Introduction
Die quartäre Struktur eines Proteins spielt eine entscheidende Rolle in vielen zellulären Prozessen. Signalwege, Genexpression und Enzym Aktivierung / Deaktivierung alle verlassen sich auf die korrekte Montage von Proteinkomplexen 1-4. Dieser Prozess auch als Homo- oder Hetero-Oligomerisierung bekannt, ist auf irreversible kovalente oder reversible elektrostatische und hydrophobe Protein-Protein-Wechselwirkungen. Oligomerisierung nicht nur diversifiziert die verschiedenen zellulären Prozessen , ohne die Genomgröße zunimmt, sondern bietet auch eine Strategie für Proteine stabile Komplexe zu bauen , die beständiger sind gegenüber Denaturierung und Abbau 5. Defekte in Oligomerisierung wirken sich auf die Funktion von Proteinen und können zur Entwicklung von Krankheiten führen. Beispielsweise bildet das Enzym Phenylalaninhydroxylase eines tetrameren Komplexes. Einige Mutationen innerhalb des Proteinkomplexes können die Tetramerbildung schwächen und führen zu der Krankheit Phenylketonurie 6.
7 ausübt. Es gehört zur Superfamilie der dynamin artigen großen GTPasen und hat die Fähigkeit , in vitro 8 große oligomere Strukturen zu bilden. Die Oligomerisierung wurde vorgeschlagen , 9,10 M · A vor einem schnellen Abbau zu schützen. Trotz intensiver Bemühungen von vielen Forschungsgruppen bleibt der molekulare Wirkmechanismus weitgehend ungeklärt und die Rolle des Oligomerisierungszustand von M · A für seine antivirale Funktion ist umstritten 9,11,12. In dieser Hinsicht Gao und Mitarbeitern vorgeschlagen , ein Modell , in dem M · A durch die Interaktion mit viralen Nukleoproteine in Form von großen ringartigen oligomeren Strukturen 11 seine antivirale Aktivität ausübt. Jedoch in jüngerer Zeit zeigten wir , dass MxA Dimere antivirale Aktivität aufweisen und mit dem Nukleoprotein von Influenza A Virus 12 interagieren. Basierend auf der Kristallstruktur von M · A, Gao und Mitarbeitern identifiziert mehrere Aminosäurereste in den Grenzflächenbereichen , die 11,13 für die Oligomerisierung in vitro und seine antivirale Funktion wichtig sind. Daher wird, um zu erläutern, welche oligomere Zustand MxA antivirale Aktivität ausübt, haben wir versucht, ein einfaches Protokoll zu schaffen, um schnell die oligmeric Zustand MxA Schnittstelle Mutanten in menschlichen Zellen als auch ausgedrückt bestimmen als endogene MxA nach IFN & alpha; Anregung ausgedrückt.
Obwohl es viele Techniken gibt, die die Wechselwirkung zwischen Proteinen zu untersuchen , wie die Split-Green Fluorescent Protein (split-GFP) Komplementations - Assay 14, Oberflächenplasmonresonanz 15 und Förster - Resonanzenergietransfer (FRET) 16 häufig verwendet werden, bieten sie nicht Informationen über die genaue Stöchiometrie eines oligomeren Proteinkomplex. Zur Untersuchung dieser besonderen Aspekt Techniken wieMehrwinkellichtstreuung (MALS) 17 und analytische Ultrazentrifugation 18 sind sehr nützlich. Normalerweise analysiert die Proteine mit Hilfe dieser Methoden sind gereinigte Proteine. Oligomerisierungsverfahren kann auch auf anderen zellulären Faktoren abhängen. Wenn diese Faktoren nicht bekannt sind, ist die Analyse schwieriger. Zusätzlich sind einige Proteine schwierig in E. auszudrücken coli und zu reinigen. Daher sind diese Verfahren nicht die optimale Wahl Protein Oligomerisierung in der zellulären Umgebung zu analysieren. Zusätzlich erfordern diese Techniken teure Instrumente, die nicht leicht verfügbar sind.
