Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Robot sıvı işleme derleme modüler DNA cihazların otomatik

Published: December 1, 2017 doi: 10.3791/54703
Automatic Translation
1,2, 2, 3, 3, 4
1Graduate Program in Molecular Biology, Cell Biology, and Biochemistry, Boston University, 2Biological Design Center, Boston University, 3Lattice Automation, 4Department of Electrical and Computer Engineering, Biological Design Center, Boston University

Summary

Sıvı işleme robotlar üzerinde modüler bir klon DNA derleme yöntemi kullanılarak modüler DNA "aygıt" derleme gerçekleştirmek için otomatik bir iş akışı burada anlatılan. Protokol bir sezgisel yazılım aracı kullanarak iki sıvı taşıma platformları göstermek Kombinatorik DNA aygıt kitaplığı oluşturma için sıvı işleyicisi picklists üretmek için kullanır.

Abstract

Modüler DNA montaj teknikleri son gelişmeler test etmek sentetik biyologlar etkin önemli ölçüde daha fazla kullanılabilir "" genetik bileşenleri tek tek birleşimlerini oluşturulmuş aygıtlar"tarafından temsil edilen tasarım alanı". Ancak, bu tür çok sayıda aygıtı el ile Meclisi zaman yoğun, hataya ve pahalı olduğunu. Artan sofistike ve sentetik Biyoloji Araştırma ölçeğini büyük ölçekli, karmaşık ve yüksek üretilen iş aygıt inşaat karşılamak için verimli ve tekrarlanabilir bir yol gerektirir.

Burada, bir DNA derleme iletişim kuralı türü IIS kısıtlama dayalı endonükleaz modüler klonlama (MoClo) tekniği kullanarak iki sıvı işleme robot platformlarda otomatikleştirilmiştir. Otomatik sıvı işleme robotlar gerektirir dikkatli, çoğu zaman sıkıcı optimizasyon pipetting parametreleri farklı viskozite (örneğin enzimleri, DNA, su, arabellekleri), sıvılar için yanı sıra doğru aspirasyon sağlamak için açık programlama ve dağıtımı DNA parçaları ve Kimyasalları. Bu karmaşık derlemeler el ile DNA derleme olarak sorunlu için yazma el ile komut dosyası yapar ve komut dosyası oluşturma otomatik olarak yapabilirsiniz bir yazılım aracı gerektirir. Bu amaçla, biz http://mocloassembly.com Genbank dosyaları Tarih temel DNA parçalarından Kombinatorik DNA aygıt kitaplıkları oluşturmak için bir web tabanlı yazılım araç geliştirdik. Biz Aracı'na erişim sağlar ve sıvı sınıfları, aygıtlar parametreleri ve güverte düzen bizim sıvı işleyicisi yazılımlar bir verme dosyasından en iyi duruma getirilmiş. Tüm DNA parçaları Addgene kullanılabilir ve onların dijital harita-ebilmek var olmak giriş yolu ile Boston Üniversitesi BDC buz sicil dairesi. Birlikte, bu öğeleri diğer kuruluşların, modüler klonlama deneyleri ve benzer protokoller otomatikleştirmek için bir temel sağlar.

Burada sunulan otomatik DNA derleme iş akışı DNA aygıtları tekrarlanabilir, otomatik, yüksek üretilen iş üretimini sağlar ve tekrarlayan el ile pipetting üzerinden doğan insan hata riskini azaltır. Veri sıralama otomatik DNA derleme bu iş akışından oluşturulan reaksiyonlar ~ %95 doğru olduğunu göstermek ve el ile reaksiyon hazırlık için karşılaştırıldığında küçük olarak % 4 olarak çok eller time, olarak gerektirir.

Introduction

Collins açma/kapatma düğmesi1 ve Elowitz repressilator2 gibi erken sentetik biyolojik genetik aygıtlar biyolojik sistemlerde ileri özel, belirli işlevler için tasarlanmış gösterdi. O zamandan beri sentetik biyologlar Biyomalzeme3, biotherapeutics4,5,6, biyoyakıt hizmetinde giderek daha karmaşık işlevleri gerçekleştirmek için oturma sistemleri mühendisi gayret 78,ve biosensing uygulamaları9,10,11. Modüler DNA "parçalar" içine "aygıt" özel işlevselliği ile birleştirerek bu uygulamalar elde sentetik Biyoloji önemli amaçlarından biri de olmuştur. Bu işlem ölçeklemek, karmaşık aygıt--dan zaman-verimli, yerlerinde büyük kütüphanelerin oluşturulmasına izin verir bir teknik olmalı maliyet-etkin ve en önemlisi, tekrarlanabilir şekilde.

Şu anda alan başarılı biyolojik sistem tasarımı ve kompozisyon rehberlik kuralları tam bir anlayış olmadığı için böyle bir geniş montaj işlemi garanti kapsamındadır. Bu yeterince karakterize DNA parçaları12, uyumluluk eksikliği ve composability parçalar13ve sentetik aygıtları14, içinde genetik bileşenler arasındaki beklenmeyen, istenmeyen etkileşimler arttığını olduğunu 15. güvenilir akıllı modelleme yokluğunda, fonksiyonel sentetik genetik aygıtları deneme ve hata tarafından onlarca veya, hedeflenen bir aygıt türevleri ekranlı giriş-çıkış sinyal gücü ve "en iyi" bile yüzlerce talepleri geldi aşağı akım öğeleri16ile kompozisyon için seçilir. Modern DNA derleme yöntemleri Golden Gate17ve modüler klonlama gibi standart18,19,20 yaparken, bu işlem daha kolay, deneysel bir uzman her iletişim kuralı gerçekleştirmek için gerekli bir parametredir. Sentetik aygıtları boyut ve karmaşıklık, toplam kullanılabilir tasarım alanı büyüdükçe çok büyük hale oluşturmak ve el ile21ve işlemi sınamak için alanında yapılacak yinelenebilir önemli bir gelişme için çok zanaat will olacak.

