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Biochemistry

मानव MXA की बहु सबयूनिट प्रोटीन परिसरों की विशेषता गैर denaturing polyacrylamide जेल-वैद्युतकणसंचलन का उपयोग

Published: October 28, 2016 doi: 10.3791/54683
Automatic Translation
1,2, 1
1Institute for Medical Virology, University of Zurich, 2Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research

Introduction

एक प्रोटीन की संरचना चतुर्धातुक कई सेलुलर प्रक्रियाओं में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। संकेत दे रास्ते, जीन अभिव्यक्ति, और एंजाइम सक्रियण / छोड़ना सभी प्रोटीन परिसरों 1-4 की उचित विधानसभा पर भरोसा करते हैं। इस प्रक्रिया को भी होमो या असमलैंगिक oligomerization के रूप में जाना अपरिवर्तनीय सहसंयोजक या प्रतिवर्ती इलेक्ट्रोस्टैटिक और हाइड्रोफोबिक प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत के कारण है। Oligomerization न केवल जीनोम आकार में वृद्धि के बिना अलग सेलुलर प्रक्रियाओं diversifies, लेकिन प्रोटीन स्थिर परिसरों कि विकृतीकरण और गिरावट 5 के प्रति अधिक प्रतिरोधी रहे हैं का निर्माण करने के लिए भी एक रणनीति है। oligomerization में दोष प्रोटीन के समारोह पर प्रभाव पड़ता है और रोगों के विकास के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, एंजाइम फेनिलएलनिन hydroxylase एक tetrameric जटिल रूपों। प्रोटीन परिसर के भीतर कुछ उत्परिवर्तन टेट्रामर गठन को कमजोर और रोग phenylketonuria 6 के लिए नेतृत्व कर सकते हैं।

7 प्रेरित एक इंटरफेरॉन (IFN) है। यह dynamin-जैसे बड़े GTPases की superfamily के अंतर्गत आता है और क्षमता विट्रो 8 में बड़े oligomeric संरचनाओं फार्म है। Oligomerization तेजी से गिरावट 9,10 से MXA की रक्षा करने के लिए सुझाव दिया गया है। कई अनुसंधान समूहों द्वारा तीव्र प्रयासों के बावजूद कार्रवाई की आणविक तंत्र काफी हद तक मायावी बनी हुई है और इसकी एंटीवायरल समारोह के लिए MXA की oligomerization राज्य की भूमिका बहस 9,11,12 के अधीन है। इस संबंध में, गाओ और सहकर्मियों एक मॉडल जहां MXA बड़े अंगूठी की तरह oligomeric संरचनाओं 11 के रूप में वायरल nucleoproteins के साथ बातचीत के द्वारा अपने एंटीवायरल गतिविधि डालती का प्रस्ताव रखा। हालांकि, हाल ही में, हम दिखा दिया कि MXA dimers एंटीवायरल गतिविधि प्रदर्शन और इन्फ्लूएंजा ए वायरस 12 के nucleoprotein के साथ बातचीत। बीMXA की क्रिस्टल संरचना पर ased, गाओ और सहकर्मियों इंटरफेस क्षेत्रों है कि इन विट्रो में अपनी oligomerization और उसके एंटीवायरल समारोह 11,13 के लिए महत्वपूर्ण हैं में कई अमीनो एसिड के अवशेष की पहचान की। इसलिए, ताकि स्पष्ट करने के लिए जो MXA की oligomeric राज्य एंटीवायरल गतिविधि डालती में, हम एक सरल प्रोटोकॉल तेजी से MXA इंटरफेस के रूप में अच्छी तरह से मानव कोशिकाओं में व्यक्त के रूप में अंतर्जात MXA IFNα उत्तेजना के बाद व्यक्त म्यूटेंट के oligmeric स्थिति का निर्धारण करने के लिए स्थापित करने की मांग की।