Nicht-denaturierende Polyacrylamid - Gelelektrophorese (PAGE), size exclusion chromatography oder chemische Vernetzung durch herkömmliche Natriumdodecylsulfat (SDS) -PAGE gefolgt sind nützliche Werkzeuge für die Charakterisierung der Bildung von Oligomeren aus Zelllysaten 2,19,20. Diese Methoden erfordern keine spezielle Ausrüstung und kann leicht pe seinin einem Standard-Labor rformed. Wir haben uns zunächst verschiedene chemische Vernetzungsprotokolle ausgewertet, die invariant führte zu unspezifischen Aggregation und Ausfällung von M · A. Deshalb testeten wir als nächstes nicht denaturierende PAGE-Protokolle. Als nicht-denaturierende PAGE die Verwendung von SDS ausschließt, hängt die Migration von Proteinen auf ihre Mutter Ladung. Blau-native PAGE verwendet Coomassie Brilliant Blue G250 Proteine zu laden mit einer insgesamt negativen Ladung, ähnlich wie SDS, aber nicht denaturiert das Protein 21. Leider Coomassie Brilliant Blue Präzipitate in Gegenwart hoher Salze und divalente Kationen (zB Mg 2+) , die häufig in Lysepuffer enthalten sind. In Abhängigkeit von den verwendeten Puffer, kann es schwierig sein, die Probe ohne weitere Optimierung von Schritten zu analysieren, die eine Wirkung auf dem oligomeren Proteinkomplex haben.
Hier präsentieren wir ein einfaches Protokoll basiert auf einem zuvor veröffentlichten Verfahren 22 , um zu bestimmen OligomerisierungMensch MxA Protein aus Zellysaten abgeleitet unter Verwendung von nicht-denaturierende PAGE.
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Protocol
Hinweis: Dieses Protokoll basiert auf der zuvor veröffentlichten nicht-denaturierende PAGE - Protokoll 12. entweder mit Vero-Zellen überexprimieren MxA oder IFN-α-stimulierten A549-Zellen, die endogene MxA In dieser Studie wurde die oligomeren Zustand des MxA Proteins bewertet. Das Protokoll unten beschrieben können die oligomeren Zustand jedes Protein zusätzlich zu MxA zu analysieren. Jedoch kann eine weitere Optimierung erforderlich.
1. Herstellung der Zellen-Lysate für die nicht-denaturierende PAGE
HINWEIS: Für die Analyse wurden die oligomeren Zustand des menschlichen MxA Proteins entweder Vero oder A549 - Zellen, 1,0 x 10 6 Zellen geerntet. Je nach Zelltyp oder der Abundanz des Proteins zu analysieren, sollte die Zellzahl eingestellt werden. Es ist auch wichtig, die Lysepuffer von Belichtung zu schützen, sobald die lichtempfindliche Iodacetamid hinzugefügt wird.
- Seed 0,3 x 10 6 A549 oder Vero - Zellen pro Well inbis 6 gut Gerichten. Halten Sie die Zellen in 2 ml Wachstumsmedium pro Vertiefung (siehe Tabelle 1). Inkubiere Zellen über Nacht in einem Zellkulturbrutschrank (37 ° C, 5% CO 2).
- Ernte der Zellen durch Waschen mit 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und lösen durch Zugabe von 0,5 ml von 0,25% Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) 1x Lösung für ca. 5 min bei Raumtemperatur.
- Sobald die Zellen aus der Schale lösen, 0,5 ml Wachstumsmedium hinzufügen und sorgfältig durch Auf- und Abpipettieren mischen.
- Übertragen Sie die Zellen jeder Vertiefung in ein 2-ml-Röhrchen und Pellet sie eine Tischzentrifuge mit (5000 × g, 4 ° C, 5 min).
- Entfernen Sie vorsichtig den Überstand mit einer Pipette ohne das Zellpellet zu stören.
- Waschen Sie die Zellen mit 1 ml eiskaltem PBS durch vorsichtiges Pipettieren der Zellsuspension nach oben und unten.
- Pellet-Zellen in einer Tischzentrifuge (5000 x g, 4 ° C, 5 min).
- Entfernen Sie vorsichtig den Überstand von wi Pipettierenthout des Zellpellets lösen.