Sentetik Biyoloji ve biyolojik bölümü depoları IGEM parçaları kayıt defteri (http://partsregistry.org) gibi gelişiyle kadar JBEI stok birleştirilebilir öğeleri22ve SynBioHub23, genetik bölümleri birinde depolanmadı Standart derleme biçimi. Parçalar sadece küçük bir avuç her projesi, klonlanmış gerekiyordu ve böylece, yapılan klonlama birimi küçüktü ve birleştirilmiş bir aygıt gerçekleştirilmesinin ulaşılabilir ve önemsiz gerçek araştırma hedefleri kıyasla. Moleküler klonlama kez geçici olduğunu ve kısıtlama mevcuttur ve endonükleaz kullanılabilirlik yerine standart herhangi bir süreç takip göre kısıtlama digests kullanılarak gerçekleştirilir. Standardizasyon eksikliği sonraki klonlama tepki özdeş bir protokolü takip edecek olası olduğu gibi herhangi bir kopyalama Protokolü otomatikleştirmek için pratik yaptım. Ayrıca, DNA derleme otomatikleştirme önemli parasal yatırım ekipman (sıvı robotlar ve ilişkili yazılımı donatım ve aygıtlar altyapılarını işleme) yanı sıra doğru geliştirmek için talimatları nesil için zaman yatırım gerekli işlenmekte olan sıvıların çeşitli sınıflar ve bu iletişim kurallarını çalıştırmak için talimatları kesin dizi işleme parametreleri. Küçük ölçekli çabaları klonlama bu giderleri haklı değil. Standart montaj protokoller24,25 ile birleştiğinde daha büyük, daha karmaşık genetik cihaz tasarımları ile birlikte bu süreçlerin Otomasyonu çok pratik nerede bir ortam oluşturur. Opentrons OT-One26 gibi düşük maliyetli Robotik aynı zamanda ortaya çıkan bu teknoloji erişmek bile mütevazi tarafından finanse edilen labs sağlayan. Buna ek olarak, bulut"laboratuar27 Transcriptic ve Zümrüt bulut Lab gibi Edinburgh genom döküm, UIUC iBioFab gibi akademik"biofoundries"de dahil olmak üzere" ve MIT-geniş döküm, çeşitli birleştirmek için emniyet kemeri robot tasarımları ayarlar çeşitli müşteriler için hızlı bir şekilde ve tekrar tekrar süre temel DNA ilkel ve derleme teknolojilerin gelecekteki siparişleri için ortak bir depo bakımı.

DNA derleme işlemini otomatikleştirme içinde en büyük zorluklardan biri pipetting komutları sıvı işleyicisi kuşağıdır. Bu cihazlar için yazılım arayüzleri genellikle kolay, karmaşık Kombinatorik DNA derleme için gerekli bu gibi pipetting talimatlar açıkça belirtmek her aspiratı ve komutu el ile dağıtmak bilim adamı gerektirir. Bu iş akışı içinde büyük bir darboğaz oluşturur ve derleme el ile yürütüldü ise gibi komut dosyası oluşturma işlemi aynı pipetting hataları karşı savunmasız bırakır. Bu pipetting yönergeleri üreten ve bunları monte etmek gerekli plaka/reaktif kurulumları ile araştırmacı sağlayan aygıt kitaplığı tasarlama gelen bu sürecin tüm parçaları otomatik olarak yapabilirsiniz bir yazılım aracı gerektirir. Bu çalışmada, bizim yazılım aracı küçük bir birleşimsel DNA aygıt Kütüphane tasarımını, hem de 96 one-pot modüler DNA derleme tepkiler DNA parçaları (Şekil 1b) ve reaktifler (tampon, su, enzimler) karıştırma otomatikleştirmek için kaldıraç. Aracın kullanımı Hayır önce programlama deneyimi gerektirir, ölçeklenebilir ve yüksek verim, olduğunu ve Kombinatorik varsayılan olarak. Biz tepkiler klonlama iki farklı otomatik sıvı işleme platformlarda verim doğru sıra doğrulanmış klonlar için el ile hazırlanan reaksiyonlar (% 95) karşılaştırılabilir frekans ve önemli ölçüde daha az yakışıklı-üstünde zaman hazırladığını gösterir.

Protocol

1. DNA aygıtı kitaplığı ve kullanıcı/sıvı işleyicisi yönergeleri [15 dk] oluşturmak için parçaları belirtin

  1. Herhangi bir web tarayıcısı kullanarak mocloassembly.com için gidin ve Kombinatorik DNA aygıt tasarımında dahil tüm DNA parçaları için Genbank dosya yükleyebilir.
  2. Tüm dosyaları karşıya yüklendikten sonra istenen DNA bölümü seçin ve Bölümü türleri DNA parçaları amaçlanan son sıraya sokulması boş tuval üzerine sürükleyin.
    Not: Koleksiyon parçaları, hem de tek tek parçaları, seçilen ve tuval üzerine yerleştirilir. Öyle ki 5' ve 3' çıkıntılar her bölüm maç için Ayrıca, DNA parçaları sipariş.
  3. 'Montajı' sayfanın sağ alt tıklatın.
    Not: Aracın sadece sindirim BsaI enzim ile üzerine her bölümü yan dört baz çifti çıkıntılar dayalı geçerli, oluþturulabilir derlemeler üretecektir. Oluþturulabilir DNA aygıt tabanlı bilim adamı tarafından yüklenen parçalar varsa, aracın hiçbir derleme bulunamadı gösterir.
  4. 'Planları' sekmesine gidin ve araç tarafından oluşturulan dosyaları karşıdan yükleyin. Bu dosyalar içerir:
    1. DNA örnekleri gibi tepkiler için gerekli reaktifler hazırlamak bilim adamı için okunabilir plaka haritalar
    2. Sıvı işleyici için 'seçim listesi'
    3. Tam açıklamalı Genbank dosyaları tüm DNA aygıtların montajı
      Not: herhangi bir yeni aygıtlar erişirken kol konumlandırma işleme sıvı test edilmelidir. X, Y ve Z eksenleri gerektiği gibi konumlandırma pipetting kol ayarlamak ayrıntılı yönergeler için üreticinin el kitabına bakın.

