Summary
여기, 모듈형 DNA "장치" 어셈블리 액체 처리 로봇에 모듈형 복제 DNA 어셈블리 메서드를 사용 하 여 수행 하는 자동화 된 워크플로 제공 됩니다. 프로토콜 조합 DNA 장치 라이브러리 생성, 우리는 두 액체 처리 플랫폼을 사용 하 여 설명 하는 액체 처리기 선택 목록 생성 하기 위한 소프트웨어 도구를 사용 합니다.
Abstract
모듈형 DNA 어셈블리 기술의 최근 발전 활성화 테스트를 합성 생물학의 사용할 수 있는 훨씬 더 많은 "디자인 공간" 개별 유전자 부품의 조합으로 만든 "장치"로 표현. 그러나, 장치 등 다 수의 수동 조립 시간, 오류 발생, 및 비용이 많이 드는입니다. 증가 세련 및 합성 생물학 연구의 대규모, 복잡 한, 그리고 높은 처리량 장치 건설을 수용 하는 효율, 재현 방법이 필요로 합니다.
여기, 형식이 IIS 기반 금지 endonuclease 모듈 (MoClo) 복제 기술을 사용 하 여 DNA 어셈블리 프로토콜은 두 액체 처리 로봇 플랫폼에 자동화 된다. 자동된 액체 처리 로봇 필요 주의 종종 지루한 최적화 pipetting 매개 변수 (예: 효소, DNA, 물, 버퍼), 다른 점도의 액체에 대 한 올바른 소망을 위해 명시적 프로그래밍 및 분배 DNA 부분 및 시 약. 이 수동 DNA 어셈블리로 문제가 복잡 한 어셈블리에 대 한 서 면 수동 스크립트 만들고 스크립트 생성을 자동화할 수 있는 소프트웨어 도구를 필요로 합니다. 이 위해 우리 은행 파일 업로드 기본 DNA 부분에서 조합 DNA 장치 라이브러리를 생성 하기 위한 http://mocloassembly.com 웹 기반 소프트웨어 도구를 개발 했습니다. 우리는 도구에 대 한 액세스를 제공 하 고 포함 하는 우리의 액체 처리기 소프트웨어에서 내보내기 파일 최적화 액체 클래스, 기구 매개 변수, 및 갑판 레이아웃. 사용 하는 모든 DNA 부분 Addgene을 통해 사용할 수 있으며, 그들의 디지털 지도 보스턴 대학 BDC 얼음 레지스트리를 통해 액세스할 수 있습니다. 함께, 이러한 요소는 자동화 모듈 복제 실험과 유사한 프로토콜을 다른 조직에 대 한 기초를 제공 합니다.
여기에 제시 된 자동화 된 DNA 어셈블리 워크플로 DNA 장치의 반복, 자동화, 높은 처리량 생산을 가능 하 게 하 고 반복적인 수동 pipetting에서 발생 하는 인간의 실수의 위험을 감소. 시퀀싱 데이터 표시 자동된 DNA 어셈블리가 워크플로에서 생성 반응 ~ 95% 정확 하 고 수동 반응 준비에 비해 약간 4% 많은 실습 시간으로 필요.
Introduction
콜린스 토글 스위치1 과 Elowitz repressilator2 등 초기 합성 생물학 유전 장치 생물 학적 시스템 앞으로 구체적이 고 결정적인 기능을 설계 될 수 있는 시연 했다. 그 이후, 합성 생물학 바이오3, biotherapeutics4,5,6, 의 바이오 연료의 서비스에서 점차적으로 더 복잡 한 기능 수행을 생활 시스템 엔지니어를 노력가 78,,및 바이오 센 싱 응용 프로그램9,,1011. "장치"에 모듈형 DNA "부분"를 결합 하 여 특정 기능을 통해 이러한 응용 프로그램을 달성 합성 생물학의 주요 목표 중 하나 되었습니다. 규모,이 과정에 대 한 복잡 한 장치에는 시간 효율, 부품의 큰 도서관에서의 창조를 허용 하는 기술 해야 비용 효율적인, 그리고 가장 중요 한 것은, 재현 가능한 방식으로.
현재 필드 지도 성공적인 생물 학적 시스템 디자인과 구성 규칙의 완벽 한 이해 부족 하기 때문에 이러한 광대 한 조립 공정 보증 된다. 이것은 부족 하 게 특징이 DNA 부분12, 호환성의 부족과 부품13및 합성 장치14, 내에서 유전 구성 요소 간의 예기치 않은, 바람직하지 않은 상호 작용의 단계적 악화 15. 신뢰할 수 있는 예측 모델링의 부재, 기능 합성 유전자 장치 도착에 수만, 또는 심지어 수백, 입력-출력 신호 강도 의도 된 장치의 이체는 상영 및 "최고"의 요구는 시행 착오에 의해 다운스트림 요소16구성에 대 한 선택 됩니다. 현대 DNA 조립 방법 골든 게이트17및 모듈형 복제 등을 표준화 하는 동안18,,1920 쉽게이 과정, 실험 전문가 아직도 각 프로토콜을 수행 하는 데 필요한. 합성 장치 크기와 복잡성, 총 사용 가능한 디자인 공간에서 성장 될 것입니다 너무 크게 되 고21, 그리고 프로세스를 수동으로 테스트 것입니다 복제 분야에서 만들 수 있는 어떤 중요 한 진전에 대 한 너무 수 있습니다.
