Introduction
De quaternaire structuur van een eiwit speelt een cruciale rol in vele cellulaire processen. Signaalwegen, genexpressie en enzymactivering / deactivering allemaal afhankelijk van de juiste montage van eiwitcomplexen 1-4. Dit proces ook bekend als homo- of hetero-oligomerisatie wordt veroorzaakt door irreversibele covalente of omkeerbare elektrostatische en hydrofobe eiwit-eiwit interacties. Oligomerisatie diversifieert niet alleen de verschillende cellulaire processen zonder genoomgrootte verhogen, maar ook een strategie voor eiwitten stabiele complexen die resistenter voor denaturatie en degradatie 5 zijn gebouwd. Defecten in oligomerisatie van invloed op de functie van eiwitten en kan leiden tot de ontwikkeling van ziekten. Bijvoorbeeld het enzym fenylalanine hydroxylase vormt een tetrameer complex. Sommige mutaties in het eiwitcomplex de vorming tetrameer verzwakken en leiden tot de ziekte fenylketonurie 6.
7. Het behoort tot de superfamilie van dynamin-achtige GTPases groot en heeft de capaciteit om grote oligomere structuren in vitro 8. Oligomerisatie is voorgesteld om MxA te beschermen tegen snelle afbraak 9,10. Ondanks intensieve inspanningen van vele onderzoeksgroepen, de moleculaire werkingsmechanisme blijft grotendeels ongrijpbaar en de rol van de oligomerisatie toestand van MxA voor zijn antivirale functie is onder debat 9,11,12. In dit verband, Gao en medewerkers voorgesteld een model waarbij MxA oefent zijn antivirale activiteit door interactie met virale kerneiwitten in vorm van grote ringachtige oligomere structuren 11. Echter, meer recentelijk, hebben we aangetoond dat MxA dimeren vertonen antivirale werking en interactie met het nucleoproteïne van influenza A virus 12. Based op de kristalstructuur van MxA, Gao en collega's identificeerden verschillende aminozuurresten in de grensvlakgebieden die essentieel zijn voor de oligomerisatie in vitro en zijn antivirale werking 11,13 zijn. Teneinde op te helderen die oligomere toestand van MxA antivirale activiteit uitoefent, zochten wij een eenvoudig protocol om de oligmeric staat MxA interface-mutanten tot expressie gebracht in humane cellen als endogeen MxA uitgedrukt IFNa na stimulatie snel vast te stellen.
Hoewel er vele technieken die gewoonlijk worden gebruikt om de interactie tussen eiwitten bestuderen die de split-Green Fluorescent Protein (split-GFP) complementatie bepaling 14, oppervlak plasmon resonantie 15 en Förster resonantie energieoverdracht (FRET) 16, ze geen informatie over de exacte stoichiometrie van een oligomeer eiwitcomplex. Voor het onderzoek van dit aspect technieken zoalsmulti-angle lichtverstrooiing (Mals) 17 en analytische ultracentrifugatie 18 zijn zeer nuttig. Gewoonlijk zijn de eiwitten geanalyseerd met behulp van deze werkwijzen gezuiverde eiwitten. Oligomerisatie processen kunnen ook afhangen van andere cellulaire factoren. Als deze factoren zijn bekend, de analyse bemoeilijkt. Bovendien hebben sommige eiwitten moeilijk in E. coli en te zuiveren. Daarom zijn deze werkwijzen niet de optimale keuze eiwit oligomerisatie analyseren de cellulaire omgeving. Bovendien zijn deze technieken vereisen dure instrumenten die niet gemakkelijk beschikbaar zijn.
Niet-denaturerende polyacrylamidegelelektroforese (PAGE), grootte-uitsluitingschromatografie of chemische verknoping gevolgd door gebruikelijke natrium dodecylsulfaat (SDS) -PAGE zijn nuttige hulpmiddelen voor het karakteriseren van de vorming van oligomeren van cellysaten 2,19,20. Deze methoden vereisen geen gespecialiseerde apparatuur en kan gemakkelijk worden performed in een standaard laboratorium. We eerst geëvalueerd verschillende chemische verknoping protocollen die invariant tot aspecifieke aggregatie en precipitatie van MxA. Daarom hebben we de volgende geteste niet-denaturerende PAGE protocollen. Als niet-denaturerende PAGE gebruik van SDS uitsluit, de migratie van eiwitten afhankelijk van hun oorspronkelijke lading. Blauw-natieve PAGE gebruikt Coomassie brilliant blue G250 eiwitten met een totale negatieve lading, vergelijkbaar met SDS laden, maar niet het eiwit 21 denatureren. Helaas, Coomassie Brilliant blauw precipitaat in aanwezigheid van hoge zouten en tweewaardige kationen (bijvoorbeeld Mg 2+) die vaak in lysis buffers. Afhankelijk van de gebruikte buffers, kan het moeilijk zijn om het monster zonder verdere optimalisering van stappen die een effect op het oligomeer eiwitcomplex konden analyseren.