हालांकि कई तकनीकों है कि आमतौर पर इस तरह के विभाजन हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन के रूप में प्रोटीन के बीच बातचीत की जांच करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं देखते हैं (विभाजन GFP) पूरक परख 14, सतह plasmon अनुनाद 15 और Förster प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) 16, वे प्रदान नहीं करते एक oligomeric प्रोटीन जटिल की सटीक stoichiometry की जानकारी। इस विशेष पहलू की जांच के लिए, तकनीक जैसेबहु कोण प्रकाश बिखरने (MALS) 17 और विश्लेषणात्मक ultracentrifugation 18 बहुत उपयोगी होते हैं। आमतौर पर, प्रोटीन इन तरीकों का उपयोग कर विश्लेषण शुद्ध प्रोटीन होते हैं। Oligomerization प्रक्रियाओं को भी अन्य सेलुलर कारकों पर निर्भर हो सकता है। इन कारकों में अज्ञात हैं, विश्लेषण और अधिक कठिन है। साथ ही, कुछ प्रोटीन ई में व्यक्त करने के लिए मुश्किल हो जाता है कोलाई और शुद्ध करने के लिए। इसलिए, इन तरीकों सेलुलर वातावरण में प्रोटीन oligomerization विश्लेषण करने के लिए इष्टतम पसंद नहीं कर रहे हैं। इसके अलावा, इन तकनीकों के महंगे उपकरण है जो आसानी से उपलब्ध नहीं हैं की आवश्यकता होती है।

गैर denaturing जेल वैद्युतकणसंचलन (पृष्ठ), आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी या रासायनिक crosslinking पारंपरिक सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) -PAGE के द्वारा पीछा सेल lysates 2,19,20 से oligomers के गठन के लक्षण वर्णन के लिए उपयोगी उपकरण हैं। इन तरीकों में विशेष उपकरणों की आवश्यकता नहीं है और आसानी से पीई हो सकता हैएक मानक प्रयोगशाला में rformed। हम शुरू में विभिन्न रासायनिक पार से जोड़ने प्रोटोकॉल है कि invariantly गैर विशिष्ट एकत्रीकरण और MXA की वर्षा करने के लिए नेतृत्व का मूल्यांकन किया। इसलिए, हम अगले गैर अप्राकृतिकरण पृष्ठ प्रोटोकॉल का परीक्षण किया। गैर अप्राकृतिकरण पृष्ठ एसडीएस के उपयोग को शामिल नहीं किया है, प्रोटीन के प्रवास के उनके पैतृक आरोप पर निर्भर करता है। ब्लू-देशी पृष्ठ एक समग्र नकारात्मक चार्ज, एसडीएस के समान के साथ प्रोटीन लोड करने के लिए coomassie खूब ब्लू G250 उपयोग करता है, लेकिन प्रोटीन 21 denature नहीं है। दुर्भाग्य से, उच्च लवण और द्विसंयोजक फैटायनों (जैसे 2 मिलीग्राम +) है कि अक्सर सेल बफ़र्स में शामिल किए गए हैं की उपस्थिति में खूब ब्लू अवक्षेप coomassie। इस्तेमाल किया बफ़र्स पर निर्भर करता है, यह एक उपाय है oligomeric प्रोटीन परिसर पर असर पड़ सकता है की आगे अनुकूलन के बिना नमूना विश्लेषण करने के लिए मुश्किल हो सकता है।

यहाँ हम एक सरल एक पहले प्रकाशित विधि 22 के oligomerization निर्धारित करने के आधार पर प्रोटोकॉल प्रस्तुतमानव MXA प्रोटीन गैर अप्राकृतिकरण पृष्ठ का उपयोग सेलुलर lysates से निकाली गई।

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Protocol

नोट: इस प्रोटोकॉल पहले प्रकाशित गैर अप्राकृतिकरण पृष्ठ प्रोटोकॉल 12 पर आधारित है। कि अध्ययन में, MXA प्रोटीन की oligomeric राज्य या तो वेरो कोशिकाओं MXA overexpressing या IFN-α उत्तेजित A549 कोशिकाओं अंतर्जात MXA व्यक्त का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था। प्रोटोकॉल नीचे वर्णित MXA के अलावा किसी भी प्रोटीन की oligomeric स्थिति का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, आगे अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है।

गैर denaturing पृष्ठ के लिए सेल lysate के 1. तैयारी

नोट: या तो वेरो या A549 कोशिकाओं में मानव MXA प्रोटीन की oligomeric स्थिति का विश्लेषण करने के लिए, 1.0 x 10 6 कोशिकाओं काटा गया। सेल प्रकार या प्रोटीन का विश्लेषण करने की बहुतायत पर निर्भर करता है, सेल नंबर समायोजित किया जाना चाहिए। यह भी रूप में जल्द ही के रूप में प्रकाश के प्रति संवेदनशील iodoacetamide जोड़ा जाता है, प्रकाश जोखिम से lysis बफर की रक्षा के लिए महत्वपूर्ण है।