2. plazmid DNA ve Kimyasalları [3 gün] derleme için hazırlayın

  1. [Gün 1] Steril aşılama döngü kullanarak ve açık alev yakın veya laminar akış kukuIeta çizgi bakteriyel gliserol stokları LB-Ağar kaplamalar uygun antibiyotik ile desteklenmiş üzerine dışarı çalışma. Döngünün her örnek arasında sterilize etmek emin gerekli tüm DNA parçaları için bunu. Tabak 37 ° C'de gecede kuluçkaya.
    Not: bakteriyel gliserol hisse senetleri buz üzerinde mümkün olduğu kadar tutulmalıdır donmuş. Tekrarlanan donma-çözülme çevrimleri hisse senedi canlılığı düşürebilir ve kaçınılmalıdır.
  2. [2 gün] Steril pipet ucu, kürdan veya aşı döngü kullanarak ve açık alev yakınındaki veya laminar akış başlıklı çalışma 3 mL LB suyu (uygun antibiyotik ile desteklenmiş) 2.1 hazırlanan LB-Ağar kaplamalar tek bir koloni ile aşılamak. Kültürler gecede 37 ° C'de 300 devir / dakikada sallayarak süre kuluçkaya.
  3. [Gün 3] Plazmid DNA herhangi bir piyasada bulunan mini hazırlık plazmid arıtma kiti kullanarak bakteriyel kültürlerden arındırmak.
  4. Sağlanan MoClo_Setup.xlsx dosyasını kullanarak, plazmid DNA 20 fmol/µL su veya TE arabellek bir konsantrasyon için her örneği oranında seyreltin.
  5. Plaka harita derleme aracı tarafından oluşturulan PDF dosyasının belirtilen birimin her seyreltilmiş DNA bölümü tam etekli 96-şey PCR plaka üzerinde uygun kuyunun içine yerleştirin. Bu SetupPlate ihtiyaç kadar buz üzerinde tutun veya bir folyo yapışkanlı mühür ile mühür ve -20 ° C'de depolayın
  6. Buz üzerinde aşağıdaki bileşenleri içeren tepki mastermix hazırlamak: 2 µL 10 x T4 DNA ligaz arabellek, 0.5 µL T4 DNA ligaz (HC) ve 1 µL BsaI enzim reaksiyon her 20 µL için ekleyin. Bir hesap makinesi sayfası bu ile size yardımcı olmak için MoClo_Setup.xlsx dosyasında bulunur.
    1. ReagentPlate oluşturulan PDF için plaka harita takip bir yeni tam etekli 96-şey PCR plaka, uygun kuyu içine enzim mastermix dağıtın. Bu ReagentPlate bir 96-şey soğuk-blok veya buz üzerinde tutun.
      Not: ReagentPlate sadece hazır olduğunuzda derleme üzerinde sıvı işleyicisi çalıştırmak hazırlanmalıdır.

3. sıvı işleyicisi [değişken] derleme komut dosyasını yürütün

  1. SetupPlate(s), ReagentPlate(s) (üzerinde bir 96-şey soğuk-blok) ve tam etekli 96-şey PCR tabakların gereken sayıda sıvı işleyicisi güvertede yerleştirin. Boş plate(s) tepkiler nereye monte OutputPlate(s) olacak.
  2. Sıvı işleyicisi hazırlamak kontrol yazılımı tamamen temiz, bir çukur da dahil olmak üzere mocloassembly.com tarafından oluşturulan plaka haritalarda deiyonize su etiketli göründüğü isimlerini emin hazır, her örnek ve reaktif plaka örneklerini oluşturma tarafından ' Rezervuar '.
  3. 'Worklist' komutunu kontrol yazılımı kullanarak, .gwl dosya ilk komut yüklü yürütülecek başka bir 'Worklist' komutunu ve ardından bizim yazılım aracı tarafından oluşturulan .gwl dosyasını yükleyin.
  4. Denetleyicisi Software'in 'Koşmak' komutunu kullanarak komut dosyasını yürütün.
    Not: Her zaman bir komut dosyası yürütülmesine güverte alanına erişmeye denemeden önce tamamlamak için robot sıvı işleyicisi sağlar.
  5. Tüm plakaları sıvı işleyicisi güverteden kaldır. DNA kalan SetupPlate(s) alüminyum mühürleme film ve -20 ° c depolama ile sızdırmazlık tarafından kaydedilmiş olabilir OutputPlate(s) yapıştırıcı film ile mühür, bir thermocycler veya ısı-taş yerleştirin ve aşağıdaki döngüsü parametrelerle çalıştırın:
    37 ° C 2 h, 50 ° C 5 min, 80 ° C 10 dk için için için 4 ° C'de tutun
    Not: tepki thermocycling tamamlandıktan sonra dönüştürülmesi hazır olana OutputPlate(s)-20 ° C'de muhafaza edilebilir.

4. dönüşüm reaksiyonlar [1 gün]

  1. Yetkili E. coli gerekli sayıda çözülme hücre aliquots (10 µL/reaksiyon) buz üzerinde gerekli.
    Not: kısırlık korumak için aşağıdaki adımları açık alev yakınındaki veya laminar akış başlık içinde gerçekleştirilmelidir.
    1. Hücreleri çözdürme iken, LB-Ağar kaplamalar (içeren uygun antibiyotik) 0.1 M IPTG pipetting 50 µL ve 20 mg/ml X-GAL yüzeyine 50 µL hazırlayın. Reaksiyonlar çok sayıda kaplama ana mix olun. Eşit olarak steril cam çubuk veya cam küreciği kullanarak plakaları ceket ve plakaları için en az 15 dk. 37 ° C'de bakteri kaplama önce dinlenmek izin verir.
      Not: plakaları, 2 mM IPTG ve 40 µg/mL X-Gal son konsantrasyon dökülür önce alternatif olarak, IPTG ve X-Gal sıvı agar ekleyin. X-Gal ışığa duyarlı olduğu gibi bu plakaları doğrudan güneş ışığı dışında depolayın.
  2. Buz üzerinde yeni bir 96-şey PCR tabak içine her tepki için yetkili hücre aliquot 10 µL. Bu dönüştürme plaka olacaktır.
  3. 1-3 µL her tepki OutputPlate(s) de dönüşüm tabak içinde karşılık gelen ekleyin ve 5 min için buz üzerinde kuluçkaya.
  4. Bir thermocycler için 30 42 ° C'de yapıştırıcı film ve ısı şok dönüştürme plakalı mühür s. O zaman, hemen buz 2 min için plaka yer.
  5. Dönüştürme plaka aynı kuyu, SOC kitle 150 µL eklemek, bir alüminyum yapışkanlı seal ile kilitleyin ve 37 ° C'de 1 saat için 900 devir / dakikada sallayarak süre kuluçkaya.
  6. 4.1.1 plaka yüzeyine eşit olarak kat için steril cam çubuk veya cam boncuklar kullanılarak hazırlanan LB-Ağar kaplamalar dönüştürme tabağa her şey tüm içeriği plaka. Tabak 37 ° C'de gecede kuluçkaya.