Hier presenteren we een eenvoudig protocol op basis van een eerder gepubliceerde werkwijze 22 voor oligomerisatie van bepalenhuman MxA eiwit afkomstig van cellysaten met behulp van niet-denaturerende PAGE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: Dit protocol is gebaseerd op de eerder gepubliceerde niet-denaturerende PAGE 12 protocol. In deze studie, de oligomere status van de MxA eiwit werd bepaald met behulp van Vero-cellen tot overexpressie MxA of IFN-α-gestimuleerde A549 cellen die endogene MxA. De hieronder beschreven protocol kan worden gebruikt om de oligomere status van elke proteïne geanalyseerd naast MxA. Echter, kan verdere optimalisatie nodig.
1. Bereiding van cellysaat voor niet-denaturerende PAGE
OPMERKING: Om de oligomere toestand van de menselijke MxA eiwit te analyseren in een van beide Vero of A549-cellen werden 1,0 x 10 6 cellen geoogst. Afhankelijk van het celtype en de overvloed van het eiwit te analyseren, moet het aantal cellen worden ingesteld. Het is ook belangrijk om de lysisbuffer beschermen tegen blootstelling aan licht, zodra het lichtgevoelige joodaceetamide toegevoegd.
- Seed 0,3 x 10 6 A549 of Vero-cellen per putje intot 6 goed gerechten. Houd de cellen in 2 ml kweekmedium per putje (zie tabel 1). Incubeer cellen 's nachts in een celkweek incubator (37 ° C, 5% CO 2).
- Oogst de cellen door wassen met 1 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en losmaken door toevoeging van 0,5 ml van 0,25% trypsine-ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) 1x oplossing gedurende ongeveer 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Zodra de cellen los van de schotel, voeg 0,5 ml groeimedium en meng voorzichtig door en neer te pipetteren.
- Breng de cellen van elk putje in een 2 ml buisje en pelleteren ze met een tafelblad centrifuge (5000 xg, 4 ° C, 5 min).
- Verwijder voorzichtig het supernatant door pipetteren zonder verstoring van de cel pellet.
- Was de cellen met 1 ml ijskoude PBS door voorzichtig pipetteren de celsuspensie op en neer.
- Pellet cellen in een tafelblad centrifuge (5000 xg, 4 ° C, 5 min).
- Verwijder de bovenstaande vloeistof voorzichtig door pipetteren without losmaken van de celpellet.
- Resuspendeer cellen in 200 ul ijskoude lysisbuffer (zie tabel 1) door en neer te pipetteren en op ijs gezet.
- Onmiddellijk beschermen lysaat van licht door het bedekken van de buizen met behulp van aluminiumfolie en incubeer gedurende 30 minuten op ijs.
OPMERKING: Na incubatie gedurende 30 min op ijs, is het niet langer noodzakelijk om het lysaat te beschermen tegen blootstelling aan licht, omdat de bescherming van de vrije thiolgroepen onomkeerbaar. - Verwijderen celresten door centrifugeren in een voorgekoeld tafelblad centrifuge (13.000 xg, 4 ° C, 20 min).
- Equilibreren dialyse kolommen in dialysebuffer (Tabel 1) in de koude kamer bij 4 ° C gedurende 20 min in de centrifugatiestap. Gebruik een kolom met een molecuulgewicht cut off van 10.000.
- Bevestig de kolommen een float boei en ze in een beker gevuld met dialysebuffer. Om voorzichtig roeren te waarborgen, gebruik een magnetische roerder. Raak de membraan niet aan.
LET OP: Dialyswordt kolommen kunnen worden gekocht of bereid uit 1,5 ml buizen volgens de werkwijze beschreven door Fiala en medewerkers 19 protocol.
- Bevestig de kolommen een float boei en ze in een beker gevuld met dialysebuffer. Om voorzichtig roeren te waarborgen, gebruik een magnetische roerder. Raak de membraan niet aan.