  1. बीज 0.3 x 10 6 A549 या वेरो अच्छी तरह से प्रति कोशिकाओं में6 अच्छी तरह से बर्तन करने के लिए। अच्छी तरह से प्रति 2 मिलीलीटर मध्यम विकास में कोशिकाओं रखें (1 टेबल देखें)। एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में रातोंरात कोशिकाओं को सेते (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2)।
  2. फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के 1 मिलीलीटर के साथ धोने से कोशिकाओं फसल और 0.5 0.25 मिलीलीटर% trypsin ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) कमरे के तापमान पर लगभग 5 मिनट के लिए 1x समाधान जोड़कर अलग।
  3. जैसे ही कोशिकाओं पकवान से अलग रूप में, 0.5 मिलीग्राम मध्यम विकास जोड़ने के लिए और ध्यान से ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिश्रण।
  4. अच्छी तरह से एक 2 मिलीलीटर ट्यूब में से प्रत्येक की कोशिकाओं स्थानांतरण और एक तालिका के शीर्ष अपकेंद्रित्र (5000 XG, 4 डिग्री सेल्सियस, 5 मिनट) का उपयोग कर उन्हें गोली।
  5. ध्यान से सेल गोली परेशान बिना pipetting द्वारा सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
  6. ध्यान से सेल निलंबन ऊपर और नीचे pipetting द्वारा 1 मिलीलीटर ठंडा पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें।
  7. एक तालिका के शीर्ष अपकेंद्रित्र में गोली कोशिकाओं (5000 XG, 4 डिग्री सेल्सियस, 5 मिनट)।
  8. ध्यान वाई pipetting द्वारा सतह पर तैरनेवाला हटानेसेल गोली detaching thout।
  9. ऊपर और नीचे pipetting और बर्फ पर डाल द्वारा 200 μl ठंडा lysis बफर (1 टेबल देखें) में Resuspend कोशिकाओं।
  10. इसके तत्काल बाद, टिन पत्र का उपयोग कर और बर्फ पर 30 मिनट के लिए सेते नलियों को कवर द्वारा प्रकाश से lysate की रक्षा करना।
    नोट: बर्फ पर 30 मिनट के लिए ऊष्मायन के बाद, यह अब प्रकाश जोखिम से lysate की रक्षा के लिए आवश्यक है, के बाद से मुक्त thiol समूहों के संरक्षण के अपरिवर्तनीय है।
  11. centrifugation द्वारा सेल मलबे को हटाने के लिए एक पूर्व ठंडा तालिका के शीर्ष अपकेंद्रित्र (13,000 XG, 4 डिग्री सेल्सियस, 20 मिनट) में।
  12. ठंड centrifugation कदम के दौरान 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर कमरे में डायलिसिस बफर (तालिका 1) में डायलिसिस कॉलम संतुलित करना। एक आणविक वजन 10,000 की काट के साथ एक कॉलम का प्रयोग करें।
    1. एक नाव बोया लिए कॉलम देते हैं और उन्हें डायलिसिस बफर से भरा एक बीकर में डाल दिया। कोमल सरगर्मी सुनिश्चित करने के लिए एक चुंबकीय उत्तेजक का उपयोग करें। झिल्ली मत छुओ।
      नोट: Dialysकॉलम खरीदा जा सकता है या प्रोटोकॉल Fiala और सहकर्मियों 19 से वर्णित के अनुसार 1.5 मिलीलीटर ट्यूब से तैयार किया।
  13. डायलिसिस बफर और नाव बोया से स्तंभ निकालें। झिल्ली को छूने के बिना pipetting द्वारा तैयार डायलिसिस स्तंभ में मंजूरी दे दी lysates स्थानांतरण। एक नाव बोया लिए कॉलम देते हैं और डायलिसिस बफर के साथ भरा बीकर में उन्हें वापस डाल दिया।
  14. 4 डिग्री सेल्सियस पर एक बीकर में कम से कम 4 घंटा (या रातोंरात) के लिए ठंडा डायलिसिस बफर (तालिका 1) युक्त lysate Dialyze जबकि ध्यान से एक चुंबकीय उत्तेजक का उपयोग कर क्रियाशीलता। एक 200 μl lysate के लिए कम से कम 100 मिलीलीटर डायलिसिस बफर का प्रयोग करें।
  15. एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में dialysed नमूना हस्तांतरण। एक तालिका के शीर्ष अपकेंद्रित्र (13,000 XG, 4 डिग्री सेल्सियस, 20 मिनट) में centrifugation द्वारा अवक्षेप निकालें। oligomeric प्रोटीन परिसरों प्रोटोकॉल (धारा 2) तुरंत डायलिसिस के बाद के साथ जारी रखने की हदबंदी को रोकने के लिए। स्थिर नहीं रहोतैयार lysates।

