Introduction
Optogenetic ferramentas têm vindo a ganhar popularidade, em parte, porque podem ser usadas para decifrar a fiação das vias de sinalização 1-4. Eles baseiam-se na capacidade das proteínas fotoactiváveis para alterar a sua conformação e ligação de afinidade quando iluminada com luz. Combinando estas proteínas de elementos de sinalização permite a regulação específica de um único jogador dentro de complexas vias de sinalização intracelular 5-12. Consequentemente, uma via de sinalização pode ser estudada com alta resolução temporal e espacial.
A maioria dos estudos optogenetic baseados em células utilizam métodos baseados em microscopia combinados com a cultura na presença de luz, seguido por análise bioquímica 11,12. Em contraste, um citómetro de fluxo singulariza células ao longo de um capilar e mede o tamanho da célula, granularidade e intensidades de fluorescência. Este método tem grandes vantagens em relação a microscopia ou bioquímicos métodos, incluindo a capacidade de analisar thousands de células na resolução de uma única célula vivendo em um tempo muito curto. Por isso, é desejável combinar Optogenetics com a citometria de fluxo.
Para nosso conhecimento, não existe um protocolo estabelecido para citometria de fluxo optogenética. Um procedimento amplamente aceito é iluminar manualmente células de fora do tubo de reacção com dispositivos lanterna. No entanto, a iluminação manual no fluxo requer citómetro que a luz passe através do tubo de reacção e, para a imagem de células vivas, uma forma cilíndrica, da câmara de água aquecida. Isto faz com que a dispersão de luz substancial e perda de luz. Além disso, a intensidade da luz fornecida pela iluminação manual não é reprodutível entre experiências (ângulo, a distância, etc.) e não há um limite prático para o número de comprimentos de onda em um experimento.
Ao construir o dispositivo LED Thermo Flow, fomos capazes de superar essas limitações. Com este dispositivo, as células podem ser iluminados com determinados comprimentos de onda em um tempforma durante as medições de citometria de fluxo controlado-ratura. Isto permite a quantidades precisas e reprodutíveis de luz dentro e entre experimentos.
Para demonstrar a utilidade do nosso dispositivo in vivo, nós gravado o sinal de fluorescência de Dronpa em células B Ramos durante photoswitching. células B Ramos são derivados a partir de um linfoma de Burkitt humano. Dronpa é uma proteína fluorescente que existe como um monómero, dímero ou tetrâmero. Na sua forma monomérica, é não fluorescente. Iluminação com 400 nm de luz induz dimerização e tetramerização e torna a Proteína Fluorescente Dronpa. Este processo pode ser invertido por iluminação com luz de 500 nm. A proteína Dronpa tem sido utilizado para controlar a função e localização de proteínas de sinalização 4,13.
Aqui, nós expressa uma proteína Dronpa-Linker-Dronpa em células B Ramos para estudar photoswitching de Dronpa em um citômetro de fluxo. Usando o nosso dispositivo, fomos capazes de forma eficiente ereproducibly PHOTOSWITCH Dronpa durante a gravação de sua intensidade de fluorescência em tempo real. Este método oferece vantagens substanciais através de protocolos de iluminação atuais com iluminação manual e amplia significativamente o repertório experimental para obter ferramentas optogenética e compostos gaiola. Usando o nosso dispositivo será significativamente simplificar e acelerar a descoberta e desenvolvimento de novas ferramentas optogenética.
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Protocol
1. Desenho e Construção do Dispositivo
- As experiências-piloto
NOTA: A intensidade da luz necessária para uma ferramenta e célula do tipo optogenetic específico podem variar significativamente. experiências-piloto com protótipos são úteis para estimar a intensidade da luz mínimo necessário. A ferramenta optogenetic utilizado para as experiências seguintes é uma construção de fusão Dronpa-Ligante-Dronpa. A sequência Dronpa foi obtido comercialmente (Veja Lista de Materiais). Um longo ligante foi clonado entre duas sequências Dronpa para permitir a construção de expresso para formar dímeros intramoleculares (e intermoleculares). As etapas descritas abaixo pode ser adaptado a muitas outras ferramentas optogenetic ou substâncias opticamente controlados.- Transduzir linfócitos B Ramos com uma construção contendo Dronpa-Ligante-Dronpa seguindo as instruções do fabricante para a transdução usando o sobrenadante retroviral contendo-a partir de células de empacotamento. Colheita e contagem de células de acordo com um prériormente publicada protocolo 13.