합성 생물학 및 생물학 부분 저장소 iGEM 부품 레지스트리 (http://partsregistry.org) 등의 출현까지 JBEI 인벤토리 구성 요소22, 그리고23, SynBioHub 유전자 부분에 저장 되지 했다 표준화 된 어셈블리 형식입니다. 부품의 단지 작은 한 줌 프로젝트, 복제 하는 데 필요한 및 따라서, 다 복제의 볼륨은 작은, 그리고 조립된 소자의 실현 달성 되었고 사소한 실제 연구 목표에 비해. 분자 클로닝 종종 임시 고 대신 어떤 표준화 된 프로세스에 따라 제한 사이트 및 endonuclease 가용성에 따라 제한 다이제스트를 사용 하 여 수행. 표준화의 부족 가능성이 다음 복제 반응 하는 동일한 프로토콜을 따를 것 이라고 했다 어떤 복제 프로토콜을 자동화 허무 했다. 또한, 정확한 개발 지침의 세대에 대 한 시간 투자 뿐만 아니라 필요한 장비 (로봇 및 관련된 소프트웨어 및 기구 인프라 처리 액체)에 상당한 금전적 투자 DNA 어셈블리를 자동화 처리 되 고 액체의 다양 한 클래스와 정확한 일련의 이러한 프로토콜을 실행 하는 지시를 처리 하기 위한 매개 변수입니다. 노력을 복제 하는 작은 규모가이 비용을 정당화 하지 않았다. 표준된 어셈블리 프로토콜24,25 와 결합 하는 더 크고, 더 복잡 한 유전 장치 디자인의 조합에서는 이러한 프로세스의 자동화 아주 실용적인 환경을 만듭니다. 26 Opentrons OT-1 처럼 저렴 한 비용 로봇 또한이 기술에 액세스할 수 심지어 겸손 투자 연구소 수 등장 하고있다. 또한, "구름" 실험실27 Transcriptic 및 에메랄드 클라우드 연구소 뿐만 아니라에 딘 버 러 게놈 주조, UIUC iBioFab 등 학문적 인 "biofoundries"를 포함 하 여 그리고 MIT 넓은 파운드리, 조립 다양 한 하네스 로봇 디자인의 세트 고객의 다양 한 신속 하 고 반복 하면서 미래 주문 조립 기술과 기본 DNA 프리미티브의 일반적인 저장소를 유지.
DNA 어셈블리의 과정 자동화에 가장 큰 과제 중 하나는 액체 처리기에 대 한 pipetting 명령의 세대입니다. 이러한 장치에 대 한 소프트웨어 인터페이스는 일반적으로 사용 하기 쉽게, 복잡 한 조합 DNA 어셈블리에 필요한 같은 pipetting 지침 명시적으로 각 aspirate를 지정 하 고 명령을 수동으로 분배 과학자가 필요 합니다. 이 주요 병목에서 워크플로 만들고 스크립트 생성 프로세스에 취약해 같은 pipetting 오류 경우 어셈블리를 수동으로 실시 했다. 이 pipetting 지침을 생성 하 여 연구원에 제공 하는 그들을 조립 하는 데 필요한 접시/시 설정으로 장치 라이브러리 디자인에서이 프로세스의 모든 부분을 자동화할 수 있는 소프트웨어 도구를 필요로 합니다. 이 작품에서는, 우리는 우리의 소프트웨어 도구는 작은 조합 DNA 장치 라이브러리의 디자인 뿐만 아니라 96 한 냄비 모듈형 DNA 어셈블리 반응으로 (버퍼, 물, 효소) 시 약 및 DNA 부분 (그림 1b)의 혼합을 자동화를 활용 합니다. 도구를 사용 하 여 이전 프로그래밍 경험이 필요 합니다, 확장 가능 하 고 높은 처리량, 그리고 기본적으로 조합. 우리는 반응 복제 준비 두 가지 다른 자동된 액체 처리 플랫폼에 항복 올바른 순서 확인 클론 반응 수동으로 준비 (95%)에 비해 주파수와 훨씬 적은 실습 시간 보여줍니다.
Protocol
1. 지정 DNA 장치 라이브러리 및 생성 사용자/액체 처리기 지시 [15 분]에 사용 되는 부품
- 어떤 웹 브라우저를 사용 하 여 mocloassembly.com 이동한 조합 DNA 장치를 설계에 포함 될 모든 DNA 부분에 대 한 은행 파일을 업로드 합니다.
- 모든 파일을 업로드 원하는 DNA 부분을 선택 하 고 DNA 부분의 의도 마지막 순서로 파트 유형을 배치 빈 캔버스에 그들을 끕니다.
참고: 개별 부품으로, 부품의 선택 고 캔버스에 배치 될 수 있습니다. 또한, 5'과 3' 돌출 각 부분 일치는 DNA 부분을 주문. - 페이지의 오른쪽 하단에 ' 조립'을 클릭 합니다.
