada en E. coli 12. Es de gran importancia que el detergente no se desnaturaliza las proteínas o interrumpe interacciones proteína-proteína durante la lisis. detergentes no desnaturalizantes tales como NP40, octoxinol 9, digitonina y CHAPS son adecuados para la solubilización. La elección del detergente y su concentración debe ser determinada empíricamente. El detergente también puede influir en experimentos posteriores, por ejemplo para ciertos ensayos el detergente tiene que sereliminado que se consigue fácilmente con CHAPS por diálisis, pero no con octoxinol 9 26.
Dado que el método descrito analiza proteínas derivadas de los lisados de células en condiciones no desnaturalizantes, no se requiere la purificación previa de las proteínas. Esto es una ventaja ya que la purificación de proteínas recombinantes a veces requiere optimizaciones tampón por la adición de niveles altos de sales y otros aditivos para evitar la proteína de agregación o precipitación. Sin embargo, estos aditivos y las altas concentraciones de sal pueden tener un impacto en la oligomerización de la proteína que no necesariamente podría parecerse a su estado natural. Especialmente en el caso de la proteína MxA humana, la concentración de sal y la presencia de nucleótidos desempeñan un papel crucial en la formación de oligómeros más altos estados 27. En los lisados de células, las proteínas se estabilizan más fácilmente ya que los factores de estabilización celulares están todavía presentes. Por lo tanto es posible analizar prOtein complejos en condiciones fisiológicas más celulares (por ejemplo, concentraciones fisiológicas de sal y pH). Este protocolo también debería ser aplicable a otras proteínas formadoras de oligómeros, por ejemplo para el estructuralmente relacionado mxB o dynamin 8.
Otro aspecto importante del protocolo es la protección de los grupos tiol libres para evitar la formación de puentes disulfuro artificiales de proteínas citoplasmáticas durante la lisis (Figura 1). Los experimentos iniciales demostraron que la adición de 1,4-ditiotreitol (DTT) o β-mercaptethanol no es suficiente para evitar la formación de enlaces disulfuro artificiales durante la preparación de la muestra. Ambos agentes reductores protegen el grupo tiol de forma reversible la formación de puentes disulfuro. Esta protección reversible podría no ser suficiente para proteger a todos los grupos tiol de forma permanente. En el caso de la proteína MxA, esto conduce a la agregación irreversible de la proteína. Sin embargo, la adición de yodoacetamida que irreversibly protege los grupos tiol libres de cisteínas reducido en gran medida de la agregación de la proteína MxA Además, el tratamiento yodoacetamida de lisados preparados a partir de MxA expresando células de mamífero no tenía ninguna influencia sobre la actividad GTPasa de inmunoprecipitada MxA en comparación con MxA a partir de lisados tratados con DTT (datos no mostrados ).
Otras consideraciones cruciales para la determinación exacta del número de protómeros en un oligómero son la elección de la gama de concentración de poliacrilamida, así como la proteína de referencia de peso molecular. El rango de la concentración de poliacrilamida se debe establecer primero para permitir la separación máxima de las bandas a las masas moleculares esperadas de oligómeros. PAGE no desnaturalizante no contiene ningún SDS. A falta de SDS, la carga, la masa molecular y la forma de la proteína determina su movilidad electroforética. Por lo tanto, la elección del marcador de peso molecular de proteínas es crucial. Idealmente, una referencia de peso molecular sería arecombinant forma purificada de la proteína de interés con los estados oligómeros conocidos. Dado que esto no siempre está disponible, un marcador de la proteína no desnaturalizada o nativa debe ser utilizado. Desde MxA se ha demostrado asociarse con otras proteínas celulares, tales como UAP56 o nucleoproteínas virales de Thogotovirus, virus o influenza virus La Crosse 12,28-30, también a prueba mediante inmunotinción usando anticuerpos específicos si UAP56 o influenza A nucleoproteína se co-separado con MxA en los geles no desnaturalizantes PA. Sin embargo no se encontraron pruebas para la formación de MXa hetero-oligómeros. Esto probablemente es debido al hecho de que MxA-UAP56 y las interacciones MxA-nucleoproteína son de baja afinidad 12,24. Por otra parte, la fracción de proteína MxA asociarse con UAP56 o nucleoproteínas virales podría ser muy bajo y por lo tanto difíciles de detectar por este método.