- Die Zellen in 200 ul eiskaltem Lysepuffer (siehe Tabelle 1) durch Pipettieren von oben und unten und auf Eis gelegt.
- Sofort schützen Lysat aus Licht, das durch die Rohre Abdeckung Zinnfolie mit und für 30 Minuten auf Eis inkubiert.
HINWEIS: Nach Inkubation für 30 min auf Eis, ist es nicht mehr notwendig, die Lysat aus Belichtung zu schützen, da der Schutz der freien Thiolgruppen irreversibel ist. - Entfernen von Zelltrümmern durch Zentrifugation in einer vorgekühlten Tischzentrifuge (13.000 · g, 4 ° C, 20 min).
- Dialyse Spalten in Dialysepuffer (Tabelle 1) in den Kühlraum bei 4 ° C für 20 min während der Zentrifugationsschritt äquilibrieren. Verwenden Sie eine Spalte mit einem Molekulargewicht abgeschnitten von 10.000.
- Bringen Sie die Spalten mit einem Schwimmer Boje und legte sie in einen Becher mit Dialysepuffer gefüllt. Um sicherzustellen, leichtem Rühren Magnetrührer benutzen. Die Membran nicht berühren.
HINWEIS: dialysist , kann Spalten aus 1,5 - ml - Röhrchen nach dem Protokoll von Fiala und Mitarbeiter 19 beschrieben erworben oder hergestellt werden.
- Bringen Sie die Spalten mit einem Schwimmer Boje und legte sie in einen Becher mit Dialysepuffer gefüllt. Um sicherzustellen, leichtem Rühren Magnetrührer benutzen. Die Membran nicht berühren.
- Entfernen Sie die Spalten aus dem Dialysepuffer und dem Schwimmer Boje. Übertragen Sie die gelöscht Lysate in die vorbereitete Dialysesäule durch Pipettieren, ohne die Membran zu berühren. Bringen Sie die Spalten mit einem Schwimmer Boje und legte sie zurück in den Becher mit Dialysepuffer gefüllt.
- Dialysiere das Lysat in einem Becher eiskaltes Dialysepuffer (Tabelle 1) für mindestens 4 Stunden (oder vorzugsweise über Nacht) bei 4 ° C enthalten , sorgfältig , während mit einem Magnetrührer gerührt wurde. Verwenden mindestens 100 ml Dialysepuffer bei einem 200 & mgr; l Lysat.
- Übertragen Sie die dialysiert Probe in ein 1,5-ml-Röhrchen. Entfernen Präzipitate durch Zentrifugation in einer Tischzentrifuge (13.000 · g, 4 ° C, 20 min). die Dissoziation des oligomere Proteinkomplexe weiterhin mit dem Protokoll (Abschnitt 2) unmittelbar nach der Dialyse zu vermeiden. Nicht einfrierendie vorbereiteten Lysaten.
2. Elektrophorese
HINWEIS: Die Elektrophorese wurde wie zuvor 22 mit einigen Modifikationen beschrieben durchgeführt. In dem Protokoll unten beschrieben, wurden vorgegossenen Gelen mit einem Gradienten (4-15% Gradient) verwendet. Alternativ können die Gele im Labor hergestellt werden. Es ist sehr wichtig, jede Denaturierungsmittel auszuschließen, wie beispielsweise SDS die Dissoziation der oligomere Proteinkomplexe zu verhindern. Zeit der Elektrophorese wurde für die verschiedenen Oligomerisierungszustände des menschlichen MxA Protein optimiert. Jedoch kann es für andere Proteine variieren, abhängig von der Größe des oligomeren Komplex sowie dem Bereich der Trennung, die erreicht werden soll um den Komplex zu analysieren. Daher sollte die optimale Zeit der Elektrophorese empirisch bestimmt werden. Für eine optimale Auflösung der Oligomeren der Strom nicht 25 mA nicht überschreiten sollte analysiert werden.
- Montieren Sie den nicht-denaturierende PAGE-Gel in der Gelkammer. Füllen ter innere und die äußere Kammer mit vorgekühlten Laufpuffer (Tabelle 1).