- Ressuspender as células a uma concentração de 1 x 10 6 / mL em meio (RPMI 1640, 10% FCS, 2 mM de L-glutamina inactivado pelo calor, 100 U / mL de penicilina, 100 U / mL de estreptomicina, e 50 uM de 2-mercaptoetanol) e transferi-los para um tubo de FACS de vidro.
- Inserir o tubo num citómetro de fluxo e medir a intensidade de fluorescência de Dronpa (canal GFP) 14,15.
- Usar óculos de proteção para todas as novas medidas para proteger os olhos de comprimentos de onda, possivelmente prejudiciais.
- colocar manualmente uma luz LED 500 nm na parte exterior do tubo e continuar a medição da intensidade de fluorescência de Dronpa.
- Aumentar o número e / ou intensidade das luzes LED até Dronpa intensidade de fluorescência diminui.
- colocar manualmente uma luz LED 400 nm na parte exterior do tubo e continuar a medição da intensidade de fluorescência de Dronpa.
- Aumentar o número e / ou intensidade das luzes LED até o fluo Dronparescência intensidade aumenta.
- Use pelo menos tantas luzes LED para a construção do dispositivo, como previsto para ser necessário a partir do photoswitching nos passos 1.1.5 e 1.1.7.
- Construindo o dispositivo
NOTA: O dispositivo foi construído por uma loja de usinagem profissional, o Technik Arbeitsgruppe da Universidade de Freiburg. A maioria das peças são feitos e não comercialmente disponíveis. As dimensões exactas de cada parte está representada nas Figuras 1 e 2. Para esclarecer a montagem deste dispositivo, Suplementar Video 1 é fornecido e os passos mais importantes são descritos abaixo.- Um moinho peça a partir de cloreto de polivinilo (PVC) com as medidas exactas mostradas na Figura 1A.
- Insira luzes LED nos orifícios perfurados de peça A e selar cada buraco com cola de PVC para evitar fugas de água.
- Ligue LEDs a um transformador multicanal (cada comprimento de onda deve ocupar um elá separadael) com uma potência de saída ajustável de 0-29 mA.
- Anexar a bainha exterior (B) com 3 parafusos a peça A, tal como descrito para proteger os LEDs de danos físicos.
- Para ser capaz de ligar o dispositivo a uma bomba de água, cola, os grampos de tubo (C) nos orifícios perfurados da peça A (representada na Figura 1a, secção transversal Y: 9 mm e 61,5 milímetros) utilizando cola de PVC.
- Corte um tubo de Plexiglas longa 58,5 mm (D1).
- Fabricar peças D2 e D3 de vidro orgânico tal como representado na Figura 2.
- pedaço de cola D3 para a parte inferior de D1 com Plexiglas cola.
- Anexar uma borracha O-ring para peça D2 e cola-lo para o topo da D1 com Plexiglas cola.
NOTA: As peças de D1, D2 e D3 em conjunto, formam parte D. - Insira peça D na peça A com 3 parafusos.
- Teste o dispositivo de vazamento de água antes de aplicar energia ao transformador.
2. medição da cinética de uma ferramenta de optogenética
- células B Ramos Cultura em meio RPMI-meio (RPMI 1640, 10% de FCS, 2 mM de L-glutamina inactivado pelo calor, 100 U / mL de penicilina, 100 U / mL de estreptomicina, e 50 uM de 2-mercaptoetanol) a uma densidade de 3- 10 x 10 6 células / ml a 37 ° C e 5% de CO 2.
- Colheita células B Ramos por centrifugação a 350 xg e 4 ° C durante 5 min.
- Contagem de células utilizando uma câmara de contagem Neubauer, seguindo as instruções do fabricante e ressuspender 1-5 x 10 6 células em 600 uL forma.
- Transferência das células para um tubo FACS vidro, colocá-los no gelo e protegê-los da luz até a medição.
- Ligue o dispositivo a uma bomba de água aquecida e ajustar a temperatura para 37 ° C.
