Este artigo descreve um protocolo simples e rápido para avaliar o estado oligomérico da proteína GTPase MxA semelhante à dinamina de lisados de células humanas usando uma combinação de PAGE não desnaturante com análise de western blot.
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Artigo de método
Caracterização de complexos multi-subunidade de proteína de humano utilizando MxA não desnaturante em gel de poliacrilamida-electroforese
Neste artigo
Resumo
Resumo
A formação de complexos oligoméricos é um pré-requisito crucial para a estrutura e função adequadas de muitas proteínas. A proteína efetora antiviral induzida por interferon MxA exerce uma ampla atividade antiviral contra muitos vírus. MxA é uma GTPase semelhante à dinamina e tem a capacidade de formar estruturas oligoméricas de ordem superior. No entanto, se a oligomerização de MxA é necessária para sua atividade antiviral é uma questão de debate. Descrevemos aqui um protocolo simples para avaliar o estado oligomérico de MxA expressa endogena ou ectopicamente na fração citoplasmática de linhagens celulares humanas por eletroforese em gel de poliacrilamida não desnaturante (PAGE) em combinação com análise de Western blot. Uma etapa crítica do protocolo é a escolha de detergentes para evitar a agregação e/ou precipitação de proteínas particularmente associadas a membranas celulares como MxA, sem interferir em sua atividade enzimática. Outro aspecto crucial do protocolo é a proteção irreversível dos grupos tióis livres de resíduos de cisteína pela iodoacetamida para evitar interações artificiais da proteína. Este protocolo é adequado para uma avaliação simples do estado oligomérico de MxA e, além disso, permite uma correlação direta da atividade antiviral dos mutantes da interface MxA com seus respectivos estados oligoméricos.
Introdução
A estrutura quaternária de uma proteína desempenha um papel crucial em muitos processos celulares. Vias de sinalização, a expressão do gene e enzima de activação / desactivação todos contam com a montagem adequada de complexos de proteínas 1-4. Este processo também conhecido como homo- ou hetero-oligomerização é devido à covalente irreversível ou interacções proteína-proteína electrostáticas e hidrofóbicas reversíveis. A oligomerização não só diversifica os diferentes processos celulares sem aumentar o tamanho do genoma, mas também fornece uma estratégia para construir proteínas de complexos estáveis que são mais resistentes à desnaturação e degradação no ....
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Protocolo
NOTA: Este protocolo é baseado no não desnaturante protocolo de PAGE publicado anteriormente 12. Neste estudo, o estado oligomérico da proteína MxA foi avaliada utilizando quer de células Vero ou de células que sobre-expressam MxA A549 IFN-ct-estimuladas expressam MxA endógena. O protocolo abaixo descrito pode ser utilizado para analisar o estado oligomérico da proteína em qualquer além MxA. No entanto, uma maior optimização pode ser necessária.
1. Preparação de lisado celular para PAGE não desnaturante
NOTA: Para analisar o estado oligomérico da proteína MxA humana tanto em células Vero ou A549, 1,0 ....
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Resultados
Usando não-PAGE desnaturante, analisou-se o estado oligomérico do tipo selvagem humana MxA, os mutantes diméricas de interface MxA (R640A) e MxA (L617D), bem como o mutante de interface monomérica MxA (M527D) a partir de lisados celulares 12. As células foram lisadas num tampão contendo 1% de octilfenoxipolietoxietanol (NP-40) e iodoacetamida para assegurar a solubilização da proteína e a protecção dos grupos tiol livres (ver Figura 1). Conforme descrito antes, sal e pequenos metabólitos fora.......