- Pre-run das Gel mit vorgekühlten Laufpuffer bei 25 mA pro Gel für 15 Minuten im Kühlraum bei 4 ° C.
- Mischungs 15 ul der oben hergestellten Lysaten mit 5 & mgr; l 4x Probenpuffer (Tabelle 1). Die Probe nicht kochen.
- Last 15 ul der Probe und eine native Proteinstandard der Wahl auf dem Gel. Führen Sie das Gel bei 25 mA für 4 Stunden im Kühlraum bei 4 ° C.
HINWEIS: Bei semi-quantitativen Analysen, ein Protein Quantifizierungsprotokoll (beispielsweise ein Bradford-Test 23) kann ausgeführt werden , um Belastung von gleichen Mengen an Gesamtprotein pro Spur zu gewährleisten.
3. Western Blot
HINWEIS: Im Folgenden wird das Protokoll eines nassen Western-Blot-System. Jede Blotting-Membran verwendet werden. Aktivieren Polyvinylidenfluorid (PVDF) -Membranen in 100% Methanol vor der Äquilibrierung in Blotting-buffer. Die halbtrockene Western-Blot-Technik kann alternativ verwendet werden, jedoch hat sich für große oligomere Komplexe zu optimieren.
- Zerlegen Sie das Gel und sorgfältig übertragen sie in SDS - Puffer (Tabelle 1).
- Inkubieren für 10 Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln.
- Bereiten Sie zwei Schwämme, 4 Zellulosefilter Papierblätter und eine Blottingmembran pro Gel. Genießen sie in Blotting - Puffer (Tabelle 1).
- Montieren Sie das Sandwich wie folgt (von unten nach oben): 1 Schwamm, 2 Zellulosefilter Papierbögen, Membran, Gel, 2 Zellulosefilter Papierblätter, 1 Schwamm.
- Setzen Sie das Sandwich in den Blotting-Tank. Stellen Sie sicher, dass die Membran den Pluspol steht, während das Gel die Minus-Pol zugewandt ist.
- Füllen Sie den Löschbehälter mit vorgekühlten Blotting-Puffer.
- Blot bei 90 mA über Nacht bei 4 ° C für eine optimale Proteintransfer Ergebnisse.
- Zerlegen Sie das Sandwich und visualisieren die Proteinstandard durch die Membran in Ponc Inkubationeau S-Lösung für 5 min bei Raumtemperatur.
- Entfärben der Membran durch sorgfältig den Ponceau S mit entsalztem Wasser gewaschen, bis Sie deutlich die Banden der Proteinstandard zu sehen.
- Markieren Sie die Bänder des Proteinstandard mit einem Stift.
Hinweis: Rest Ponceau S mit der Immunfärbung stören können. Um dies zu vermeiden, kann die Membran durch Inkubation in 0,1 M NaOH für 1 min und anschließendes Waschen mit deionisiertem Wasser entfärbt weiter. - Blockieren die Membran mit Blockierungspuffer (siehe Tabelle 1) für mindestens 1 Stunde bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C.
- Visualisieren Protein (e) von Interesse durch Immunfärbung von Antikörpern gegen das Protein unter Verwendung von analysiert werden.
HINWEIS: Die menschliche MxA Protein sichtbar gemacht wurde das Kaninchen polyklonalen Antikörper , der spezifisch für menschliches Mx1 Verwendung verdünnt 1: 1000 in Blocking - Puffer (Tabelle 1). Die Antikörperlösung wurde über Nacht bei 4 ° C inkubiert. Alternativ kann der monoklonale aNTI-MxA - Antikörper (Klon 143) können verwendet werden (Daten nicht gezeigt) 24.