참고: 도구만 BsaI 효소로 소화 시 각 부분을 측면 4 개의 자료 쌍 돌출부에 따라 유효한, 빌드할 어셈블리를 생성 합니다. Buildable DNA 장치가 존재는 과학자에 의해 업로드 하는 부분에 따라, 도구 없는 어셈블리 발견 된을 나타냅니다. -
'계획' 탭으로 이동한 도구에서 생성 된 파일을 다운로드 합니다. 이러한 파일은 포함 됩니다.
- 인간-읽을 수 있는 판 시 약 반응에 필요한 DNA 샘플을 준비 하는 과학자에 대 한 지도
- 액체 처리기에 대 한 '선택 목록'
- 모든 DNA 장치 조립를 완벽 하 게 주석된 은행 파일
참고: 액체 팔 위치 어떤 새로운 기구를 액세스할 때 처리 테스트 해야 합니다. Pipetting 팔 필요에 따라 축 X, Y 및 Z에 위치를 조정 하는 방법에 대 한 자세한 내용은 제조업체의 설명서를 참조 하십시오.
2. 어셈블리 [3 일]에 대 한 플라스 미드 DNA 및 시 약 준비
- [주 1] 살 균 접종 루프를 사용 하는 화기 근처 또는 층 흐름 후드, 행진에 적절 한 항생제와 보충 파운드-한 천 배지 세균성 글리세롤 주식 밖으로 노력 하 고. 이렇게 모든 필요한 DNA 부분, 소독 모든 샘플 사이 루프를 합니다. 37 ° C에서 접시를 밤새 품 어.
참고: 고정 세균 글리세롤 주식을 가능한 얼음에 보관 해야 합니다. 반복된 freeze-thaw 주기 재고의 가능성을 낮출 하 고 피해 야 한다. - [주 2] 열린 불꽃 근처 또는 층 류 두건에 노력 하 고 메 마른 피 펫 팁, 이쑤시개, 또는 접종 루프를 사용 하 여 2.1에 파운드-한 천 배지에서 단일 식민지와 파운드 국물 (적절 한 항생제와 보충)의 3 mL을 접종. 300 RPM에서 흔들어 동안 37 ° C에서 하룻밤 문화를 품 어.
- [3 일] 어떤 상용 소형 예비 플라스 미드 정화 키트를 사용 하 여 세균성 문화에서 플라스 미드 DNA를 정화.
- 제공 된 MoClo_Setup.xlsx 파일을 사용 하 여, 물 또는 TE 버퍼에 20 fmol / µ L의 농도에 플라스 미드 DNA의 각 샘플 희석.
- 플레이트 어셈블리 도구에서 생성 된 PDF 파일의 지도 따라 각 희석 DNA 부분 표시 된 볼륨 전체 skirted 96 잘 PCR 접시에 적절 한 우물에 놓습니다. 이 SetupPlate에 얼음까지 필요, 또는 호 일 접착제 인감과 인감 누른-20 ° c.에 저장
-
다음 구성 요소와 반응 mastermix 준비 얼음에: 반응의 각 20 µ L에 대 한 추가 T4 DNA 리가 버퍼, 0.5 µ L의 T4 DNA 리가 (HC), 및 BsaI 효소의 1 µ L x 10의 2 µ L. 계산기 시트는 이것을 지원 하기 위해 MoClo_Setup.xlsx 파일에 포함 됩니다.
- 새로운 전체 skirted 96 잘 PCR 접시, 접시 지도 생성 된 PDF에서 ReagentPlate에 대 한 다음의 적절 한 우물에 효소 mastermix를 배포 합니다. 이 ReagentPlate 얼음 또는 96-잘 감기-블록을 유지.
참고: 때 액체 처리기에서 어셈블리를 실행할 준비가 된 ReagentPlate만 준비 한다.
- 새로운 전체 skirted 96 잘 PCR 접시, 접시 지도 생성 된 PDF에서 ReagentPlate에 대 한 다음의 적절 한 우물에 효소 mastermix를 배포 합니다. 이 ReagentPlate 얼음 또는 96-잘 감기-블록을 유지.
3. 액체 처리기 [변수]에 어셈블리 스크립트 실행
- 액체 처리기의 갑판에는 SetupPlate(s), ReagentPlate(s) (96-잘 감기-블록에), 및 빈 전체 skirted 96 잘 PCR 접시의 필요한 수를 놓습니다. 빈 plate(s) OutputPlate(s) 반응 조립 되 있을 것입니다.
- 액체 처리기 준비 판의 각 샘플 및 시 약 준비, 나타나는,의 여 물통을 포함 하 여 mocloassembly.com에 의해 생성 된 접시 지도에 표시 하는 이온된 수로에 정확 하 게 그들의 이름을 확인 하 고 인스턴스를 생성 하 여 제어 소프트웨어 ' 저수지 '.
- 제어 소프트웨어의 '작업' 명령을 사용 하 여 첫 번째 명령에서.gwl 파일을 실행 하는 또 다른 '작업' 명령 다음, 우리의 소프트웨어 도구에 의해 생성 된.gwl 파일을 로드 합니다.