- Ao usar tubos de FACS de vidro, trocar o anel em O preto do citómetro de fluxo com uma borracha O-ring e adicionalmente aplicar gr silíciofacilidade.
- Insira cuidadosamente o tubo de FACS de vidro para dentro do dispositivo e conecte-o citômetro de fluxo (Figura 3).
- Inicie a medição e registro Dronpa intensidade de fluorescência (canal GFP).
- Iluminar a amostra de células com 400 nm ou 500 nm de luz, respectivamente, e registrar a intensidade de fluorescência Dronpa (canal GFP).
- Analisar os dados experimentais com fluxo adequado citômetro software. Gráfico de dispersão para a frente contra dispersão sideward e portão as células vivas. Traça-se a intensidade de fluorescência Dronpa ao longo do tempo.
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Representative Results
Usando o fluxo Thermo LED com um citômetro de fluxo
O núcleo funcional do dispositivo é uma câmara cilíndrica, em que as luzes LED estão dispostas de uma maneira circular, apontando para dentro. Esta câmara pode ser ligado a um abastecimento de água e a bomba, o que permite controlar a temperatura dos LEDs, bem como a amostra de células. Os LEDs são ligados a um transformador e, por conseguinte, a intensidade da luz de cada comprimento de onda pode ser controlado individualmente. O centro do dispositivo acomoda um tubo FACS tamanho padrão, que pode ser ligado à maioria citómetros de fluxo convencionais (Figuras 4 e 5). Para mostrar que a iluminação no nosso dispositivo não conduz a um aquecimento indesejado das células, medimos a temperatura de PBS iluminado ao longo do tempo (Figura 6) para três comprimentos de onda diferentes. A iluminação com 360 nm, 400 nm ou 500 nm conduz a uma únicaaumento marginal temperatura. No geral, o dispositivo aqui apresentado permite a iluminação reprodutível de amostras de células de temperatura controlada a ser medido num citómetro de fluxo.
Photoswitching de Dronpa
Um vector de expressão que codifica uma construção de fusão 13,16 Dronpa-Ligante-Dronpa foi clonado e transduzido para as células B Ramos. Como representado na Figura 7, o objectivo era controlar a conformação desta proteína de fusão com luz de comprimentos de onda específicos. Utilizando o nosso dispositivo, a proteína de fusão Dronpa-Ligante-Dronpa citosólico foi photoswitched várias vezes (Figura 8, esquerda). Mudar para o estado escuro ocorre lentamente, ao passo que a mudança para o estado brilhante acontece quase instantaneamente. A recuperação de fluorescência espontânea de Dronpa no escuro mostra que photoswitching eficiente de forma brilhante requer iluminação específica esó ocorre lentamente espontaneamente (Figura 8, à direita).
Foi realizada uma análise cinética das propriedades photoswitching (Figura 9). As pistas para as cinéticas de comutação foram calculados para a 4 minutos iniciais de iluminação. A inclinação para a recuperação espontânea foi calculada para o 4 min inicial no escuro.
A análise cinética mostra, que a velocidade photoswitching Dronpa é globalmente muito reprodutível. Em contraste, a recuperação espontânea de fluorescência Dronpa no escuro é muito ineficiente. Mesmo depois de mais tempo de incubação no escuro, apenas cerca de 10% da fluorescência Dronpa é recuperado. Isso mostra que, de fato a iluminação em nosso dispositivo induz photoswitching.
Assim, usando o método descrito, pode-se gerar em tempo real photoswitching dados num citómetro de fluxo, que podeser traduzido em uma avaliação cinética das muitas ferramentas optogenética.