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Representative Results
Die Verwendung von nicht-denaturierende PAGE, analysierten wir die oligomere Zustand des menschlichen Wildtyp M · A, die dimeren Schnittstelle Mutanten M · A (R640A) und M · A (L617D) sowie die monomeren Schnittstelle Mutant M · A (M527D) aus Zelllysaten 12. Zellen wurden in einem Puffer, der 1% Octylphenoxypolyethoxyethanol lysiert (NP-40) und Iodacetamid Protein Solubilisierung und zum Schutz der freien Thiolgruppen zu gewährleisten (siehe Abbildung 1). Wie zuvor beschrieben, Salz und kleinen Metaboliten wurden durch Dialyse 19 entfernt. Protein-Trennung wurde durch nicht-denaturierende PAGE durchgeführt. Um eine effiziente Western-Blotting zu erleichtern, wurde das Gel in SDS-Puffer inkubiert, bevor Blotting. Die M · A-Proteine wurden durch Immunfärbung unter Verwendung eines polyklonalen Kaninchen-Antikörper, der gegen MxA sichtbar gemacht. Der Workflow wird in Abbildung 2 beschrieben.
Um den oligomeren Zustand des endogenen humanen MxA Protein von IFN-α vergleichen ; stimulierten A549-Zellen, transfizierten wir Vero-Zellen (fehlende endogene M · A) mit rekombinanten Wildtyp-, monomeren und dimeren M · A-Varianten. Diese rekombinanten Wildtyp, monomeren und dimeren M · A - Varianten gebildet stabile Tetramere, Monomere und Dimere, jeweils im Vergleich zu einem ungefärbten native Protein - Marker (3A). Daher verwendeten wir diese rekombinanten Proteine die oligomere Zustand endogenen humanen MxA - Proteins aus IFN-α stimulierten A549 - Zellen abgeleitet zu beurteilen. 3B zeigt , dass die Größe des MxA in Lysaten von IFN-α-stimulierten A549 - Zellen zu einem Tetramer entspricht.
Zusammengenommen beschreiben wir eine Methode, um die oligomeren Zustand des humanen MxA-Proteins aus Zelllysat zu bestimmen. Unsere nicht-denaturierende PAGE Ansatz kann auch die oligomeren Zustand anderer oligomerer Proteinkomplexe zu beurteilen, verwendet werden.
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Abb . 1: Struktur und Reaktionsschema von iodoacetamide Iodacetamid schützt irreversibel die Thiolgruppe der freien Cysteine durch Bildung einer Thioetherbindung. Diese stabile Modifikation ergibt sich aus der nucleophilen Substitution des Jods mit dem Schwefelatom vom Cystein. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Fig . 2: Workflow - Diagramm von nicht-denaturierende PAGE Eine systematische Darstellung des nicht-denaturierende PAGE Ansatz von Zelllysaten. Während Zelllyse solubilisieren Detergentien die Proteine und Thiol-Gruppen durch Iodacetamid geschützt Proteinaggregation verhindern. Dialyse entfernt kleine Stoffwechselprodukte und Salze, die mit nicht-denaturierende PAGE stören könnten
Abbildung 3: Bestimmung des oligomeren Zustand des humanen MxA - Proteins unter Verwendung nicht-denaturierende PAGE und Western Blotting (A) Recombinant MxA Varianten ektopisch in Vero - Zellen exprimiert.. Die Komplexe von Wildtyp-M · A (Tetramer) Schnittstelle Mutanten M · A (R640A), M · A (L617D) (Dimere) und M · A (M527D) mit ihrem erwarteten Molekulargewichte wandern, deren Oligomerisierungsgrad bestätigt. (B) A549 - Zellen wurden mit 1.000 IU pro ml IFN-α stimuliert MxA - Expression zu induzieren. Die endogene M · A shows eine Band , die an die tetramere Form entspricht. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Buffer Name | Inhalt | Bemerkungen | ||