5. clone doğrulama [2 gün]

  1. Bir veya daha fazla 96-şey derin-şey kültür bloklarla 1,5 mL LB suyu (içeren uygun antibiyotik) hazırlayın.
    1. 2.2 adım, derin-şey kültür block(s) tek beyaz kolonileri dönüştürülmüş reaksiyonların her LB-agar plaka ile aşılamak için benzer.
    2. Kültür block(s) ile gaz geçirgen bir mühür mühür ve bir gecede 37 ° C'de 900 devir / dakikada sallayarak süre kuluçkaya.
      Not: mavi-beyaz tarama, boş hedef vektörel çizimler mavi görünür ise pozitif CFUs LB-agar plaka üzerinde beyaz görünür tekniği klonlama modüler kullanır.
  2. (2.3) olduğu gibi bakteriyel kültürlerden plazmid DNA izole ve Sanger için gönderin klonlar doğrulamak için sıralama.

Representative Results

Burada iki otomatik robot sıvı işleme platform kullanarak otomatik modüler montaj 96 DNA aygıt--dan çeşitli temel DNA parçaları (Şekil 1b) göstermektedir. Her transkripsiyon biriminde organizatörü, ribozomal bağlama sitesi, gen ve transkripsiyon Sonlandırıcı, belirli hedef vektör klonlanmış doğrusal bir düzenlemedir. TUs birçok hiyerarşik genetik devre tasarımları28,29,30 önemli bir bileşeni ve bu nedenle doğal kavramının bir kanıtı olarak bu yaklaşım için. Sıra doğrulanmış klonlar ~ 5 gün içinde başından sonuna kadar elde edilebilir ve Şekil 1a' sunulan iş akışı genel bakış sunulur.

Açıklanan araç ve iletişim kuralı kullanarak, çeşitli ölçümler tanımlanmış bir bilim adamı tarafından oluşturulacak klonlama reaksiyonlar sayısı göz önüne alındığında en iyi derleme platformu belirlemede yararlı ele geçirdi. Şekil 2a tepki montaj süreleri boyunca tüm üç yöntemleri arasında bir karşılaştırma gösterir. Yürütme zamanı tüm DNA parçaları ve reaktifler dağıtımı içeren 96 reaksiyonlar, montaj için gerekli tüm pipetting adımları tamamlamak için toplam süre. Uygulamalı zaman bir insan klonlama reaksiyonlar hazırlanması veya sıvı işleyicisi çalışan yazılımın kurulumu el ile ilgili toplam süre anlamına gelir. Şekil 2b farklı yöntemleri arasındaki maliyeti karşılaştırır. Sunulan maliyeti için her yöntemi tarafından hazırlanan bir tek tepki ve enzimler ve tek kullanımlık pipet ipuçları, verilen Tipik tepki en düşük birim fiyatı içerir (20 µL sıvı işleyici için el ile 250 için 10 µL nL akustik dispanser için). Hem el ile hem de sıvı işleyicisi hazır ayarlar için tüm 96 reaksiyonlar üzerinden tek klonlar akustik dağıtıcı reaksiyonlar (Şekil 2 c) sıralı 12 alt ile sıralı. Doğru dizileri 96 manuel ve sıvı işleyicisi kümeleri % 95'i için elde edilmiştir. Akustik dağıtıcı örnek alt % 83'ü doğru olduğunu, ancak son iki reaksiyonlar herhangi bir beyaz koloniler, yetersiz damlacıkları DNA ve Kimyasalları dağıtımı sonra karıştırılması nedeniyle büyük olasılıkla verim için başarısız oldu tam oldu. Şekil 2B beyaz sömürgelerine el ile arasında karşılaştırılabilir kolonileri toplam sayısı oranını göre ölçülen klonlama tepki verimliliği gösterir (% 94) ve sıvı işleyicisi monte (% 84) reaksiyonları. Tepkiler miktarlar 1 µL (tamamlayıcı şekil 1 & ek tablo 2) küçük hazırlanmıştır zaman ilginçtir, aşağı son tepki ses akustik dispenseri ile ölçeklerken işaretli bir damla tepki verimliliği fark ettik. Bu reaksiyon tuz konsantrasyonlarda bir artışa neden olabilir tepki thermocycling sırasında buharlaşma nedeniyle muhtemeldir.