Figura 1: Esquema de construção da camada exterior. Todas as peças representadas são feitos a partir de cloreto de polivinila (PVC). Parte A: peça cilíndrica de PVC com furos para inserir LEDs e os clipes de tubo. Parte B: A bainha exterior para proteger os LEDs de danos físicos. Parte C: O clipe de tubo que liga a cavidade interna com tubos de borracha para permitir o resfriamento de água. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Esquema de construção da camada interna. Todas as peças representadas são feitas de Plexiglas. Parte D: Esta peça é constituída por três peças D1, D2 e D3 e constitui a unidade que envolve o tubo de FACS. Parte D1: tubo cilíndrico Plexiglas. Parte D2: tampa de fundo da camada interior. Parte D3: Tampa da camada interior. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Utilizando o dispositivo com um citómetro de fluxo. A1: entrada da amostra de um citômetro de fluxo; A2: tubo de FACS ligado à entrada de amostras; B: O dispositivo que envolve o tubo de FACS; C: entrada da amostra; D: entrada da amostra com o dispositivo.ove.com/files/ftp_upload/54707/54707fig3large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Fluxo de trabalho esquemática do dispositivo. A: As células são iluminadas no dispositivo (inferior esquerdo) e, simultaneamente, recolhido e analisado no citómetro de fluxo (parte superior esquerda). Isto permite, por exemplo, a análise das propriedades cinéticas de uma ferramenta optogenetic (superior direito). B: a secção transversal do dispositivo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Diagrama de fluxo do processo do aparelho. Um ou mor E LED luzes de comprimentos de onda específicos iluminar a amostra de células em um tubo FACS. Os LEDs são rodeadas por água, que é constantemente trocado por um circulador de banho de aquecimento para manter a temperatura da amostra de células estável. Para as experiências de células vivas, a temperatura é ajustada a 37 ° C. Durante esta iluminação de temperatura controlada, as células são retomadas no citómetro de fluxo para análise. Esta configuração permite, por exemplo, para analisar as propriedades cinéticas de uma ferramenta optogenetic. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: A temperatura de PBS iluminado ao longo do tempo. 1 mL de PBS num tubo de FACS de vidro foi iluminado ao longo do tempo com 360 nm de luz, a luz de 400 nm ou 500 nm de luz.carregar 54707 / 54707fig6large.jpg "target =" / _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Modelo de photoswitching da proteína Dronpa-Linker-Dronpa. Iluminação com 400 nm de luz vai dimerizar (e tetramerize) Dronpa e torná-lo fluorescente. A iluminação com luz de 500 nm vai conduzir à dissociação das proteínas Dronpa, onde monomérica Dronpa é não fluorescente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Caracterização das propriedades photoswitching Dronpa usando o Thermo Fluxo LED combinada com f baixo citometria. As células foram iluminadas como indicado acima do eixo dos X e o Dronpa intensidade média de fluorescência (IMF) é representada ao longo do tempo. A proteína de fusão Dronpa-Ligante-Dronpa pode ser photoswitched várias vezes usando o aparelho (à esquerda). A recuperação espontânea da intensidade de fluorescência Dronpa só ocorre lentamente e ineficazmente (à direita). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9: A análise cinética de Dronpa photoswitching. A cinética de Dronpa photoswitching foram calculados para os primeiros 4 min. de iluminação e a recuperação foi calculada para os primeiros 4 min. de incubação no escuro, tal como indicado pelas áreas coloridas. As pistas para cada cálculo são representados em números em negrito.ource.jove.com/files/ftp_upload/54707/54707fig9large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A Thermo Fluxo de LED é um dispositivo inovador para estudar ferramentas optogenética em um citômetro de fluxo.
Até agora, as amostras optogenética foram iluminados apenas com lasers de microscopia ou dispositivos lanterna 11,12. Dependendo do ângulo e distância da lanterna para a amostra, uma variabilidade substancial na quantidade de iluminação está prevista entre experiências. Além disso, há um limite para o número de lanternas uma única pessoa pode operar em um experimento. Isto restringe o repertório experimental e reprodutibilidade. Estas limitações foram tratadas durante o desenvolvimento do nosso dispositivo, que pode ser utilizado para caracterizar a cinética photoswitching tempo real em células vivas. Para nosso conhecimento, não existe um dispositivo comparável.
Na configuração atual, até 30 LEDs pode ser construído em uma câmara Thermo Flow. Assim, dependendo das intensidades de luz requeridas para cada comprimento de onda, um único dispositivo pode ser nósed para uma ampla variedade de ferramentas de optogenética. Os protocolos estabelecidos photoswitching pode então ser optimizado para leituras funcionais, por exemplo, medições de fluxos de cálcio. Nosso dispositivo pode ser adequado para outras substâncias opticamente controlados, tais como os compostos de gaiola ou fluoróforos fotoactiv�eis.