| Lysepuffer | 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM MgCl 2, 100 & mgr; M Iodacetamid, 50 mM NaF, 1 mM Na 3 VO 4, 1% NP-40, 50 mM β-Glycerophosphat, 1 Tablette pro 50 ml Lysepuffer EDTA frei, Protease-Inhibitor-Cocktail | Hinzufügen Iodacetamid, NaF, Na 3 VO 4, Octylphenoxypolyethoxyethanol (NP-40), β-Glycerophosphat und Protease inhibitor Cocktail direkt vor der Zelllyse Iodacetamid ist lichtempfindlich und instabil, wenn sie in Lösung. Verhindern Sie Belichtung und lösen direkt vor dem Gebrauch. | ||
| Dialysepuffer | 20 mM Tris-HCl (pH 6,8), 10% Glycerin, 0,1% CHAPS, 0,5 mM DTT | CHAPS kann durch andere nicht-denaturierenden Detergenzien raplaced werden | ||
| Laufpuffer | 25 mM Tris-HCl (pH 8,3), 192 mM Glycin, 0,1% CHAPS, 0,5 mM DTT | Bei pH 8,3, werden die meisten Proteine negativ geladen. Jedoch für basische Proteine, sollte ein saurer pH-Wert verwendet werden. Andernfalls werden die Proteine in die entgegengesetzte Richtung laufen und gehen verloren. CHAPS kann durch andere nicht-denaturierenden Detergenzien ersetzt werden | ||
| Probenpuffer | 310 mM Tris-HCl (pH 6,8), 0,05% Bromphenolblau, 50% Glycerin | |||
| SDS-Puffer | 25 mM Tris-HCl (pH 8,3), 192 mM Glycin, 0,1% SDS | |||
| Blottingpuffer | 25 mM Tris, 192 mM Glycin, 20% Methanol | Für sehr große Komplexe können Methanol weggelassen werden | ||
| Blockierungspuffer | 50 mM Tris-HCl (pH 7,4) 150 mM NaCl 0,05% Tween 20 5% Milchpulver | |||
| Das Wachstumsmedium | Dulbecco modifiziertem Medium 1x Penicillin / Streptomycin 2 mM Glutamine 10% fötales Kälberserum | |||
Tabelle 1: Puffer Rezepte für Nicht-denaturierende PAGE erforderlich.
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Discussion
Hier beschreiben wir eine einfache Methode, die in Säugetierzellen durch nicht-denaturierende PAGE, gefolgt von Western-Blot-Analyse ausgedrückt die schnelle Bestimmung des oligomeren Zustand von Proteinen ermöglicht. Der Hauptvorteil dieses Ansatzes ist, dass die oligomeren Zustand eines bestimmten Proteins können ohne vorherige Proteinreinigung aus ganzen Zelllysaten bestimmt werden. Dies kann für Proteine wichtig sein, die ihre Funktion in Verbindung mit Hilfsfaktoren oligomerisieren oder ausüben. Darüber hinaus sind die Proteine noch in ihrem nativen Zustand und wenn weiter aus dem Gel extrahiert werden, kann die enzymatische Aktivität oder andere Proteinfunktionen ermittelt und dem oligomeren Zustand korreliert werden.
Ein kritischer Aspekt dieses Protokolls ist die Wahl der Detergentien bei der Probenvorbereitung. Dies ist von besonderer Bedeutung für Proteine mit Zellmembranen assoziiert. M · A erscheint in erster Linie mit Membranen der glatten endoplasmatischen Retikulum werden 25 19 die Anwesenheit von 0,1% 3 - [(3-Cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propansulfonat (CHAPS) war erforderlich , die Ausfällung von MxA während Gels zu verhindern , Elektrophorese. Darüber hinaus bedeutet CHAPS nicht mit der enzymatischen Aktivität von MxA interferieren wie mit gereinigtem rekombinantem Protein M · A in E. ausgedrückt bestimmt coli 12. Es ist von großer Bedeutung, dass die Reinigungsmittel nicht die Proteine nicht denaturiert oder stört Protein-Protein-Wechselwirkungen während der Lyse. Nicht-denaturierenden Detergenzien wie NP40, Octoxinol 9, Digitonin und CHAPS sind geeignet zur Solubilisierung. Die Wahl des Detergens und seine Konzentration sollte empirisch bestimmt werden. Das Waschmittel kann auch Einfluss auf nachgeschaltete Experimente zB für bestimmte Assays das Waschmittel muss seinentfernt , die leicht mit CHAPS durch Dialyse erreicht, aber nicht mit Octoxinol 9 26.