2. वैद्युतकणसंचलन

नोट: वैद्युतकणसंचलन के रूप में कुछ संशोधनों के साथ 22 से पहले वर्णित किया गया था। प्रोटोकॉल नीचे वर्णित में, पूर्व डाली ढाल जैल का इस्तेमाल किया गया (4-15% ढाल)। वैकल्पिक रूप से, जैल प्रयोगशाला में तैयार किया जा सकता है। यह किसी भी अप्राकृतिकरण एजेंट इस तरह के रूप में बाहर करने के लिए एसडीएस oligomeric प्रोटीन परिसरों की हदबंदी को रोकने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। वैद्युतकणसंचलन के समय मानव MXA प्रोटीन के विभिन्न oligomeric राज्यों के लिए अनुकूलित किया गया था। हालांकि, यह oligomeric परिसर के आकार के रूप में अच्छी तरह से जुदाई की सीमा है कि जटिल विश्लेषण करने के लिए प्राप्त किया जा करने के लिए माना जाता है पर निर्भर करता है, अन्य प्रोटीन के लिए भिन्न हो सकते हैं। इसलिए, वैद्युतकणसंचलन का इष्टतम समय अनुभव से निर्धारित किया जाना चाहिए। oligomers का इष्टतम संकल्प विश्लेषण किया जा करने के लिए मौजूदा 25 मा अधिक नहीं होनी चाहिए।

  1. जेल चैम्बर में गैर अप्राकृतिकरण पृष्ठ जेल इकट्ठा करो। टी भरेंवह पूर्व ठंडा चल रहा है बफर (तालिका 1) के साथ भीतरी और बाहरी चैंबर।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर ठंडे कमरे में 15 मिनट के लिए जेल प्रति 25 मा पर पूर्व ठंडा चल रहा है बफर के साथ जेल पूर्व चलाते हैं।
  3. (तालिका 1) 4x नमूना बफर के 5 μl के साथ ऊपर तैयार lysates के 15 μl मिक्स। नमूना फोड़ा मत करो।
  4. जेल पर पसंद का एक देशी प्रोटीन मानक नमूना के 15 μl और लोड। 4 डिग्री सेल्सियस पर ठंडे कमरे में 4 घंटे के लिए 25 मा पर जेल चला।
    नोट: अर्द्ध मात्रात्मक विश्लेषण के लिए, एक प्रोटीन मात्रा का ठहराव प्रोटोकॉल (जैसे एक ब्रैडफोर्ड प्रोटीन परख 23) आदेश लेन प्रति कुल प्रोटीन के बराबर मात्रा की लोडिंग सुनिश्चित करने के लिए किया जा सकता है।

3. वेस्टर्न ब्लाट

नोट: नीचे वर्णित एक गीला पश्चिमी धब्बा प्रणाली के प्रोटोकॉल है। किसी भी सोख्ता झिल्ली में इस्तेमाल किया जा सकता है। buf सोख्ता में संतुलन से पहले polyvinylidene फ्लोराइड (PVDF) 100% मेथनॉल में झिल्ली को सक्रिय करेंFer। अर्द्ध शुष्क पश्चिमी धब्बा तकनीक वैकल्पिक रूप से इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन बड़े oligomeric परिसरों के लिए अनुकूलित किया जाना है।