Dependendo da pergunta científica e amostras utilizados, protocolos individualizados pode ser estabelecida rapidamente. O uso de tubos de vidro, em vez de poliestireno ou de polipropileno tubos é recomendado para limitar a citotoxicidade induzida pela luz em comprimentos de onda entre 400-500 nm. Todas as linhas celulares testadas sobreviveram iluminação (360 nm, 400 nm ou 500 nm) durante até uma hora, em tubos de vidro. Tentámos para investigar a causa da morte celular durante a iluminação em tubos de plástico através da realização de experimentos de transferência. Nós iluminado células em PBS ou meio RPMI com luz de diferentes comprimentos de onda e, em seguida, transferido para o sobrenadante de células não iluminado para medir a morte celular. Nenhum dos recolhidoOs sobrenadantes causou morte celular significativa nas células receptoras (dados não mostrados). Além disso, a temperatura de PBS iluminado em poliestireno, ou tubos de polipropileno é quase idêntica à da temperatura em tubos de vidro. Por isso, só podemos especular sobre a causa da morte celular. Iluminado plástico pode libertar uma substância instável ou radiação de um comprimento de onda que é tóxico para as células.
A escolha do meio para cada experiência é importante. A capacidade tampão deve ser considerado e reagentes diferentes, como pH-indicadores, absorver diferentes comprimentos de onda em diferentes graus. Além disso, a sobrevivência de células difere significativamente, por exemplo, quando se comparam livre de FCS para FCS contendo meios.
O objectivo da titulação luz é usar a quantidade mínima de luz necessária para o máximo photoswitching. Para a maioria das experiências, é favorável para maximizar a velocidade da photoswitch e, portanto, maximizar a intensidade da luz. Mas, dependendo do wavelength e tipo de célula, a luz pode ter efeitos diretos sobre o comportamento de sinalização, que é por iluminação excessiva deve ser evitada.
É possível programar os horários de luz para o nosso dispositivo e ligá-lo a um computador como é comum para outros dispositivos leves. No entanto, uma vez que a maioria dos citómetros de fluxo estão em locais de trabalho comuns partilhadas por numerosos laboratórios diferentes, é melhor para manter o dispositivo tão pequeno e portátil quanto possível. Além disso, a movimentação manual de nosso dispositivo para uma configuração de duas cores, tal como apresentado aqui é tão simples, que a programação seria apenas marginalmente melhorar o procedimento experimental.
Tomados em conjunto, nós apresentamos aqui um dispositivo inovador, que combina o poder de ferramentas de optogenética e citometria de fluxo. Isso vai simplificar substancialmente a caracterização e desenvolvimento de ferramentas de optogenética in vivo e expandir o repertório experimental.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass FACS tube | Thermo Fisher Scientific; Waltham, USA | 14-961-26 | Borosilicate glass tubes 12x75 mm |
| Flow Cytometer | BD Bioscienceg; Heidelberg, Germany | Fortessa II | Special Order |
| Dronpa: pcDNA3-mNeptune2-N | Addgene; Cambridge, USA | 41645 | |
| PolyJet | SignaGen, Rockville, USA | SL100688 | |
| LED 505 nm | Avago Technologies; Boeblingen, Germany | HLMP-CE34-Y1CDD | |
| LED 400 nm | Avago Technologies; Boeblingen, Germany | UV5TZ-400-15 | |
| Plexiglas tube 15 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 76999 | |
| Plexiglas 3 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692230 | |
| Plexiglas 2.5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692225 | |
| Plexiglas 1.5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692215 | |
| PVC tile 5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.005 | |
| PVC tile 6 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.006 | |
| PVC block 50 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.050 | |
| RPMI | Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany | 61870-010 | |
| 2-Mercaptoethanol | EMD; Germany | 805740 | |
| FCS | PAN Biotech; Aidenbach, Germany | P30-3302 | |
| Penicillin/Strptomycin (10,000 U/mL) | Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany | 15140-122 | |
| Acrifix plexiglas glue | Evonic industries, Essen, Germany | 1R0192 | |
| Tangit PVC-U glue | Henkel, Düsseldorf, Germany |
References
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