Da das beschriebene Verfahren Proteinen aus Zellysaten unter nicht-denaturierenden Bedingungen, keine vorherige Reinigung der Proteine erforderlich ist, abgeleitet analysiert. Dies ist ein Vorteil, da die Reinigung von rekombinanten Proteinen manchmal Puffer Optimierungen durch die Zugabe von hohen Salze und andere Additive zu verhindern, dass das Protein aus Aggregation oder Präzipitation erfordert. Allerdings könnten diese Additive und die hohen Salzkonzentrationen haben einen Einfluss auf die Oligomerisierung des Proteins, die nicht notwendigerweise in ihrem natürlichen Zustand ähneln könnte. Insbesondere im Fall des humanen MxA - Proteins, die Salzkonzentration und das Vorliegen von Nukleotiden , spielen eine entscheidende Rolle bei der Bildung von höheren oligomeren Zustände 27. In den Zelllysaten Proteine leichter stabilisiert werden, da die zelluläre Stabilisierungsfaktoren noch vorhanden sind. Daher ist es möglich, zu analysieren protein Komplexe unter mehr zellphysiologischen Bedingungen (zB physiologische Salzkonzentrationen und pH - Wert). Dieses Protokoll ist auch anwendbar für andere Proteine Oligomere, beispielsweise für die strukturell verwandten MxB oder dynamin 8 bildet.
Ein weiterer wichtiger Aspekt des Protokolls ist der Schutz der freien Thiolgruppen , die Bildung von künstlichen Disulfidbrücken zytoplasmatischer Proteine während der Lyse (Abbildung 1) zu verhindern. Anfängliche Experimente zeigten, dass die Zugabe von 1,4-Dithiothreitol (DTT) oder β-mercaptethanol nicht ausreicht, um die Bildung von künstlichen Disulfidbindungen während der Probenherstellung zu vermeiden. Beide Reduktionsmittel schützen die Thiolgruppe reversibel von Disulfidbrücken bilden. Diese reversible Schutz möglicherweise nicht ausreichend sein, um alle Thiolgruppen dauerhaft zu schützen. Im Falle des MxA Protein, führt dies zu einer irreversiblen Aggregation des Proteins. Die Zugabe von Iodacetamid die irreversibly die freien Thiolgruppen von Cysteinen schützt stark reduziert die Aggregation des MxA Proteins Weiterhin Iodacetamid Behandlung von Lysaten, die aus M · A hatte auf der GTPase-Aktivität von immunpräzipitierten MxA keinen Einfluss Säugerzellen exprimiert, wenn sie MxA aus Lysaten mit DTT behandelt wurden, verglichen (Daten nicht gezeigt ).
Andere wichtige Überlegungen für die genaue Bestimmung der Anzahl von Protomere in einem Oligomeren die Wahl des Polyacrylamid-Konzentrationsbereich sowie das Protein Molekulargewicht Referenz. Der Bereich der Polyacrylamid-Konzentration festgestellt werden sollte zuerst maximale Trennung der Banden mit der erwarteten Molekularmasse von Oligomeren zu ermöglichen. Nicht-denaturierende PAGE enthält keine SDS. SDS fehlt die Ladung, Molekülmasse und die Form des Proteins bestimmt seine elektrophoretische Mobilität. Daher ist die Wahl des Protein-Molekulargewichtsmarker von entscheidender Bedeutung. Idealerweise wäre ein Molekulargewicht Referenz arecombinant gereinigte Form des Proteins von Interesse mit bekannten Oligomerisierungszustände. Da dies nicht immer zur Verfügung steht, sollte ein nicht-denaturierte oder native Protein-Marker verwendet werden. Da MxA mit anderen zellulären Proteinen wie UAP56 oder viralen Kernproteinen Thogotovirus, La Crosse Virus oder Influenzavirus 12,28-30 wir auch durch Immunfärbung spezifische Antikörper ob UAP56 Verwendung getestet gezeigt wurde , assoziierten oder Nukleoprotein Influenza würde zusammen separaten mit M · A auf den nicht-denaturierenden Gelen PA. Allerdings fanden wir keine Hinweise auf die Bildung von M · A Hetero-Oligomere. Dies ist wahrscheinlich auf die Tatsache zurückzuführen, dass MxA-UAP56 und MxA-Nucleoprotein - Wechselwirkungen sind von geringer Affinität 12,24. Außerdem könnte der Anteil des MxA Proteins mit UAP56 oder viralen Nukleoproteine Assoziieren sehr niedrig und daher schwierig durch dieses Verfahren nachzuweisen.