- Verwijder de kolommen uit de dialyse buffer en de vlotter boei. Breng de ontruimde lysaten in de voorbereide dialyse kolom door pipetteren zonder het aanraken van het membraan. Bevestig de kolommen aan een vlotter boei en zet ze terug in de beker gevuld met dialyse buffer.
- Dialyseer het lysaat in een bekerglas met ijskoude buffer dialyse (Tabel 1) gedurende ten minste 4 uur (of bij voorkeur overnacht) bij 4 ° C onder voorzichtig roeren met een magneetroerder. Gebruik minimaal 100 ml dialysebuffer een 200 ul lysaat.
- Breng het gedialyseerd monster in een 1,5 ml buis. Verwijderen precipitaten door centrifugeren in een tafelblad centrifuge (13.000 xg, 4 ° C, 20 min). Om de dissociatie van de oligomere eiwitcomplexen verder met het protocol (deel 2) onmiddellijk na de dialyse te voorkomen. Niet bevriezende bereide lysaten.
2. Elektroforese
OPMERKING: Elektroforese werd uitgevoerd zoals hiervoor is beschreven met enkele modificaties 22. In de hieronder beschreven protocol werd prefab gradiënt gels gebruikt (4-15% gradiënt). Als alternatief kunnen de gels worden bereid in het laboratorium. Het is zeer belangrijk om denatureringsmiddel priori als SDS aan de dissociatie van de oligomere eiwitcomplexen voorkomen. Tijd van elektroforese werd geoptimaliseerd voor de verschillende oligomere toestanden van het menselijke MxA eiwit. Het kan echter variëren voor andere eiwitten, afhankelijk van de grootte van het oligomere complex en het bereik van de scheiding die verondersteld worden bereikt om het complex te analyseren. Daarom moet het optimale tijdstip van elektroforese empirisch worden bepaald. Voor optimale resolutie van de oligomeren te analyseren moet de huidige maximaal 25 mA.
- Monteer de niet-denaturerende PAGE gel in de gel kamer. Vul tHij binnenste en buitenste kamer met vooraf gekoelde loopbuffer (tabel 1).
- Voorlooptijd de gel met voorgekoeld loopbuffer bij 25 mA per gel gedurende 15 minuten in de koude kamer bij 4 ° C.
- Meng 15 pl van het hierboven bereide lysaten met 5 ui 4x monsterbuffer (tabel 1). Mis het monster niet koken.
- Laad 15 pl monster en een natief eiwit standaard keuze op de gel. Voer de elektroforese bij 25 mA gedurende 4 uur in de koude kamer bij 4 ° C.
OPMERKING: Bij semi-kwantitatieve analyses, een eiwit kwantificering protocol (bijvoorbeeld een Bradford eiwittest 23) kunnen worden uitgevoerd om het laden van gelijke hoeveelheden totaal eiwit per laan waarborgen.
3. Western Blot
OPMERKING: Hieronder wordt het protocol van een natte western blot systeem. Elke blotting membraan kan worden gebruikt. Activeren polyvinylideenfluoride (PVDF) membranen in 100% methanol voor equilibratie in blotting buffer. De semi-droge western blot techniek kan ook worden gebruikt, maar moet worden geoptimaliseerd voor grote oligomere complexen.
- Demonteer de gel voorzichtig deze hoeveelheid in SDS-buffer (Tabel 1).
- Incubeer gedurende 10 min bij kamertemperatuur onder zacht schudden.
- Bereid 2 sponzen, 4 cellulose filterpapier lakens en een blotting membraan per gel. Drenken in blotbuffer (tabel 1).
- Monteer de sandwich als volgt (onder naar boven): 1 spons, 2 cellulose filter vellen papier, membraan, gel, 2 cellulose filter vellen papier, 1 spons.
- Doe de sandwich in de blotting tank. Zorg ervoor dat het membraan wordt geconfronteerd met de pluspool, terwijl de gel wordt geconfronteerd met de minpool.
- Vul het blotting tank met voorgekoeld blotting buffer.
- Blot 90 mA overnacht bij 4 ° C voor de beste eiwit overbrenging leidt.
- Demonteer de sandwich en visualiseer het eiwit standaard door incubatie van het membraan in Ponceau S oplossing gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Destain het membraan door het zorgvuldig wassen van de Ponceau S met gedemineraliseerd water totdat u duidelijk de banden van het eiwit standaard kunnen zien.