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Discussão
Descrevemos aqui um método simples que permite a determinação rápida do estado oligomérico de proteínas expressas em células de mamíferos por PAGE não desnaturante seguido por análise Western Blot. A principal vantagem desta abordagem é que o estado oligomérico de uma dada proteína pode ser determinada a partir de lisados de células inteiras sem purificação de proteína antes. Isto pode ser importante para proteínas que oligomerizar ou exercem a sua função em associação com factores auxiliares. Além disso, as proteínas.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado por uma bolsa da Fundação Nacional de Ciência da Suíça (Grant nr. 31003A_143834) para JP.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Unidades de Diálise Slide-A-Lyzer MINI, 10K MWCO, 0.5 ml | Thermo Fisher Scientific | 69570 | Pré-equilíbrio em tampão de diálise (se a remoção de Glicerol for desejada) Pode ser feito por conta própria de acordo com Fiala et al. 2011 |
| 4– 15% Mini-PROTEAN TGX Géis de Proteína Pré-moldados, 10 poços, | Bio-Rad | 456-1083 | Pré-corrida em buffer de corrida para ajustar o sistema de buffer |
| cOmplete, Mini, livre de EDTA | Roche | 11836170001 | use 1 comprimido por 50 ml |
| de PBS, pH 7.4 garrafa de 500 ml Gibco | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| Solução Ponceau S | Sigma-Aldrich | P7170 | TOXIC use luvas e proteja os olhos |
| Padrão de Proteína Não Manchada NativeMark 50 µ l | Invitrogen | P/N 57030 | carga 5 µ células |
| A549 | ATCC | ATCC CCL185 | Crescem em meio de crescimento (ver Tabela 1) |
| Células Vero | ATCC | ATCC CCL81 | Crescem em meio de crescimento (ver anticorpo anti-Mx1 Tabela 1) |
| anti-Mx1 | Novus Biologicals | H00004599_D01P | Use em uma diluição de 1:1.000 |
| ECL Anti-rabbit IgG, anticorpo inteiro ligado à peroxidase de rábano (de burro) | GE-Healthcare | NA934V | Use a uma diluição de 1:10.000 |
| 0,5% Tripsina-EDTA (1x) Life Technologies | Thermo Fisher | 15400-054 | |
| Iodoacetamida 5 g | Sigma-Aldrich | I-6125 | estoque 100 mM |
| Bromphenolblue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| DMEM +4.5g/l Gluc,+L-Glut,+Pyruvate life technologies | Thermo Fisher Scientific | 41966-029 | |
| Pen Estreptococos 100 x 100ml life technologies | Thermo Fisher Scientific | 15140 - 130 | |
| Glutamax 100x Stock, 100 ml life technologies | Thermo Fisher Scientific | 350500-038 | |
| Soro Fetal Bovino, Dialisado, Origem US 500 ml Lote Gibco:42G9552K | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| Papel de filtro de celulose | Bio-Rad | 1703965 | |
| PVDF blotting membrana | GE-Healthcare | 10600022 | |
| Tris(hidroximetil)aminometano | Biosolve | 0020092391BS | |
| fluoreto de sódio (NaF) | Sigma Aldrich | S-7920 | |
| NP-40 | Calbiochem | 492015 | |
| cOmplete, Mini, EDTA-free | Roche | ||
| Tween 20 | Calbiochem | 6555204 | |
| CHAPS solução a 10% | Amresco | N907 | |
| DL-Ditiotreitol (DTT) | Sigma Aldrich | 43819 | |
| Glycine | Biosolve | 0007132391BS | |
| ortovanadato de sódio (Na3VO4) | Sigma Aldrich | 450243 | |
| Glicerol | Sigma Aldrich | G7757 | |
| β-Glicerophospate | Sigma Aldrich | G9422 | |
| Leite em pó | Migros/Suíça | ||
| Metanol | Millipore | 1.06009 | |
| cloreto de sódio (NaCl) | Sigma Aldrich | 71380 | |
| cloreto de magnésio (MgCl2) | Amresco | 288 | |
| Dodecil sulfato de sódio (SDS) | Sigma Aldrich | L4509 | |
| hidróxido de sódio (NaOH) | Sigma Aldrich | S-8045 |
Referências
- Baisamy, L., Jurisch, N., Diviani, D. Leucine zipper-mediated homo-oligomerization regulates the Rho-GEF activity of AKAP-Lbc. J Biol Chem. 280, 15405-15412 (2005).
- Chen, C. P., Posy, S., Ben-Shaul, A., Shapiro, L., Honig, B. H.
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Reimpressões e permissões