Ferner ist es wichtig, den pKa des Proteins zu berücksichtigen, analysiert werden. In dem beschriebenen nicht denaturing PAGE-Protokoll werden die Proteine durch Elektrophorese bei pH 8,3 abgetrennt. Die meisten Proteine bei diesem pH negativ geladen. Jedoch weisen basische Proteine eine positive Nettoladung bei pH 8,3 und wird daher in die entgegengesetzte Richtung laufen. Als Folge ist es wichtig, für die Analyse von basischen Proteinen, den pH des Laufpuffers einstellen eine negative Gesamtladung des Proteins zu gewährleisten.
Zusammengenommen stellen wir hier ein Protokoll für die schnelle Beurteilung des oligomeren Zustand von Proteinen in Säugerzellen, ohne die Notwendigkeit vorheriger Reinigung ausgedrückt.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Units, 10K MWCO, 0.5 ml | Thermo Fisher Scientific | 69570 | Pre-equilibrate in dialysis buffer (if Glycerol removal is desired) Can be self-made according to Fiala et al. 2011 |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, | Bio-Rad | 456-1083 | Pre-run in running buffer to adjust buffer system |
| cOmplete, Mini, EDTA-free | Roche | 11836170001 | use 1 tablet per 50 ml |
| PBS, pH 7.4 bottle a 500 ml Gibco | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| Ponceau S solution | Sigma-Aldrich | P7170 | TOXIC wear gloves and protect eyes |
| NativeMark Unstained Protein Standard 50 µl | Invitrogen | P/N 57030 | load 5 µl/well |
| A549 cells | ATCC | ATCC CCL185 | Grow in growth medium (see Table 1) |
| Vero cells | ATCC | ATCC CCL81 | Grow in growth medium (see Table 1) |
| anti-Mx1 antibody | Novus Biologicals | H00004599_D01P | Use at a 1:1,000 dilution |
| ECL Anti-rabbit IgG, Horseradish Peroxidase linked whole antibody (from donkey) | GE-Healthcare | NA934V | Use at a 1:10,000 dilution |
| 0.5% Trypsin-EDTA (1x) Life Technologies | Thermo Fisher | 15400-054 | |
| Iodoacetamide 5 g | Sigma-Aldrich | I-6125 | stock 100 mM |
| Bromphenolblue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| DMEM +4.5g/l Gluc,+L-Glut,+Pyruvate life technologies | Thermo Fisher Scientific | 41966-029 | |
| Pen Strep 100 x 100ml life technologies | Thermo Fisher Scientific | 15140 - 130 | |
| Glutamax 100x Stock, 100 ml life technologies | Thermo Fisher Scientific | 350500-038 | |
| Fetal Bovine Serum, Dialyzed , US Origin 500 ml Gibco Lot:42G9552K | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| Cellulose filter paper | Bio-Rad | 1703965 | |
| PVDF blotting membrane | GE-Healthcare | 10600022 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Biosolve | 0020092391BS | |
| sodium fluoride (NaF) | Sigma Aldrich | S-7920 | |
| NP-40 | Calbiochem | 492015 | |
| cOmplete, Mini, EDTA-free | Roche | 11836170001 | |
| Tween 20 | Calbiochem | 6555204 | |
| CHAPS 10% solution | Amresco | N907 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | 43819 | |
| Glycine | Biosolve | 0007132391BS | |
| sodium orthovanadate (Na3VO4) | Sigma Aldrich | 450243 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G7757 | |
| β-Glycerophospate | Sigma Aldrich | G9422 | |
| Milk powder | Migros/Switzerland | ||
| Methanol | Millipore | 1.06009 | |
| sodium cloride (NaCl) | Sigma Aldrich | 71380 | |
| magnesium chloride (MgCl2) | Amresco | 288 | |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Sigma Aldrich | L4509 | |
| sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | S-8045 |
References
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