- 컨트롤러 소프트웨어의 '실행' 명령을 사용 하 여 스크립트를 실행 합니다.
참고: 항상 갑판 공간에 액세스 하려고 시도 하기 전에 스크립트의 실행을 완료 하는 데 로봇 액체 처리기를 허용 합니다. - 액체 처리기 갑판에서 모든 플레이트를 제거 합니다. DNA를 남은 알루미늄 봉인 영화와-20 ° c.에 저장 SetupPlate(s) 밀봉 하 여 저장 될 수 있습니다. 접착 필름 OutputPlate(s) 인감 thermocycler 또는 열 블록에서 놓고 주기 매개 변수가 실행:
4 ° C에서 37 ° C에 2 시간, 5 분, 10 분 동안 80 ° C 50 ° C에 대 한 개최
참고: 반응 thermocycling 완료 되 면 OutputPlate(s) 저장할 수 있습니다-20 ° C에서 변형 될 준비가 될 때까지.
4. 변환 반응 [1 일]
-
유능한 대장균 의 필요한 수를 녹여 aliquots 필요 (10 µ L/반응) 얼음에 셀.
참고: 불 임을 유지 하려면 다음 단계 수행 되어야 한다 층 류 두건 또는 열린 불꽃, 근처.- 세포는 녹고 동안 0.1 M IPTG의 pipetting 50 µ L을 표면에 20 mg/mL X-여자의 50 µ L 파운드-한 천 배지 (포함 적절 한 항생제)를 준비 합니다. 반응의 많은 수를 도금 하는 경우 마스터 믹스를 확인 합니다. 메 마른 유리 막대 또는 유리 비즈를 사용 하 여 균등 하 게 판 코트 고 박테리아를 도금 하기 전에 적어도 15 분 동안 37 ° C에서 나머지 접시.
참고: 또는, 추가 IPTG와 X-여자 액체 agar를 2mm IPTG 및 40 µ g/mL X Gal 최종 농도에서 접시 부 어. X-분은 빛에 민감한으로 직접적인 빛에서이 접시를 저장 합니다.
- 세포는 녹고 동안 0.1 M IPTG의 pipetting 50 µ L을 표면에 20 mg/mL X-여자의 50 µ L 파운드-한 천 배지 (포함 적절 한 항생제)를 준비 합니다. 반응의 많은 수를 도금 하는 경우 마스터 믹스를 확인 합니다. 메 마른 유리 막대 또는 유리 비즈를 사용 하 여 균등 하 게 판 코트 고 박테리아를 도금 하기 전에 적어도 15 분 동안 37 ° C에서 나머지 접시.
- 얼음, 새로운 96-잘 PCR 격판덮개로 각 반응에 대 한 유능한 세포의 aliquot 10 µ L에. 이 변환 접시 있을 것 이다.
- 변형 판에 해당 하는 OutputPlate(s)에서 각 반응의 1-3 µ L을 추가 하 고 5 분 동안 얼음에 품 어.
- 인감 30 42 ° C에서 thermocycler에 접착제 필름 및 열 충격으로 변환 플레이트 s. 다음, 즉시 2 분 동안 얼음에 접시를 놓습니다.
- 변환 플레이트의 같은 우물을 SOC 미디어의 150 µ L을 추가 하 고 알루미늄 접착 도장, 봉인 900 RPM에서 1 시간 흔들어 동안 37 ° C에서 품 어.
- 4.1.1 메 마른 유리 막대 또는 유리 구슬을 사용 하 여 균등 하 게 격판덮개의 표면 코트에 파운드-한 천 배지에 변환 플레이트의 각의 전체 내용을 접시합니다 37 ° C에서 접시를 밤새 품 어.
5. 복제 확인 [2 일]
-
하나 또는 여러 개의 깊은 잘 96 잘 문화 블록을 1.5 mL 파운드 국물 (적절 한 항생제를 포함)의 준비.
- 2.2 단계, 변형 된 반응의 각 파운드-한 천 배지에서 단일 백색 식민지와 깊은 잘 문화 블럭과 접종 비슷합니다.
- 문화 블럭과 가스 침투성 물개로 밀봉 하 고 900 RPM에서 흔들어 동안 37 ° C에서 밤새 품 어.
참고: 기술 복제 모듈 활용 블루 화이트 심사, 빈 대상 벡터는 파란색 표시 됩니다 동안 긍정적인 CFUs 파운드-한 천 격판덮개에 백색 표시 됩니다.
- (2.3)로 세균성 문화에서 플라스 미드 DNA를 분리 하 고 제출 생어 시퀀싱 클론을 확인.
Representative Results
여기 우리 두 자동화 로봇 액체 처리 플랫폼을 사용 하 여 다양 한 기본 DNA 부분 (그림 1b)에서 96 DNA 장치의 자동화 모듈 어셈블리를 보여 줍니다. 각 transcriptional 단위 발기인, ribosomal 바인딩 사이트, 유전자, 그리고 특정 대상 벡터에 복제 하는 transcriptional 터미네이터의 선형 배열 이다. 상태 많은 계층적 유전자 회로 디자인28,,2930 에 핵심 구성 요소 이며 따라서이 방법에 대 한 개념의 자연적인 증거. 시퀀스 확인 클론 ~ 5 일에 처음부터 끝까지, 달성 될 수 있다 고 제시 워크플로 개요 그림 1a에 선물 된다.