Además, es importante tomar en consideración el pKa de la proteína a analizar. En la no denat descritoprotocolo PÁGINA urante, las proteínas se separan por electroforesis a pH 8,3. La mayoría de las proteínas tienen carga negativa a este pH. Sin embargo, las proteínas básicas presentan una carga neta positiva a pH 8,3 y por lo tanto se ejecutará en la dirección opuesta. Como consecuencia, es importante, para el análisis de proteínas básicas para ajustar el pH del tampón de funcionamiento para garantizar una carga negativa global de la proteína.
Tomados en conjunto que aquí presentamos un protocolo para la evaluación rápida del estado oligomérico de proteínas expresadas en células de mamífero sin la necesidad de su purificación previa.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Units, 10K MWCO, 0.5 ml | Thermo Fisher Scientific | 69570 | Pre-equilibrate in dialysis buffer (if Glycerol removal is desired) Can be self-made according to Fiala et al. 2011 |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, | Bio-Rad | 456-1083 | Pre-run in running buffer to adjust buffer system |
| cOmplete, Mini, EDTA-free | Roche | 11836170001 | use 1 tablet per 50 ml |
| PBS, pH 7.4 bottle a 500 ml Gibco | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| Ponceau S solution | Sigma-Aldrich | P7170 | TOXIC wear gloves and protect eyes |
| NativeMark Unstained Protein Standard 50 µl | Invitrogen | P/N 57030 | load 5 µl/well |
| A549 cells | ATCC | ATCC CCL185 | Grow in growth medium (see Table 1) |
| Vero cells | ATCC | ATCC CCL81 | Grow in growth medium (see Table 1) |
| anti-Mx1 antibody | Novus Biologicals | H00004599_D01P | Use at a 1:1,000 dilution |
| ECL Anti-rabbit IgG, Horseradish Peroxidase linked whole antibody (from donkey) | GE-Healthcare | NA934V | Use at a 1:10,000 dilution |
| 0.5% Trypsin-EDTA (1x) Life Technologies | Thermo Fisher | 15400-054 | |
| Iodoacetamide 5 g | Sigma-Aldrich | I-6125 | stock 100 mM |
| Bromphenolblue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| DMEM +4.5g/l Gluc,+L-Glut,+Pyruvate life technologies | Thermo Fisher Scientific | 41966-029 | |
| Pen Strep 100 x 100ml life technologies | Thermo Fisher Scientific | 15140 - 130 | |
| Glutamax 100x Stock, 100 ml life technologies | Thermo Fisher Scientific | 350500-038 | |
| Fetal Bovine Serum, Dialyzed , US Origin 500 ml Gibco Lot:42G9552K | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| Cellulose filter paper | Bio-Rad | 1703965 | |
| PVDF blotting membrane | GE-Healthcare | 10600022 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Biosolve | 0020092391BS | |
| sodium fluoride (NaF) | Sigma Aldrich | S-7920 | |
| NP-40 | Calbiochem | 492015 | |
| cOmplete, Mini, EDTA-free | Roche | 11836170001 | |
| Tween 20 | Calbiochem | 6555204 | |
| CHAPS 10% solution | Amresco | N907 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | 43819 | |
| Glycine | Biosolve | 0007132391BS | |
| sodium orthovanadate (Na3VO4) | Sigma Aldrich | 450243 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G7757 | |
| β-Glycerophospate | Sigma Aldrich | G9422 | |
| Milk powder | Migros/Switzerland | ||
| Methanol | Millipore | 1.06009 | |
| sodium cloride (NaCl) | Sigma Aldrich | 71380 | |
| magnesium chloride (MgCl2) | Amresco | 288 | |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Sigma Aldrich | L4509 | |
| sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | S-8045 |
References
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