Figure 1
Şekil 1. Otomatik DNA aygıt kitaplığı derleme iş akışı.
(a) bu çalışmada sunulan deneysel iş akışı bir özeti. (1) araştırmacılar ilk Genbank dosyaları tüm DNA parçaları & kullanmak istediğiniz hedef vektörel çizimler için yükleyin. (2) sonra DNA parçaları derlemede eklenmek üzere seçilir. (3 aracı daha sonra otomatik bir sıvı işleyicisi, aynı zamanda plaka haritalar DNA bölümleri ve enzim mastermix el ile popülasyon ile yardımcı olmak için bir seçim listesi oluşturur. (4) DNA & reaktifler tabak gibi oluşturulan seçim listesi kullanarak araştırmacılar yürütmek klonlama reaksiyonlar Meclisi üzerinde sıvı işleyicisi. (5) tamamlandığında, tepkiler değiştirdi ve aşağı akım analiz için kaplama. (b) bu çalışmada kullanılan liste DNA parçaları. Toplam üç rehberleri, üç siteleri, dört kodlama bağlama dizileri ve bir transkripsiyon Sonlandırıcı kullanılmıştır ribozomal 96 TUs Kombinatorik Kütüphanesi oluşturmak. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2. Üç farklı tepki derleme yöntemleri arasında karşılaştırmalar.
(a) tepki kurulum süresi için 96 reaksiyonlar el ile sıvı bir işleyici üzerinden ve akustik bir dağıtıcı tarafından toplandı. El ile derleme 2 saat 10 dk tüm bunların uygulamalı zamanlar, aldı. Pipetting komutları, ancak yürütme süresi (2 h 6 dk) benzer bir miktar sıvı işleyicisi aldı o zaman (5 dk) yalnızca bir kısmını eller. Akustik Sabunluk sıvı transferi (5 dk) yürütmek için daha az zaman aldı ve en az eller zaman (5 dk) aldı. (b) fiyatını her derleme yöntemi için tek klonlama tepki. Bu fiyat, pipet ipuçları yanı sıra kullanılan enzimler maliyetini içerir. (c) tüm 96 tek kolonileri gelen sonuçları sıralama TUs toplandı. Doğru klonlar yüzdesi tüm derleme yöntemleri arasında karşılaştırılabilir. Yalnızca bir alt kümesini (12) tam 96 derlemeler örnekleri hazırlanan akustik dağıtıcı dönüştürülmüş unutmayın. İki reaksiyonlar büyük olasılıkla OutputPlate içinde DNA'sı & enzim mastermix damlacıkları yetersiz karıştırma nedeniyle herhangi bir beyaz kolonileri vermeye başarısız oldu. el ile ve sıvı işleyicisi hazırlanan tepkiler arasındaki reaksiyon verimliliği klonlama (d) karşılaştırma. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Ek resim 1. Tepki birim düşürücü tepki verimliliği azaltır.
Reaksiyon verimliliği belirgin tepki birimleri aşağıda 1 µL aşağı ölçeklerken bırak. Bu eğilim iki farklı son DNA konsantrasyonları ile görülür; Ancak, bilim adamları daha düşük verimleri tolere Eğer reaktif maliyetlerinde tasarruf için daha küçük birimler kullanmayı tercih edebilir. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Ek tablo 1.
Çeşitli pipetting birimlerin DNA ve enzim sıvı sınıf parametrelerini tablosu. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Ek tablo 2.
Reaksiyon verimlilik hesaplamaları. Ham CFU numaraları el ile ve sıvı işleyici üzerinden hazırlanan 96 dönüştürülmüş reaksiyonların 12 için verilir. CFU numaraları da bir daha küçük son tepki birimi akustik dağıtıcı üzerindeki test etmek için sağlanır. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Discussion

Sonuç olarak, tam DNA aygıt oluşturma işleminin, sıvı işleme, silis tasarım otomasyonu ile şu an mevcut olan uygun bir hedeftir teknoloji. Yazılım ve modern robot Ayrıca el ile gerçekleştirilebilecek yöntemler daha daha fazla sürekli tekrarlanabilir sonuçlar üretirken maliyet-etkin, zaman verimli ve ölçeklenebilir, iş akışları oluşturulmasına olanak sağlar. Otomasyon her zaman bir protokolü yürütmek için en uygun maliyetli seçenek olmayabilir iken, deneysel tekrarlanabilirlik geliştirmek ve değerli araştırmacı zaman boşaltır. Ancak, kullanılan donanım bağlı olarak, otomasyon kullanımı bazen maliyet ve yürütme ne geleneksel el ile gerçekleştirilebilecek yöntemler elde edilebilir çok altında zaman sürebilirsin. Ayrıca, bir resmi şekilde önlenmesi geçici, zanaat, açıkça Protokoller'de otomasyon yakalar ve anekdot en iyi uygulama deneme dayalı. Burada modüler DNA cihazların otomatik derleme gösterilmiştir ve iletişim kuralı, elektronik dosyaları ve fiziksel DNA kaynakları için okuyucu bunlar gerçekleştirmek için gerekli ve benzer, kendi üzerinde deneyler sağlanmaktadır. Biz bizim Aracı kullanılabilirliği umut ve yayın bu iletişim kuralı bir kaynak olarak hizmet ve DNA derleme işlemleri ve sıvı Robotik işleme alanında alandan daha şeffaf ve ortak bir geleceğe doğru.

Otomasyon donanım kullanışlılığı yapılandırma & donanım yeteneklerini büyük ölçüde bağlıdır. Örneğin, bizim sıvı işleyicisi sistemi sıvı deplasman aspiratı harekete ve komutları dağıtmak için kullanır. Sürücü sistem sıvı çoğu nispeten büyük 1 mL pistonlar batar, birimler, bir dizi için yararlı iken 2 µL alt sınıra doğru reaktifler dağıtımı için dayatır. Sonuç olarak, biz 20 µL, sıvı işleyicisine beri set up reaksiyonlar klonlama toplam sesini ölçekli her ≥2 µL olması gereken komut dağıtmak. Uygulamalı zaman bu reaksiyonlar yürütmek için gerekli miktarı önemli ölçüde düşürülmüştür ancak bu etkili tepki işleyicisi hazır sıvı reaksiyonlar için maliyeti iki katına. Bu soruna yönelik bir çaba olarak, akustik bir Sıvı Sabunluk tüm 96 reaksiyonlar için tepki Kur tekrarladı. Bu aygıt doğrudan doğruya--dan bir tabak sıvı dağıtmak için ses enerji kullanır ve elde edebilirsiniz kadar aşağıdaki birimleri dağıtmak (2.5 nL) el ile Pipetler dayalı standart hava öteleme ile mümkündür. Bu aygıtı kullanan, biz aşağı bizim tepkiler 250 Toplam ses ölçeklemek başardık nL, 10 µL el ile hazırlanan tepkileri göre 40-fold bir tasarruf. Reçete küçük birimleri ve ipucu değişiklikleri pipetting adımlar arasında olmaması nedeniyle, akustik dağıtıcı aynı 96 reaksiyonlar zaman bir kısmını elde edebilecektir (< 5 dk). Biz genellikle yalnızca 1-3 µL reaksiyon dönüştürmek beri küçük tepki birimleri boşa reaktifler üzerinde kaydedebilir. Bu söyleniyor, sezgi bilgisayar yazılımı ile birlikte otomasyon donanım kullanımı DNA derleme reaksiyonlar çok sayıda nesil için erişilebilir daha geniş bir akademik kitleye duruma getirebilirsiniz.