우리 과학자에 의해 생성 될 복제 반응의 정의 수를 주어 최적의 어셈블리 플랫폼 결정에 유용한 여러 가지 통계 캡처 설명된 도구와 프로토콜을 사용 하 여. 그림 2a 는 모든 세 가지 modalities에서 반응 어셈블리 시간 사이 비교를 보여 줍니다. 실행 시간 모든 DNA 부품 및 시 약의 분배 포함 단계 모든 pipetting 96 반응, 조립 하는 데 필요한 총 시간 이다. 실습 시간 인간 수동으로 복제 반응의 준비 또는 액체 처리기를 실행 하는 소프트웨어의 설치에 관련 된 총 시간을 나타냅니다. 그림 2b 다른 방법 사이 비용을 비교합니다. 제시 각 방법으로 준비 하는 단일 반응에 대 한 비용과 효소와 일회용 피 펫 팁, 낮은 전형적인 반응 물량의 가격을 포함 (액체 처리기에 대 한 20 µ L, 수동, 250 10 µ L 음향 분배기를 위한 nL). 수동 및 액체 처리기 준비 세트에 대 한 모든 96 반응에서 단일 클론 12 음향 디스펜서 반응 (그림 2c) 시퀀스의 하위 집합으로 시퀀싱 했다. 올바른 시퀀스 96 수동 및 액체 처리기의 95%에 대 한 획득 했다. 그러나 음향 디스펜서 샘플 하위 집합의 83% 정확 했다, 마지막 두 반응 DNA 및 시 약의 분배 후 방울의 부족 한 혼합으로 인해 어떤 백색 식민지를 실패 하는 것은 완전 했다. 그림 2d 에서는 백색 식민지 수동으로 사이 비교는 식민지의 총 수의 비율에 의해 측정으로 복제 반응 효율성 (94%)와 액체 처리기 조립 (84%) 반응. 흥미롭게도, 음향 디스펜서와 최종 반응 볼륨 다운 스케일링, 우리 것으로 나타났습니다 표시 드롭 반응 효율에 반응 (추가 그림 1 및 표 2 보충) 1 µ L 보다 작은 볼륨에서 준비 했다. 이 반응에 있는 소금 농도 있는 증가 일으킬 수 있는 반응 thermocycling 동안 증발으로 인해 가능성이 높습니다.
그림 1입니다. 자동화 된 DNA 장치 라이브러리 어셈블리 워크플로입니다.
(a)이 이 작품에 제시 하는 실험적인 워크플로 개요. (1) 연구원은 먼저 모든 DNA 부품 및 사용 하고자 하는 대상 벡터에 대 한 은행 파일 업로드. (2) 다음, DNA 부품 어셈블리에 포함 되도록 선택 됩니다. (3) 도구 다음 DNA 부품 및 효소 mastermix 수동 채우기를 지원 플레이트 지도 뿐만 아니라 자동된 액체 처리기 기본값을 생성 합니다. (4) 사용 하 여 생성 된 선택 목록 뿐만 아니라 DNA & 시 약 접시 액체 처리기에 복제 반응의 어셈블리를 실행 하는 연구자. (5) 완료 되 면, 반응 변형 되며 다운스트림 분석에 대 한 도금. (b) DNA의 목록 부품이이 작품에 사용. 3 발기인의 총 3 사이트 코딩 4 바인딩 시퀀스, 그리고 한 transcriptional 종결자 사용 했다 ribosomal 96 상태 조합 도서관을 생성 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2입니다. 3 다른 반응 어셈블리 형식에 걸쳐 비교입니다.
(a) 96에 대 한 반응 설정 시간 반응 조립 수동으로, 그리고 음향 디스펜서 액체 처리기를 통해. 수동 조립이 했다 2 h 10 분, 모두의 실습 시간을 했다. 그러나 액체 처리기는 비슷한 시간이 걸린 (2 h 6 분) 명령을 실행 하는 pipetting, 그 시간 (5 분)의 일부 분 일 뿐인 실습 했다. 음향 디스펜서 액체 이동 (5 분) 실행 시간이 크게 갔고 최소한의 실습 시간 (5 분) 했다. (b) 각 어셈블리의 메서드에 대 한 단일 복제 반응 당 가격. 이 가격은 피 펫 팁 뿐만 아니라 사용 하는 효소의 비용을 포함 합니다. (c) 상태를 조립 시퀀싱 모든 96의 단일 식민지에서 결과. 올바른 클론의 비율 모든 어셈블리 메서드를 통해 비교 했다. Note만 하위 집합 (12) 전체 96 어셈블리의 샘플을 준비 하는 음향 분배기에서 변형 되었다. 두 반응 가능성이 부족은 OutputPlate에 DNA & 효소 mastermix 방울의 혼합으로 인해 어떤 백색 식민지를 하지 못했습니다. (d) 복제 수동 및 액체 처리기 준비 반응 사이의 반응 효율성의 비교. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
추가 그림 1. 반응 효율 감소 반응 볼륨을 낮추는.