- Markeer de banden van het eiwit standaard met behulp van een pen.
LET OP: Resterende Ponceau S kan interfereren met de immunokleuring. Om dit te voorkomen, kan het membraan verder worden ontkleurd door incubatie in 0,1 M NaOH gedurende 1 min en daaropvolgend wassen met gedeïoniseerd water. - Blokkeer het membraan met een blokkeerbuffer (zie tabel 1) gedurende ten minste 1 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C.
- Visualiseren eiwit (ten) van belang door immunokleuring met behulp van antilichamen tegen het eiwit te analyseren.
OPMERKING: De menselijke MxA eiwit werd gevisualiseerd met behulp van het konijn polyklonaal antilichaam specifiek voor humaan Mx1 verdund 1: 1000 in blockingbuffer (tabel 1). De antilichaamoplossing werd overnacht geïncubeerd bij 4 ° C. Als alternatief, het monoklonale eennti-MxA antilichaam (kloon 143) kan worden gebruikt (gegevens niet getoond) 24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het gebruik van niet-denaturerende PAGE, analyseerden we de oligomere toestand van het humane wildtype MxA, de dimere interface-mutanten MxA (R640A) en MxA (L617D) en de monomere-interface mutant MxA (M527D) vanaf 12 cellysaten. Cellen werden gelyseerd in een buffer die 1% octylfenoxypolyethoxyethanol (NP-40) en joodacetamide om eiwitten oplosbaar en bescherming van de vrije thiolgroepen te verzekeren (zie figuur 1). Zoals eerder beschreven, werden zout en kleine metabolieten verwijderd door dialyse 19. Eiwit scheiding werd uitgevoerd door niet-denaturerende PAGE uitgevoerd. Efficiënte western blotting vergemakkelijken, werd de gel geïncubeerd in SDS buffer vóór blotting. De MxA eiwitten werden gevisualiseerd door immunokleuring met een konijn polyklonaal antilichaam gericht tegen MxA. De werkstroom wordt beschreven in figuur 2.
Om de oligomere toestand van endogene humane MxA eiwit vergelijken van IFN-α ; gestimuleerde A549 cellen, we getransfecteerde Vero-cellen (endogeen ontbreekt MxA) met recombinant wildtype, monomere en dimere varianten MxA. Deze recombinant wildtype, monomere en dimere varianten MxA gevormde stabiele tetrameren, monomeren en dimeren, respectievelijk, vergeleken met een natief eiwit ongekleurde marker (Figuur 3A). Daarom gebruikten we deze recombinante eiwitten beoordelen de oligomere toestand endogeen humaan MxA eiwitten van IFN-α gestimuleerde A549-cellen. Figuur 3B toont dat de grootte van MxA in lysaten van gestimuleerde IFN-α A549 cellen overeen met een tetrameer.
Samengevat beschrijven we een methode om de oligomere toestand van het humane eiwit MxA bepalen uit cellysaat. Onze niet-denaturerende PAGE benadering kan ook worden gebruikt om de oligomere toestand andere oligomere eiwitcomplexen beoordelen.