Burada, ancak orada bir dizi onun usefulness genişletmek yardımcı olacak özellik bizim yazılım aracı yardımcı programı göstermektedir. İlk olarak, aracın Kombinatorik bir derleme oluşturmak için kullanılan her zaman yeni DNA parçası plakalar, bu levhalar her derleme çalıştırmak için el ile doldurmak bilim adamı gerektiren oluşturulan gerekir. Bilim adamı derlemede kullanılmak üzere bir DNA plaka parçaları konumunu belirtebilirsiniz yerine, yardımcı olur. Araştırmacılar kültürler CIDAR MoClo kütüphane gibi bir takımı'ndan aşılamak olabilir ve tüm örnekleri birlikte kit ile belirtilen her bölümü iyi konumunu koruyarak arındırmak beri bu DNA arıtma kitleri yüksek üretilen iş plazmid kullanımını sağlayacak. İkinci olarak, araç şu anda sadece 96-şey plakaları kullanımını destekler. Orada birkaç yüz DNA aygıt inşa edilecek gerek daha büyük projeler için DNA, reaktif ve hedef tabak sayısını sıvı işleyicisi güverte kapasitesini aşabilir. Bu sorunu en azından kısmen, yüksek yoğunluk plaka biçimleri (384 veya 1536-şey) için destek tarafından hafifletti olabilir. Son olarak, araç şu anda yalnızca tek bir tür sıvı işleyicisi ve DNA derleme strateji destekler. O aracı üretilen sıvı işleyicisi yönergeleri elektronik tablo yazılımı kullanarak bir akustik dağıtıcı biçimine dönüştürmek nispeten kolay olmakla birlikte, büyük ölçüde onun uygulanabilirliği olarak genişletmek birçok farklı sıvı işleyicileri için yerel destek genişletmek umut diğer ortak DNA montaj teknikleri ile uyumluluk Gibson derleme31istiyorum.

Bu otomatik derleme ekosistem çok önemli bir parçası açıkça robotlar işleme sıvı üzerinde çalışmak üzere zamanlanmış otomasyon dost iletişim kuralları üst düzey derleme planları dönüþtürür yazılım araçları kümesidir. Araştırmacılar derlemeler silis Benchling, MoClo planlayıcısı ve Raven32de dahil olmak üzere tasarım sağlayan yazılım araçları bir dizi var ama az bir sıvı üzerinde çalıştırmak için yürütülebilir talimatları bu tasarımlar dönüştüren yeteneğine sahip işleyicisi. Bu son, PR-PR otomasyon ve kuklacı33,34,35 başladı gibi bu araçları kullanılabilir hale getirmek çalışıyorum. Ayrıca, bu alanda çalışan ticari kuruluşlar "otomasyon yoluyla son kullanıcılara büyük gruplar için deneysel hizmet bulut labs" tanıtmak için yollar arıyoruz. Herhangi bu çabaların bir parçası koşuluyla, bir hizmet olarak sunulan bu yazıda belirtilen iletişim kuralı hizmet verebilir.

DNA cihazların otomatik derleme anında ve açık değeri sentetik Biyoloji için olsa da, bizim moleküler biyologlar de büyük topluluğu için yararlı bir protokoldür. DNA derleme otomatikleştirme bilinen çok sayıda sağlar, ancak paralel ve can oluşturulacak benzer, genetik tarama ve sınama amacıyla ilaç geliştirme çalışmaları için ifade kitaplıkları hızlı sentezi etkinleştirmek. Biz bizim yazılım aracı daha büyük Kombinatorik tabanlı DNA derleme çabaları daha erişilebilir hale getiren ve hem sentetik biyoloji, hem de akademik topluluğunun geneli için yararlı bir kaynak olarak hizmet umuyoruz.

Disclosures

Densmore başkanı ve kurucularından kafes otomasyon, Inc Timmons ve McCarthy kafes çalışanlar. Kafes yazılım ve Hizmetleri Otomasyonu çoğunun açıklanan işlemi için