반응 효율 드롭 현저 하 게 1 µ L 아래 반응 볼륨을 축소 하는 경우. 이 동향은 두 개의 다른 최종 DNA 농도; 볼 그러나, 과학자는 낮은 효율성 용납 될 수 있는 경우 시 약 비용에 저장 하기 위해 작은 볼륨을 사용 하 여 선택할 수 있습니다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
추가 표 1.
다양 한 pipetting 볼륨에 대 한 DNA와 효소 액체 클래스 매개 변수 테이블. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
추가 표 2.
반응 효율 계산입니다. 원시 CFU 번호 96 변환된 반응 액체 처리기를 통해 수동으로 준비의 12에 대 한 제공 됩니다. CFU 숫자도 음향 디스펜서에 작은 최종 반응 볼륨의 테스트를 위해 제공 됩니다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
결론적으로, 프로세스의 자동화는 완전 한 DNA 장치 생성, 액체 처리, 철에서 디자인에서 기존의 현재 가능한 목표는 기술. 소프트웨어 및 현대 로봇, 시간 효율, 비용 효율적이 고 확장 가능한, 또한 수동 방법 보다 더 일관 되 게 재현할 수 결과 생산 하는 동안에 워크플로 만들을 수 있습니다. 자동화 프로토콜을 실행 하기 위한 가장 비용 효율적인 선택 항상 되지 않을 수 있습니다, 그것은 실험의 재현성을 향상지 않습니다 하 고 귀중 한 연구 시간을 확보. 그러나, 하드웨어 활용에 따라 자동화를 사용 하 여 구동할 수 있다 때로는 기존의 수동 방법을 통해 달성 될 수 있는 무슨 아래 실행 시간과 비용. 또한, 자동화는 공인한 방식으로 방지 특별, 수 제, 명시적으로 프로토콜 캡처하고 일화 좋습니다 실험을 기반으로 합니다. 여기 모듈형 DNA 장치의 자동된 조립 시연 되 고 프로토콜, 전자 파일, 그리고 실제 DNA 자원이 수행 하는 독자에 대 한 필요 하 고 비슷한, 자신의 실험 제공 됩니다. 우리의 도구의 가용성 우리 희망과이 프로토콜의 출판 자원으로 봉사 하 고 DNA 어셈블리 프로세스 및 액체 처리 로봇의 영역에 더 투명 하 고 공동의 미래를 향해 필드를 이동.
자동화 하드웨어의 유용성은 구성 및 하드웨어의 기능에 크게 의존 합니다. 예를 들어, 우리의 액체 처리기 aspirate 작용 및 명령 분배 시스템 유체 변위를 사용 합니다. 디트로이트 드라이브 시스템 유체는 상대적으로 큰 1 mL 주사기, 볼륨, 다양 한 유용한 시 약의 정확한 분배 2 µ L 낮은 제한을 부과. 결과적으로, 우리 반응 이후 20 µ L 액체 처리기에 설정 복제의 총 볼륨 축소 모든 명령 ≥2 µ L를 수 하는 데 필요한을 분배. 그러나이 효과적으로 그 반응을 실행 하는 데 필요한 실습 시간을 현저 하 게 감소 되었다 액체 처리기 준비 반응에 대 한 반응 당 비용을 두 배로. 이 문제를 해결 하기 위해, 우리는 모든 96 반응 음향 액체 디스펜서에 대 한 반응 설치를 반복. 이 장치 소리 에너지를 사용 하 여 다른 한 접시에서 직접 유체를 분배 하 고 달성할 수 있다 분배 볼륨까지 아래 (2.5 nL) 수동 펫을 기반으로 표준 공기 변위로 가능 하다. 이 장치를 사용 하 여, 우리는 250에 우리의 반응의 총 볼륨을 수 있었다 nL, 10 µ L의 수동으로 준비 반응에 비해 40-fold 감소. 적절 하 게, 작은 볼륨 pipetting 단계 사이의 팁 변경의 부족 때문에, 음향 디스펜서가 동일한 96 반응 시간에 생성할 수 (< 5 분). 이후 우리는 일반적으로 1-3 µ L 반응의 변환에 또한 작은 반응 볼륨 낭비 시 약에 저장 합니다. 그 말했다 하 고, 직관적인 소프트웨어와 함께에서 자동화 하드웨어를 사용 하 여 만들 수 있다 DNA 어셈블리 반응의 큰 숫자의 생성 훨씬 넓은 학문적 청중에 액세스할 수 있습니다.