83 / 54683fig1.jpg "/>
Figuur 1:. Structuur en reactieschema joodaceetamide iodoacetamide onomkeerbaar beschermt de thiolgroep van vrije cysteïnen door vorming van een thio-etherbinding. Deze stabiele wijziging vloeit voort uit de nucleofiele substitutie van de jood met het zwavelatoom van de cysteïne. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2:. Workflow diagram van niet-denaturerende PAGE Een systematische voorstelling van de niet-denaturerende PAGE benadering van cellysaten. Tijdens cellysis, detergenten oplosbaar eiwitten en thiol groepen worden beschermd door joodaceetamide eiwit aggregatie te voorkomen. Dialyse verwijdert kleine metabolieten en zouten die kunnen interfereren met niet-denaturerende PAGE
Figuur 3: Bepaling van de oligomere toestand van de menselijke MxA eiwit met niet-denaturerende PAGE en Western blotting (A) Recombinant MxA varianten ectopisch tot expressie gebracht in Vero-cellen.. De complexen van wild type MxA (tetrameer) -interface mutanten MxA (R640A), MxA (L617D) (dimeren) en MxA (M527D) migreren naar hun verwachte molecuulgewichten, ter bevestiging van hun oligomere toestand. (B) A549-cellen werden gestimuleerd met 1000 IU per ml IFN-α MxA om expressie te induceren. De endogene MxA shows een band die overeenkomt met de tetramere vorm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| buffer naam | Inhoud | Comments | ||
| lysisbuffer | 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 100 pM joodacetamide, 50 mM NaF, 1 mM Na 3 VO 4, 1% NP-40, 50 mM β-glycerofosfaat, 1 tablet per 50 ml Lysis buffer EDTA vrije protease inhibitor cocktail | Voeg iodacetamide, NaF, Na 3 VO 4, octylfenoxypolyethoxyethanol (NP-40), β-glycerofosfaat en protease inhibitor cocktail vlak voor cellysis Iodacetamide is lichtgevoelig en instabiele wanneer in oplossing. Voorkom blootstelling aan licht en los vlak voor gebruik. | ||
| dialyse buffer | 20 mM Tris-HCl (pH 6,8), 10% glycerol, 0,1% CHAPS, 0,5 mM DTT | CHAPS kan worden raplaced door andere niet-denaturerende detergenten | ||
| loopbuffer | 25 mM Tris-HCl (pH 8,3), 192 mM glycine, 0,1% CHAPS, 0,5 mM DTT | Bij pH 8,3, het meest negatief geladen eiwitten. Voor basische eiwitten, een zure pH worden gebruikt. Anders zullen de eiwitten lopen in de tegengestelde richting en gaan verloren. CHAPS kan worden vervangen door andere niet-denaturerende detergenten | ||
| monsterbuffer | 310 mM Tris-HCl (pH 6,8), 0,05% broomfenolblauw, 50% glycerol | |||
| SDS buffer | 25 mM Tris-HCl (pH 8,3), 192 mM glycine, 0,1% SDS | |||
| blotbuffer | 25 mM Tris, 192 mM glycine, 20% Methanol | Voor zeer grote complexen, kan Methanol worden weggelaten | ||
| blokkeerbuffer | 50 mM Tris-HCl (pH 7,4) 150 mM NaCl 0,05% Tween 20 5% Melkpoeder | |||
| groeimedium | Dulbecco's gemodificeerd medium 1x penicilline / streptomycine 2 mM Glutamine 10% foetaal kalfsserum | |||
Tabel 1: Buffer recepten vereist voor niet-denaturerende PAGE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier beschrijven we een eenvoudige methode die de snelle bepaling van de oligomere toestand van eiwitten in zoogdiercellen tot expressie gebracht door niet-denaturerende PAGE gevolgd door Western blot analyse. Het grote voordeel van deze aanpak is dat de oligomere status van een bepaald eiwit kan worden bepaald uit gehele cellysaten zonder voorafgaande eiwitzuivering. Dit kan belangrijk zijn voor eiwitten die oligomeriseren of hun functie in associatie uitoefenen met aanvullende factoren. Bovendien zijn de eiwitten nog steeds in hun natuurlijke toestand en zo verder geëxtraheerd uit de gel, kan de enzymatische activiteit of andere eiwitten functies worden bepaald en gecorreleerd met de oligomere toestand.
Een cruciaal aspect van dit protocol is de keuze van detergentia tijdens de voorbehandeling. Dit is van bijzonder belang voor eiwitten geassocieerd met cellulaire membranen. MxA lijkt voornamelijk geassocieerd met membranen van de gladde endoplasmatisch reticulum 25 19 aanwezigheid van 0,1% 3 - [(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propaansulfonaat (CHAPS) moest precipitatie van MxA tijdens gel voorkomen elektroforese. Bovendien is CHAPS geen invloed op de enzymatische activiteit van MxA zoals bepaald met gezuiverd recombinant MxA eiwit expressie in E. coli 12. Het is van groot belang dat het wasmiddel niet heeft eiwitten denatureren of verstoort eiwit-eiwit interacties tijdens lysis. Niet-denaturerende detergenten zoals NP40, octoxinol 9, digitonine en CHAPS geschikt voor solubilisatie. De keuze van het detergens en de concentratie moet empirisch worden bepaald. Het wasmiddel kan ook van invloed zijn downstream-experimenten bijvoorbeeld voor bepaalde assays het wasmiddel moet wordenverwijderd die gemakkelijk wordt bereikt met CHAPS door dialyse, maar niet met octoxinol 9 26.