  1. जेल जुदा और ध्यान से एसडीएस बफर (तालिका 1) में यह हस्तांतरण।
  2. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए सेते हैं जबकि धीरे मिलाते हुए।
  3. 2 स्पंज, 4 सेल्यूलोज फिल्टर पेपर शीट और जेल प्रति एक सोख्ता झिल्ली तैयार करें। उन्हें सोख्ता बफर (तालिका 1) में भिगो दें।
  4. सैंडविच इकट्ठा के रूप में (ऊपर से नीचे) इस प्रकार है: 1 स्पंज, 2 सेल्यूलोज फिल्टर पेपर शीट, झिल्ली, जेल, 2 सेल्यूलोज फिल्टर पेपर शीट, 1 स्पंज।
  5. सोख्ता टंकी में सैंडविच रखो। सुनिश्चित करें कि झिल्ली प्लस ध्रुव का सामना करना पड़ता है, जबकि जेल शून्य पोल चेहरे बनाने।
  6. पूर्व ठंडा सोख्ता बफर के साथ सोख्ता टंकी भरें।
  7. सबसे अच्छा प्रोटीन हस्तांतरण परिणामों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर में 90 मा पर दाग।
  8. सैंडविच जुदा और Ponc में झिल्ली incubating द्वारा प्रोटीन मानक कल्पनाकमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए यौ समाधान।
  9. ध्यान से विआयनीकृत पानी के साथ रक्तवर्ण रंग एस बंद धोने जब तक आप स्पष्ट रूप से प्रोटीन मानक के बैंड देख सकते हैं झिल्ली Destain।
  10. प्रोटीन मानक एक पेन का उपयोग करने का बैंड निशान।
    नोट: अवशिष्ट रक्तवर्ण रंग एस immunostaining के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं। इससे बचने के लिए, झिल्ली आगे ऊष्मायन से 0.1 एम NaOH में 1 मिनट और विआयनीकृत पानी के साथ बाद में धोने के लिए destained जा सकता है।
  11. बफर अवरुद्ध साथ झिल्ली ब्लॉक कमरे के तापमान पर कम से कम 1 घंटा या रात में 4 डिग्री सेल्सियस के लिए (1 टेबल देखें)।
  12. प्रोटीन के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी का उपयोग विश्लेषण किया जा immunostaining द्वारा ब्याज की प्रोटीन (ओं) कल्पना।
    नोट: अवरुद्ध बफर (तालिका 1) में 1000: मानव MXA प्रोटीन खरगोश पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी मानव MX1 के लिए विशिष्ट का उपयोग करते हुए कल्पना की गई थी 1 पतला। एंटीबॉडी समाधान 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात incubated किया गया था। वैकल्पिक रूप से, मोनोक्लोनल एकएनटीआई-MXA एंटीबॉडी (क्लोन 143) का इस्तेमाल किया जा सकता है (डेटा नहीं दिखाया गया है) 24।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Units, 10K MWCO, 0.5 ml Thermo Fisher Scientific 69570 Pre-equilibrate in dialysis buffer (if Glycerol removal is desired)
Can be self-made according to Fiala et al. 2011
4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, Bio-Rad 456-1083 Pre-run in running buffer to adjust buffer system
cOmplete, Mini, EDTA-free Roche  11836170001 use 1 tablet per 50 ml
PBS, pH 7.4  bottle a 500 ml Gibco Thermo Fisher Scientific 14190-094
Ponceau S solution Sigma-Aldrich P7170 TOXIC wear gloves and protect eyes
NativeMark Unstained Protein Standard  50 µl Invitrogen P/N 57030 load 5 µl/well
A549 cells ATCC ATCC CCL185 Grow in growth medium (see Table 1)
Vero cells ATCC ATCC CCL81 Grow in growth medium (see Table 1)
anti-Mx1 antibody Novus Biologicals H00004599_D01P Use at a 1:1,000 dilution
ECL Anti-rabbit IgG, Horseradish Peroxidase linked whole antibody (from donkey) GE-Healthcare NA934V Use at a 1:10,000 dilution
0.5% Trypsin-EDTA (1x)        Life Technologies Thermo Fisher 15400-054
Iodoacetamide   5 g Sigma-Aldrich I-6125 stock  100 mM
Bromphenolblue Sigma-Aldrich B0126-25G
DMEM +4.5g/l Gluc,+L-Glut,+Pyruvate life technologies Thermo Fisher Scientific 41966-029
Pen  Strep 100 x     100ml               life technologies Thermo Fisher Scientific 15140 - 130
Glutamax 100x Stock, 100 ml     life technologies Thermo Fisher Scientific 350500-038
Fetal Bovine Serum, Dialyzed , US Origin 500 ml Gibco Lot:42G9552K Thermo Fisher Scientific 10270-106
Cellulose filter paper Bio-Rad 1703965
PVDF blotting  membrane GE-Healthcare 10600022
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Biosolve 0020092391BS
sodium fluoride (NaF) Sigma Aldrich S-7920
NP-40 Calbiochem 492015
cOmplete, Mini, EDTA-free Roche  11836170001
Tween 20 Calbiochem 6555204
CHAPS 10% solution Amresco N907
DL-Dithiothreitol (DTT) Sigma Aldrich 43819
Glycine Biosolve 0007132391BS
sodium orthovanadate (Na3VO4) Sigma Aldrich 450243
Glycerol Sigma Aldrich G7757
β-Glycerophospate Sigma Aldrich G9422
Milk powder Migros/Switzerland
Methanol Millipore 1.06009
sodium cloride (NaCl) Sigma Aldrich 71380
magnesium chloride (MgCl2) Amresco 288
Sodium dodecyl sulphate (SDS) Sigma Aldrich L4509
sodium hydroxide (NaOH) Sigma Aldrich S-8045

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References

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