그러나 여기, 우리 기능을 그것의 유용성을 확대 하는 데 도움이 될 수 있다 우리의 소프트웨어 도구 유틸리티를 보여 줍니다. 첫째, 조합 어셈블리를 생성 하는 도구를 사용할 때마다 새로운 DNA 부분 격판덮개 생성 되어야 합니다, 수동으로 실행 하는 모든 어셈블리에 대 한이 번호판을 과학자를 요구. 그것은 도움이 될, 대신, 과학자 어셈블리에 사용 되는 DNA 접시에서 부품의 위치를 지정할 수 있는 경우. 이 것이 DNA 정제 키트 연구원 수 CIDAR MoClo 라이브러리 같은 키트에서 문화를 접종 하 고 키트에 지정 된 각 부품의 잘 위치를 유지 하면서 모든 샘플을 함께 정화 높은 처리량 플라스 미드의 사용 허용. 둘째, 도구 현재 지원 96 잘 접시의 사용 합니다. 큰 프로젝트 몇 백 DNA 장치 건설 될 필요가, DNA, 시 약, 및 대상 접시의 수 액체 처리기의 덱 용량을 초과할 수 있습니다. 이 문제는 더 높은 밀도 플레이트 형식 384 (1536-잘)에 대 한 지원에 의해 적어도 부분적으로 완화 될, 수 있습니다. 마지막으로, 도구 현재 지원 단일 유형의 액체 처리기와 DNA 어셈블리 전략 합니다. 기본 지원으로의 적용 확대 크게 것 이다 많은 다른 액체 처리기 확장 하겠습니다 액체 처리기 도구 제작 지침 형식을 변환 하는 음향 디스펜서 스프레드시트 소프트웨어를 사용 하 여 상대적으로 쉬운 반면 다른 일반적인 DNA 조립 기술 호환성 깁슨 어셈블리31싶습니다.
이 자동화 된 어셈블리 생태계의 중요 한 부분 고급 어셈블리 계획 자동화 친화적인 프로토콜을 명시적으로 액체 처리 로봇에 실행 하도록 예약 된로 변환 하는 소프트웨어 도구 집합입니다. 다양 한 소프트웨어 도구가 어셈블리 철 Benchling, 레이븐32, MoClo 도우미, 등 디자인 연구를 허용 하는 존재, 비록 몇 가지 액체에서 실행 하려면 실행 명령으로 그 디자인을 변환 하는 기능 처리기입니다. 그 끝, 작업 홍보 홍보 자동화 및 인형33,,3435 이러한 도구를 사용할 수 있도록 하기 시작 했다와 같은. 또한, 상업 엔티티가이 지역에서 작업 자동화를 통해 최종 사용자의 큰 그룹에 실험 서비스를 제공 하는 "클라우드 연구소"를 소개 하는 방법을 찾고 있습니다. 이 문서에서 설명 하는 프로토콜은 이러한 노력 중의 조각 그들은 서비스로 제공 됩니다 제공 될 수 있습니다.
합성 생물학을 즉각적이 고 확실 한 값의 DNA 장치의 자동화 어셈블리를 실행 하는 동안 우리의 프로토콜은 뿐만 아니라 분자 생물학의 큰 지역 사회에 대 한 유용 합니다. DNA 어셈블리를 자동화 많은 알려진, 있지만 비슷한, 유전 장치 병렬 및 수 만들 수를 사용 검사 및 테스트 목적으로 약물 개발 연구에 대 한 식 라이브러리의 급속 한 합성. 우리의 소프트웨어 도구 노력 큰 조합 기반 DNA 어셈블리 더 접근 가능 하 고 모두는 합성 생물학으로 큰 학계에 유용한 자원으로 봉사 하겠습니다.
Disclosures
Densmore는 대통령 및 격자 자동화, Inc. 몬스의 공동 설립자 이며 맥 카시는 격자 직원. 격자에 게 소프트웨어 및 많은 설명 하는 프로세스의 자동화를 위한 서비스.
Acknowledgments
우리 인형 프로젝트로 시스와 티어 카, 레이첼 스미스, 토마스 코스타에이 원고에 대 한 작업에 대 한 방출 Bhatia, Alejandro Pelaez 및 존슨 램 감사합니다. 이 작품은 NSF 경력에 의해 투자 되었다 수상 #1253856. 그것 또한 NSF 탐험 컴퓨팅 수상 # 1522074에 의해 자금이 다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hardware / Software | |||
| Freedom EVO 150 Liquid Handling Robot | Tecan | Custom liquid handler fitted with an 8-channel pipetting arm http://lifesciences.tecan.com/products/liquid_handling_and_robotics/freedom_evo |
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| Freedom EVOware Standard (Version 2.4 Service Pack 2) | Tecan | Software used to control the Freedom EVO 150 liquid handler http://lifesciences.tecan.com/products/software/freedom_evoware |
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| Echo 550 | Labcyte | Acoustic Liquid Dispenser http://www.labcyte.com/products/liquidhandling/echo-550-liquid-handler |
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| Sorvall Legend RT | Sorvall | Large benchtop swing-bucket sentrifuge | |
| MasterCycler Pro | Eppendorf | 950040015 | Thermocycler with 96-well heat block https://online-shop.eppendorf.us/US-en/PCR-44553/Cyclers-44554/Mastercycler-pro-PF-5193.html |
| ECHOTHERM Chilling/Heating Dry Bath | Torrey Pines Scientific | Heating/Chilling block for EVO 150 deck https://www.torreypinesscientific.com/products/chilling-and-heating-dry-baths/echotherm-ric20-series-remote-controlled-chillingheating-dr |
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| Tabletop Microcentrifuge 5418 | Eppendorf | 5418000017 | Stardard 18-well microcentrifuge https://online-shop.eppendorf.com/OC-en/Centrifugation-44533/Centrifuges-44534/Centrifuges-5418--5418R-PF-9257.html |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Resources | |||
| mocloassembly.com | Lattice Automation | Web-tool for combinatorial DNA assembly mocloassembly.com |
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| CIDAR MoClo Parts Kit | AddGene | 1000000059 | Kit of bacterial glycerol stocks for all DNA parts used in this study https://www.addgene.org/cloning/moclo/densmore/ |
| CIDAR ICE Registry | CIDAR Lab | Registry of plasmid DNA maps https://ice.cidarlab.org/folders/8 https://synbiohub.programmingbiology.org/public/bubdc_ice/bubdc_ice_folder_8/current |
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| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Labware | |||
| 50 μL Conductive Tips | Tecan | 30 057 818 | Sterile 50 μL conductive tips for Tecan liquid handler http://lifesciences.tecan.com/products/consumables/disposable_tips/liquid_handling_disposable_tips |