Aangezien de beschreven methode analyseert eiwitten van cellysaten onder niet-denaturerende omstandigheden, zonder voorafgaande zuivering van de eiwitten vereist. Dit is een voordeel aangezien zuivering van recombinante eiwitten vereist soms buffer optimalisaties door toevoeging van hoge zouten en andere toevoegingen te voorkomen dat het eiwit van aggregatie of precipitatie. Echter kunnen deze additieven en hoge zoutconcentraties gevolgen voor de oligomerisatie van het eiwit die niet noodzakelijk zijn natuurlijke staat zou lijken te hebben. Vooral in het geval van de menselijke MxA eiwit, de zoutconcentratie en de aanwezigheid van nucleotiden spelen een cruciale rol in de vorming van hogere oligomere toestanden 27. In cellysaten worden eiwitten gemakkelijker gestabiliseerd omdat de cellulaire stabilisatiefactoren nog aanwezig. is het daarom mogelijk om pr analyserenotein complexen onder meer mobiele fysiologische omstandigheden (bijvoorbeeld fysiologische zoutconcentraties en pH). Dit protocol zou ook van toepassing zijn voor andere eiwitten vormen oligomeren, bijvoorbeeld voor het structureel verwante MxB of dynamin 8.
Een ander belangrijk aspect van het protocol is de bescherming van de vrije thiolgroepen voor de vorming van kunstmatige disulfidebruggen van cytoplasmatische eiwitten tijdens lysis (figuur 1) te voorkomen. Initiële experimenten toonden aan dat toevoeging van 1,4-dithiothreitol (DTT) of β-mercaptethanol niet voldoende is om de vorming van kunstmatige disulfidebindingen tijdens de voorbehandeling voorkomen. Beide reductiemiddelen beschermen thiolgroep omkeerbare vorming van disulfide bruggen. Dit zelfherstellend misschien niet voldoende om alle thiolgroepen permanent te beschermen. Bij de MxA eiwit leidt dit tot irreversibele aggregatie van het eiwit. Toevoeging van joodaceetamide dat irreversibly beschermt de vrije thiolgroepen van cysteïnen sterk verminderde aggregatie van de MxA eiwit Voorts joodaceetamide behandeling van lysaten bereid uit MxA expressie zoogdiercellen had geen invloed op de GTPase activiteit van immunogeprecipiteerd MxA vergelijking met MxA van lysaten behandeld met DTT (gegevens niet getoond ).
Andere belangrijke overwegingen voor de bepaling van het aantal protomeren per oligomeer zijn de keuze van de polyacrylamide concentratiebereik en de referentie eiwit molecuulgewicht. Het bereik van de polyacrylamide-concentratie moet eerst worden vastgesteld om maximale scheiding van de banden mogelijk bij de verwachte moleculaire massa van oligomeren. Niet-denaturerende PAGE geen SDS bevatten. SDS ontbreekt, de lading, de moleculaire massa en de vorm van het eiwit bepaalt de elektroforetische mobiliteit. Daarom is de keuze van het eiwit molecuulgewichtsmerker cruciaal. Idealiter zou een moleculair referentiegewicht ar zijnecombinant gezuiverde vorm van het eiwit van belang met bekende oligomere toestanden. Aangezien dit niet altijd beschikbaar is, moet een niet-natieve of gedenatureerde eiwit marker worden gebruikt. Aangezien MxA is aangetoond dat het associëren met andere cellulaire eiwitten zoals UAP56 of virale kerneiwitten van Thogotovirus, La Crosse virus en influenzavirus 12,28-30, we ook getest door immunokleuring met specifieke antilichamen of UAP56 of influenza-A-nucleoproteïne zogenaamde afzonderlijke co met MxA op de niet-denaturerende gels PA. Maar we vonden geen aanwijzingen voor de vorming van MxA hetero-oligomeren. Dit is waarschijnlijk te wijten aan het feit dat MxA-UAP56 en MxA-nucleoproteïne interacties van lage affiniteit 12,24. Bovendien zou de fractie van MxA eiwitten associëren met UAP56 of virale kerneiwitten zeer lage en dus moeilijk te detecteren met deze methode.
Verder is het belangrijk om rekening te houden met de pKa van het eiwit te analyseren. In de beschreven niet-denatijdens PAGE protocol worden de eiwitten door elektroforese bij pH 8,3. De meeste eiwitten negatief geladen bij deze pH. Echter, basische eiwitten vertonen een positieve netto lading bij pH 8,3 en dan loopt in de tegengestelde richting. Bijgevolg is het belangrijk, voor de analyse van basische eiwitten om de pH van de loopbuffer aanpassen aan een algemene negatieve lading van het eiwit garanderen.