Acknowledgments

Biz Swapnil Bhatia, Alejandro Pelaez ve Johnson Lam kuklacı proje, aynı zamanda Swati Carr, Rachael Smith ve Thomas Costa çalışmaları bu el yazması ile ilgili yardım için teşekkür ederim. Bu eser NSF kariyer tarafından finanse edildi Ödülü #1253856. Ayrıca bilgisayar Ödülü #1522074 NSF keşif tarafından finanse edilmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hardware / Software
Freedom EVO 150 Liquid Handling Robot Tecan Custom liquid handler fitted with an 8-channel pipetting arm
http://lifesciences.tecan.com/products/liquid_handling_and_robotics/freedom_evo
Freedom EVOware Standard (Version 2.4 Service Pack 2) Tecan Software used to control the Freedom EVO 150 liquid handler
http://lifesciences.tecan.com/products/software/freedom_evoware
Echo 550 Labcyte Acoustic Liquid Dispenser
http://www.labcyte.com/products/liquidhandling/echo-550-liquid-handler
Sorvall Legend RT Sorvall Large benchtop swing-bucket sentrifuge
MasterCycler Pro Eppendorf 950040015 Thermocycler with 96-well heat block
https://online-shop.eppendorf.us/US-en/PCR-44553/Cyclers-44554/Mastercycler-pro-PF-5193.html
ECHOTHERM Chilling/Heating Dry Bath Torrey Pines Scientific Heating/Chilling block for EVO 150 deck
https://www.torreypinesscientific.com/products/chilling-and-heating-dry-baths/echotherm-ric20-series-remote-controlled-chillingheating-dr
Tabletop Microcentrifuge 5418 Eppendorf 5418000017 Stardard 18-well microcentrifuge
https://online-shop.eppendorf.com/OC-en/Centrifugation-44533/Centrifuges-44534/Centrifuges-5418--5418R-PF-9257.html
Name Company Catalog Number Comments
Resources
mocloassembly.com Lattice Automation Web-tool for combinatorial DNA assembly
mocloassembly.com
CIDAR MoClo Parts Kit AddGene 1000000059 Kit of bacterial glycerol stocks for all DNA parts used in this study
https://www.addgene.org/cloning/moclo/densmore/
CIDAR ICE Registry CIDAR Lab Registry of plasmid DNA maps
https://ice.cidarlab.org/folders/8
https://synbiohub.programmingbiology.org/public/bubdc_ice/bubdc_ice_folder_8/current
Name Company Catalog Number Comments
Labware
50 μL Conductive Tips Tecan 30 057 818 Sterile 50 μL conductive tips for Tecan liquid handler
http://lifesciences.tecan.com/products/consumables/disposable_tips/liquid_handling_disposable_tips
2 mL Deep 96-well Culture Plates USA Scinetific 5678-0285 Bacterial culture plates used for culturing of large numbers of samples
http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-1-3-2-0ml-deepwell-plates-shared-wall-technology.html
1.5 mL Microcentrifuge Tubes USA Scinetific 1615-5599 Disposable microcentrifuge tubes
http://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube-colors.aspx
Breathe Easier sealing membrane Sigma-Aldrich Z763624-100EA Breathable sealing membrane for bacterial culture plates
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/z763624?lang=en&region=US
Full-Skirted, Low-Profile, 96-Well PCR Plates GeneMate T-3183-2 PCR plates used for all steps
https://www.bioexpress.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=T-3183-R
Alluminum Sealing Foil for PCR Plates GeneMate T-2451-1 Alluminum seals for PCR plate storage
https://www.bioexpress.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=T-2451-1
Polyolefin Sealing Film for PCR Plates GeneMate T-2450-1 Plastic seals for PCR plates during cycling
https://www.bioexpress.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=T-2450-1
PCR Cooler Eppendorf 22510525 96-well cold block
https://online-shop.eppendorf.us/US-en/Temperature-Control-and-Mixing-44518/Accessories-44520/PCR-Cooler-PF-55940.html
Name Company Catalog Number Comments
Reagents
GenCatch Plasmid DNA Mini-Prep Kit Epoch Life Sciences 2160250 Plasmid DNA purification kit
http://www.epochlifescience.com/Product/PurificationKit/dna_mini.aspx
T4 DNA Ligase (HC) Promega M1794 High concentration T4 DNA Ligase
https://www.promega.com/products/cloning-and-dna-markers/molecular-biology-enzymes-and-reagents/t4-dna-ligase/?catNum=M1794
BbsI Restriction Enzyme New England Biolabs R0539L BbsI enzyme at 10,000 units/ml
https://www.neb.com/products/r0539-bbsi
BsaI Restriction Enzyme New England Biolabs R0535L BsaI enzyme at 10,000 units/ml
https://www.neb.com/products/r3535-bsai-hf
T4 DNA Ligase Buffer Pack Promega C1263 10x T4 DNA ligase buffer
https://www.promega.com/products/cloning-and-dna-markers/cloning-tools-and-competent-cells/t4-dna-ligase/
Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside (IPTG) Zymo Research I1001-25 0.5M IPTG Solution
http://www.zymoresearch.com/buffers-solutions/chemicals/isopropyl-ss-d-thiogalactopyranoside-iptg
5-bromo-4-chloro-3-indolyl ß-D-galactopyranoside (X-GAL) Zymo Research X1001-25 20 mg/ml X-GAL solution
http://www.zymoresearch.com/buffers-solutions/chemicals/5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ss-d-galactopyranoside-x-gal
Kanamycin Sulfate Zymo Research A1003-25 35 mg/ml Kanamycin solution
http://www.zymoresearch.com/buffers-solutions/antibiotics/kanamycin-sulfate
Carbenicillin (Disodium Salt) Fisher BP26481 1 g Carbenicillin (Ampicillin analog)
https://www.fishersci.com/shop/products/carbenicillin-disodium-salt-fisher-bioreagents-3/p-25005#?keyword=carbenicillin
SOC Broth Media Teknova S0225 Powder media used to make SOC broth
http://www.teknova.com/SOC-BROTH-MEDIA-p/s0225.htm
LB Broth (Lennox) Media Sigma-Aldrich L3022-1KG Powder media used to make LB broth
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l3022?lang=en&region=US
LB Broth with agar (Lennox) Media Sigma-Aldrich L2897-1KG LB with agar mix used for making solid media plates
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l2897?lang=en&region=US
Alpha-Select Gold Efficiency Competent Cells Bioline BIO-85027 High efficiency chemically competent E. coli cells
http://www.bioline.com/us/alpha-select-gold-efficiency.html
Name Company Catalog Number Comments
Primers
Primer VF 5'-TGCCACCTGACGTCTAAGAA-3'
Primers used for Sanger sequencing and colony PCRs
Primer VR 5'-ATTACCGCCTTTGAGTGAGC-3'
Primers used for Sanger sequencing and colony PCRs