| 2 mL Deep 96-well Culture Plates | USA Scinetific | 5678-0285 | Bacterial culture plates used for culturing of large numbers of samples http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-1-3-2-0ml-deepwell-plates-shared-wall-technology.html |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | USA Scinetific | 1615-5599 | Disposable microcentrifuge tubes http://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube-colors.aspx |
| Breathe Easier sealing membrane | Sigma-Aldrich | Z763624-100EA | Breathable sealing membrane for bacterial culture plates http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/z763624?lang=en®ion=US |
| Full-Skirted, Low-Profile, 96-Well PCR Plates | GeneMate | T-3183-2 | PCR plates used for all steps https://www.bioexpress.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=T-3183-R |
| Alluminum Sealing Foil for PCR Plates | GeneMate | T-2451-1 | Alluminum seals for PCR plate storage https://www.bioexpress.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=T-2451-1 |
| Polyolefin Sealing Film for PCR Plates | GeneMate | T-2450-1 | Plastic seals for PCR plates during cycling https://www.bioexpress.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=T-2450-1 |
| PCR Cooler | Eppendorf | 22510525 | 96-well cold block https://online-shop.eppendorf.us/US-en/Temperature-Control-and-Mixing-44518/Accessories-44520/PCR-Cooler-PF-55940.html |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| GenCatch Plasmid DNA Mini-Prep Kit | Epoch Life Sciences | 2160250 | Plasmid DNA purification kit http://www.epochlifescience.com/Product/PurificationKit/dna_mini.aspx |
| T4 DNA Ligase (HC) | Promega | M1794 | High concentration T4 DNA Ligase https://www.promega.com/products/cloning-and-dna-markers/molecular-biology-enzymes-and-reagents/t4-dna-ligase/?catNum=M1794 |
| BbsI Restriction Enzyme | New England Biolabs | R0539L | BbsI enzyme at 10,000 units/ml https://www.neb.com/products/r0539-bbsi |
| BsaI Restriction Enzyme | New England Biolabs | R0535L | BsaI enzyme at 10,000 units/ml https://www.neb.com/products/r3535-bsai-hf |
| T4 DNA Ligase Buffer Pack | Promega | C1263 | 10x T4 DNA ligase buffer https://www.promega.com/products/cloning-and-dna-markers/cloning-tools-and-competent-cells/t4-dna-ligase/ |
| Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Zymo Research | I1001-25 | 0.5M IPTG Solution http://www.zymoresearch.com/buffers-solutions/chemicals/isopropyl-ss-d-thiogalactopyranoside-iptg |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl ß-D-galactopyranoside (X-GAL) | Zymo Research | X1001-25 | 20 mg/ml X-GAL solution http://www.zymoresearch.com/buffers-solutions/chemicals/5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ss-d-galactopyranoside-x-gal |
| Kanamycin Sulfate | Zymo Research | A1003-25 | 35 mg/ml Kanamycin solution http://www.zymoresearch.com/buffers-solutions/antibiotics/kanamycin-sulfate |
| Carbenicillin (Disodium Salt) | Fisher | BP26481 | 1 g Carbenicillin (Ampicillin analog) https://www.fishersci.com/shop/products/carbenicillin-disodium-salt-fisher-bioreagents-3/p-25005#?keyword=carbenicillin |
| SOC Broth Media | Teknova | S0225 | Powder media used to make SOC broth http://www.teknova.com/SOC-BROTH-MEDIA-p/s0225.htm |
| LB Broth (Lennox) Media | Sigma-Aldrich | L3022-1KG | Powder media used to make LB broth http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l3022?lang=en®ion=US |
| LB Broth with agar (Lennox) Media | Sigma-Aldrich | L2897-1KG | LB with agar mix used for making solid media plates http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l2897?lang=en®ion=US |
| Alpha-Select Gold Efficiency Competent Cells | Bioline | BIO-85027 | High efficiency chemically competent E. coli cells http://www.bioline.com/us/alpha-select-gold-efficiency.html |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primers | |||
| Primer VF | 5'-TGCCACCTGACGTCTAAGAA-3' Primers used for Sanger sequencing and colony PCRs |
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| Primer VR | 5'-ATTACCGCCTTTGAGTGAGC-3' Primers used for Sanger sequencing and colony PCRs |
References
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