Samengenomen geven we hier een protocol voor de snelle beoordeling van de oligomere toestand van eiwitten tot expressie gebracht in zoogdierlijke cellen zonder de noodzaak van voorafgaande zuivering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Units, 10K MWCO, 0.5 ml | Thermo Fisher Scientific | 69570 | Pre-equilibrate in dialysis buffer (if Glycerol removal is desired) Can be self-made according to Fiala et al. 2011 |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, | Bio-Rad | 456-1083 | Pre-run in running buffer to adjust buffer system |
| cOmplete, Mini, EDTA-free | Roche | 11836170001 | use 1 tablet per 50 ml |
| PBS, pH 7.4 bottle a 500 ml Gibco | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| Ponceau S solution | Sigma-Aldrich | P7170 | TOXIC wear gloves and protect eyes |
| NativeMark Unstained Protein Standard 50 µl | Invitrogen | P/N 57030 | load 5 µl/well |
| A549 cells | ATCC | ATCC CCL185 | Grow in growth medium (see Table 1) |
| Vero cells | ATCC | ATCC CCL81 | Grow in growth medium (see Table 1) |
| anti-Mx1 antibody | Novus Biologicals | H00004599_D01P | Use at a 1:1,000 dilution |
| ECL Anti-rabbit IgG, Horseradish Peroxidase linked whole antibody (from donkey) | GE-Healthcare | NA934V | Use at a 1:10,000 dilution |
| 0.5% Trypsin-EDTA (1x) Life Technologies | Thermo Fisher | 15400-054 | |
| Iodoacetamide 5 g | Sigma-Aldrich | I-6125 | stock 100 mM |
| Bromphenolblue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| DMEM +4.5g/l Gluc,+L-Glut,+Pyruvate life technologies | Thermo Fisher Scientific | 41966-029 | |
| Pen Strep 100 x 100ml life technologies | Thermo Fisher Scientific | 15140 - 130 | |
| Glutamax 100x Stock, 100 ml life technologies | Thermo Fisher Scientific | 350500-038 | |
| Fetal Bovine Serum, Dialyzed , US Origin 500 ml Gibco Lot:42G9552K | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| Cellulose filter paper | Bio-Rad | 1703965 | |
| PVDF blotting membrane | GE-Healthcare | 10600022 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Biosolve | 0020092391BS | |
| sodium fluoride (NaF) | Sigma Aldrich | S-7920 | |
| NP-40 | Calbiochem | 492015 | |
| cOmplete, Mini, EDTA-free | Roche | 11836170001 | |
| Tween 20 | Calbiochem | 6555204 | |
| CHAPS 10% solution | Amresco | N907 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | 43819 | |
| Glycine | Biosolve | 0007132391BS | |
| sodium orthovanadate (Na3VO4) | Sigma Aldrich | 450243 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G7757 | |
| β-Glycerophospate | Sigma Aldrich | G9422 | |
| Milk powder | Migros/Switzerland | ||
| Methanol | Millipore | 1.06009 | |
| sodium cloride (NaCl) | Sigma Aldrich | 71380 | |
| magnesium chloride (MgCl2) | Amresco | 288 | |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Sigma Aldrich | L4509 | |
| sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | S-8045 |
References
- Baisamy, L., Jurisch, N., Diviani, D. Leucine zipper-mediated homo-oligomerization regulates the Rho-GEF activity of AKAP-Lbc. J Biol Chem. 280, 15405-15412 (2005).
- Chen, C. P., Posy, S., Ben-Shaul, A., Shapiro, L., Honig, B. H. Specificity of cell-cell adhesion by classical cadherins: Critical role for low-affinity dimerization through beta-strand swapping. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 8531-8536 (2005).
- Jackson-Fisher, A. J., Chitikila, C., Mitra, M., Pugh, B. F. A role for TBP dimerization in preventing unregulated gene expression. Mol Cell. 3, 717-727 (1999).
- Torshin, I. Activating oligomerization as intermediate level of signal transduction: analysis of protein-protein contacts and active sites in several glycolytic enzymes. Front Biosci. 4, 557-570 (1999).
- Goodsell, D. S., Olson, A. J. Structural symmetry and protein function. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 29, 105-153 (2000).
- Flydal, M. I., Martinez, A. Phenylalanine hydroxylase: function, structure, and regulation. IUBMB Life. 65, 341-349 (2013).
- Haller, O., Kochs, G. Human MxA protein: an interferon-induced dynamin-like GTPase with broad antiviral activity. J Interferon Cytokine Res. 31, 79-87 (2011).
- Haller, O., Staeheli, P., Schwemmle, M., Kochs, G. Mx GTPases: dynamin-like antiviral machines of innate immunity. Trends Microbiol. 23, 154-163 (2015).
- Di Paolo, C., Hefti, H. P., Meli, M., Landis, H., Pavlovic, J. Intramolecular backfolding of the carboxyl-terminal end of MxA protein is a prerequisite for its oligomerization. J Biol Chem. 274, 32071-32078 (1999).
- Janzen, C., Kochs, G., Haller, O. A monomeric GTPase-negative MxA mutant with antiviral activity. J Virol. 74, 8202-8206 (2000).
- Gao, S., et al. Structure of myxovirus resistance protein a reveals intra- and intermolecular domain interactions required for the antiviral function. Immunity. 35, 514-525 (2011).
- Nigg, P. E., Pavlovic, J. Oligomerization and GTP-binding Requirements of MxA for Viral Target Recognition and Antiviral Activity against Influenza A Virus. J Biol Chem. 290, 29893-29906 (2015).
- Gao, S., et al. Structural basis of oligomerization in the stalk region of dynamin-like MxA. Nature. 465, 502-506 (2010).
- Ghosh, I., Hamilton, A. D., Regan, L. Antiparallel leucine zipper-directed protein reassembly: Application to the green fluorescent protein. J Am Chem Soc. 122, 5658-5659 (2000).
- Patching, S. G. Surface plasmon resonance spectroscopy for characterisation of membrane protein-ligand interactions and its potential for drug discovery. Biochim Biophys Acta. 1838, 43-55 (2014).
- Kenworthy, A. K. Imaging protein-protein interactions using fluorescence resonance energy transfer microscopy. Methods. 24, 289-296 (2001).
- Wyatt, P. J. Light-Scattering and the Absolute Characterization of Macromolecules. Analytica Chimica Acta. 272 (93), 1-40 (1993).
- Howlett, G. J., Minton, A. P., Rivas, G. Analytical ultracentrifugation for the study of protein association and assembly. Curr Opin Chem Biol. 10, 430-436 (2006).
- Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates. J Vis Exp. , (2011).
- Zou, H., Li, Y., Liu, X., Wang, X. An APAF-1.cytochrome c multimeric complex is a functional apoptosome that activates procaspase-9. J Biol Chem. 274, 11549-11556 (1999).
- Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal Biochem. 217, 220-230 (1994).
- Walker, J. M. Nondenaturing polyacrylamide gel electrophoresis of proteins. Methods Mol Biol. 32, 17-22 (1994).
- Stoscheck, C. M. Quantitation of protein. Methods Enzymol. 182, 50-68 (1990).
- Wisskirchen, C., Ludersdorfer, T. H., Muller, D. A., Moritz, E., Pavlovic, J. Interferon-induced antiviral protein MxA interacts with the cellular RNA helicases UAP56 and URH49. J Biol Chem. 286, 34743-34751 (2011).
- Stertz, S., et al. Interferon-induced, antiviral human MxA protein localizes to a distinct subcompartment of the smooth endoplasmic reticulum. J Interferon Cytokine Res. 26, 650-660 (2006).
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochim Biophys Acta. 1666, 105-117 (2004).
- Kochs, G., Haener, M., Aebi, U., Haller, O. Self-assembly of human MxA GTPase into highly ordered dynamin-like oligomers. J Biol Chem. 277, 14172-14176 (2002).
- Kochs, G., Haller, O. GTP-bound human MxA protein interacts with the nucleocapsids of Thogoto virus (Orthomyxoviridae). J Biol Chem. 274, 4370-4376 (1999).
- Reichelt, M., Stertz, S., Krijnse-Locker, J., Haller, O., Kochs, G. Missorting of LaCrosse virus nucleocapsid protein by the interferon-induced MxA GTPase involves smooth ER membranes. Traffic. 5, 772-784 (2004).
- Wisskirchen, C., Ludersdorfer, T. H., Muller, D. A., Moritz, E., Pavlovic, J. The cellular RNA helicase UAP56 is required for prevention of double-stranded RNA formation during influenza A virus infection. J Virol. 85, 8646-8655 (2011).