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gardner, T. S., Cantor, C. R., Collins, J. J. Construction of a genetic toggle switch in Escherichia coli. Nature. 403 (6767), 339-342 (2000).
  2. Elowitz, M. B., Leibler, S. A synthetic oscillatory network of transcriptional regulators. Nature. 403 (6767), 335-338 (2000).
  3. Lutolf, M. P., Hubbell, J. A. Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering. Nat Biotechnol. 23 (1), 47-55 (2005).
  4. Anderson, J. C., Clarke, E. J., Arkin, A. P., Voigt, C. A. Environmentally controlled invasion of cancer cells by engineered bacteria. J Mol Biol. 355 (4), 619-627 (2006).
  5. Xie, Z., Wroblewska, L., Prochazka, L., Weiss, R., Benenson, Y. Multi-input RNAi-based logic circuit for identification of specific cancer cells. Science. 333 (6047), 1307-1311 (2011).
  6. Ro, D. K., et al. Production of the antimalarial drug precursor artemisinic acid in engineered yeast. Nature. 440 (7086), 940-943 (2006).
  7. Georgianna, D. R., Mayfield, S. P. Exploiting diversity and synthetic biology for the production of algal biofuels. Nature. 488 (7411), 329-335 (2012).
  8. Savage, D. F., Way, J., Silver, P. A. Defossiling fuel: how synthetic biology can transform biofuel production. ACS Chem Biol. 3 (1), 13-16 (2008).
  9. Fussenegger, M., et al. Streptogramin-based gene regulation systems for mammalian cells. Nat Biotechnol. 18 (11), 1203-1208 (2000).
  10. Boorsma, M., et al. A temperature-regulated replicon-based DNA expression system. Nat Biotechnol. 18 (4), 429-432 (2000).
  11. Malphettes, L., et al. A novel mammalian expression system derived from components coordinating nicotine degradation in arthrobacter nicotinovorans pAO1. Nucleic Acids Res. 33 (12), e107 (2005).
  12. Brophy, J. A., Voigt, C. A. Principles of genetic circuit design. Nat Methods. 11 (5), 508-520 (2014).
  13. Lou, C., Stanton, B., Chen, Y. J., Munsky, B., Voigt, C. A. Ribozyme-based insulator parts buffer synthetic circuits from genetic context. Nat Biotechnol. , (2012).
  14. Cardinale, S., Arkin, A. P. Contextualizing context for synthetic biology--identifying causes of failure of synthetic biological systems. Biotechnol J. 7 (7), 856-866 (2012).
  15. Carr, S. B., Beal, J., Densmore, D. M. Reducing DNA context dependence in bacterial promoters. PLoS One. 12 (4), e0176013 (2017).
  16. Yeung, E., Ng, A., Kim, J., Sun, Z. Z., Murray, R. M. Decision and Control (CDC), 2014 IEEE 53rd Annual Conference on. , 5405-5412 (2014).
  17. Engler, C., Gruetzner, R., Kandzia, R., Marillonnet, S. Golden gate shuffling: a one-pot DNA shuffling method based on type IIs restriction enzymes. PLoS One. 4 (5), e5553 (2009).
  18. Weber, E., Engler, C., Gruetzner, R., Werner, S., Marillonnet, S. A modular cloning system for standardized assembly of multigene constructs. PLoS One. 6 (2), e16765 (2011).
  19. Iverson, S. V., Haddock, T. L., Beal, J., Densmore, D. M. CIDAR MoClo: Improved MoClo Assembly Standard and New E. coli Part Library Enable Rapid Combinatorial Design for Synthetic and Traditional Biology. ACS Synth Biol. 5 (1), 99-103 (2016).
  20. Casini, A., Storch, M., Baldwin, G. S., Ellis, T. Bricks and blueprints: methods and standards for DNA assembly. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (9), 568-576 (2015).
  21. Bhatia, S. P., Smanski, M., Voigt, C. A., Densmore, D. M. Genetic design via combinatorial constraint specification. ACS Synth Biol. , (2017).
  22. Ham, T. S., et al. Design, implementation and practice of JBEI-ICE: an open source biological part registry platform and tools. Nucleic Acids Res. 40 (18), e141 (2012).
  23. Madsen, C., et al. The SBOL Stack: A Platform for Storing, Publishing, and Sharing Synthetic Biology Designs. ACS Synth Biol. 5 (6), 487-497 (2016).
  24. Knight, T. Draft standard for BioBrick biological parts. , (2007).
  25. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  26. Ma, A. C., et al. FusX: A Rapid One-Step Transcription Activator-Like Effector Assembly System for Genome Science. Hum Gene Ther. 27 (6), 451-463 (2016).
  27. Check Hayden, E. The automated lab. Nature. 516 (7529), 131-132 (2014).
  28. Nielsen, A. A., et al. Genetic circuit design automation. Science. 352 (6281), aac7341 (2016).
  29. Woodruff, L. B. A., et al. Registry in a tube: multiplexed pools of retrievable parts for genetic design space exploration. Nucleic Acids Res. 45 (3), 1553-1565 (2017).
  30. Hasty, J., McMillen, D., Collins, J. J. Engineered gene circuits. Nature. 420 (6912), 224-230 (2002).
  31. Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods Enzymol. 498, 349-361 (2011).
  32. Appleton, E., Tao, J., Haddock, T., Densmore, D. Interactive assembly algorithms for molecular cloning. Nat Methods. 11 (6), 657-662 (2014).
  33. Vasilev, V., Liu, C., Haddock, T., Bhatia, S., Adler, A., Yaman, F., Beal, J., Babb, J., Weiss, R., Densmore, D. A Software Stack for Specification and Robotic Execution of Protocols for Synthetic Biological Engineering. SynBERC Fall Retreat, Harvard University. , (2011).
  34. Beal, J., et al. An end-to-end workflow for engineering of biological networks from high-level specifications. ACS Synth Biol. 1 (8), 317-331 (2012).
  35. Bhatia, S., Densmore, D. Pigeon: a design visualizer for synthetic biology. ACS Synth Biol. 2 (6), 348-350 (2013).

Tags

Biyomühendislik sayı: 130 sentetik biyoloji sıvı taşıma Robotik modüler klonlama otomatik DNA derleme Kombinatorik kitaplık derlemesi biofoundry otomatik
Robot sıvı işleme derleme modüler DNA cihazların otomatik
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ortiz, L., Pavan, M., McCarthy, L.,… More

Ortiz, L., Pavan, M., McCarthy, L., Timmons, J., Densmore, D. M. Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices. J. Vis. Exp. (130), e54703, doi:10.3791/54703 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter