Introduction
تم أدوات علم البصريات الوراثي تكتسب شعبية، في جزء منه لأنها يمكن أن تستخدم لفك الأسلاك من مسارات الإشارات 1-4. وهي تستند إلى قدرة بروتينات photoactivatable تغيير على التشكل وملزمة تقارب عندما مضيئة مع الضوء. دمج هذه البروتينات لعناصر إشارات تسمح لتنظيم محدد من لاعب واحد داخل معقدة مسارات الإشارات بين الخلايا 5-12. وبالتالي، فإن مسار الإشارات يمكن دراستها مع القرار الزماني والمكاني عالية.
معظم الدراسات علم البصريات الوراثي القائم على خلية تستخدم أساليب تعتمد على المجهر جنبا إلى جنب مع زراعة في وجود الضوء، تليها تحليل الكيمياء الحيوية 11،12. في المقابل، تدفق singularizes الكريات الخلايا على طول شعري ويقيس حجم الخلية، تحبب وكثافة مضان. هذا الأسلوب له مزايا كبيرة خلال الفحص المجهري أو البيوكيميائية الطرق، بما في ذلك القدرة على تحليل thousanس من الخلايا في قرار وحيدة الخلية تعيش في وقت قصير جدا. وبالتالي، فمن المستحسن أن الجمع بين علم البصريات الوراثي مع التدفق الخلوي.
على حد علمنا، ليس هناك بروتوكول تأسيس لالتدفق الخلوي علم البصريات الوراثي. إجراء مقبولة على نطاق واسع هو إلقاء الضوء خلايا يدويا من خارج أنبوب تفاعل مع الأجهزة مصباح يدوي. ومع ذلك، والإضاءة اليدوية في تدفق يتطلب الكريات ضوء أن يمر من خلال أنبوب رد فعل، ولتصوير الخلايا الحية، أسطواني، وغرفة للمياه ساخنة. هذا يسبب تشتت الضوء كبير وفقدان للضوء. وعلاوة على ذلك، فإن شدة الضوء التي تقدمها إضاءة يدوية ليست استنساخه بين التجارب (زاوية، والمسافة، الخ) وليس هناك حد عملي لعدد من موجات في تجربة واحدة.
عن طريق بناء جهاز LED الحرارية التدفق، كنا قادرين على التغلب على هذه القيود. مع هذا الجهاز، وخلايا يمكن أن تكون مضيئة مع موجات محددة في درجة الحرارةالطريقة أثناء قياس تدفق cytometric التي تسيطر عليها erature. وهذا يسمح لكميات محددة وقابلة للتكرار للضوء داخل وبين التجارب.
للتدليل على فائدة الجهاز لدينا في الجسم الحي، سجلنا إشارة مضان من Dronpa في الخلايا راموس B خلال photoswitching. وتستمد الخلايا راموس B من سرطان الغدد الليمفاوية بوركيت البشري. Dronpa هو ببروتين موجود كما مونومر، ديمر أو tetramer. في شكله أحادى، فمن غير الفلورسنت. الإضاءة مع 400 نانومتر الخفيفة الحث dimerization وtetramerization ويجعل البروتين الفلوري Dronpa. هذه العملية يمكن عكسها من خلال الإضاءة مع 500 نانومتر الخفيفة. وقد استخدم البروتين Dronpa للسيطرة على وظيفة، والمكان من الإشارات البروتينات 4،13.
هنا، أعربنا عن بروتين Dronpa-رابط-Dronpa في الخلايا راموس B لدراسة photoswitching من Dronpa في قياس التدفق الخلوي. استخدام الجهاز لدينا، كنا قادرين على كفاءة وبتكاثر photoswitch Dronpa أثناء تسجيل كثافة مضان في الوقت الحقيقي. وهذه الطريقة توفر مزايا كبيرة عبر بروتوكولات الإضاءة الحالية مع إضاءة يدوية ويوسع بشكل كبير من ذخيرة تجريبي للأدوات علم البصريات الوراثي والمركبات القفص. استخدام الجهاز لدينا سيسهل بشكل كبير والإسراع في اكتشاف وتطوير أدوات علم البصريات الوراثي جديدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تصميم وبناء جهاز
- تجارب رائدة
ملاحظة: شدة الضوء المطلوبة لعلم البصريات الوراثي أداة وخلية نوع معين قد تختلف بشكل كبير. التجارب الرائدة مع نماذج مفيدة لتقدير الحد الأدنى من شدة الضوء اللازمة. الأداة علم البصريات الوراثي المستخدمة في التجارب التالية هي عبارة عن اندماج بناء Dronpa-رابط-Dronpa. تم الحصول على تسلسل Dronpa تجاريا (انظر قائمة من المواد). تم استنساخ ورابط طويلة بين اثنين من سلاسل Dronpa للسماح للبناء أعرب لتشكيل dimers ضمجزيئي عامل ضمن الجزيئ (وبين الجزيئات). الخطوات الموضحة أدناه يمكن أن تتكيف مع العديد من الأدوات علم البصريات الوراثي الأخرى أو المواد الخاضعة للرقابة بصريا.- تنبيغ الخلايا الليمفاوية B راموس مع Dronpa-رابط-Dronpa تحتوي على بناء باتباع إرشادات الشركة المصنعة لتنبيغ باستخدام طاف تحتوي على فيروسات، من خلايا التعبئة والتغليف. الحصاد وخلايا العد وفقا لمرحلة ما قبلنشرت viously بروتوكول 13.
- Resuspend الخلايا بتركيز 1 × 10 6 / مل في المتوسط (RPMI 1640، 10٪ الحرارة المعطل FCS، 2 مم L-الجلوتامين، و 100 U / مل البنسلين، و 100 U / مل الستربتومايسين، و 50 ميكرومتر 2-المركابتويثانول) ونقلها إلى أنبوب زجاجي FACS.
- إدراج أنبوب إلى قياس التدفق الخلوي وقياس كثافة مضان من Dronpa (قناة GFP) 14،15.
- ارتداء النظارات الواقية لجميع المزيد من الخطوات لحماية العينين من موجات ربما ضارة.
- يدويا وضع ضوء 500 نانومتر الصمام على السطح الخارجي للأنبوب ونستمر في قياس كثافة مضان من Dronpa.
- زيادة عدد و / أو شدة أضواء LED حتى تنخفض Dronpa كثافة مضان.
- يدويا وضع ضوء 400 نانومتر الصمام على السطح الخارجي للأنبوب ونستمر في قياس كثافة مضان من Dronpa.
- زيادة عدد و / أو شدة أضواء LED حتى فلوو Dronparescence زيادة كثافة.
- استخدام ما لا يقل عن العديد من أضواء LED لبناء الجهاز كما يتوقع أن تكون ضرورية من photoswitching في خطوات 1.1.5 و 1.1.7.
- بناء الجهاز
ملاحظة: تم بناء الجهاز عن طريق متجر بالقطع المهنية، وArbeitsgruppe تكنيك من جامعة فرايبورغ. والعرف معظم أنحاء وغير متوفرة تجاريا. وصفت الأبعاد الدقيقة من كل جزء في أرقام 1 و 2. لتوضيح تجميع هذا الجهاز، التكميلية فيديو 1 يتم توفير وموصوفة أهم الخطوات الأساسية أدناه.- مطحنة قطعة ومن البولي فينيل كلورايد (PVC) مع القياسات الدقيقة هو مبين في الشكل 1A.
- إدراج أضواء LED في حفر ثقوب في قطعة ووختم كل ثقب مع الغراء بولي كلوريد الفينيل لمنع تسرب المياه.
- توصيل المصابيح على محول متعدد القنوات (كل طول موجي يجب أن تحتل chann منفصلشرم) مع انتاج الطاقة القابلة للتعديل 0-29 مللي أمبير.
- إرفاق غمد الخارجي (ب) مع 3 مسامير لقطعة وكما هو مبين لحماية المصابيح من الأضرار المادية.
- لتكون قادرة على توصيل الجهاز إلى مضخة المياه، والغراء في لقطات أنبوب (C) في حفر ثقوب في قطعة و(يصور في الشكل 1A، المقطع العرضي Y: 9 ملم و 61.5 ملم) باستخدام الغراء بولي كلوريد الفينيل.
- قطع أنبوب زجاجي طويل 58.5 ملم (D1).
- تصنيع قطع D2 و D3 من زجاجي كما هو مبين في الشكل 2.
- الغراء قطعة D3 إلى أسفل D1 مع زجاجي الغراء.
- إرفاق المطاط يا الدائري إلى قطعة D2 والغراء إلى أعلى D1 مع زجاجي الغراء.
ملاحظة: القطع D1 و D2 و D3 معا تشكل قطعة د. - إدراج قطعة D في قطعة ومع 3 مسامير.
- اختبار جهاز لتسرب الماء قبل تطبيق السلطة للمحول.
2. قياس حركية لأداة علم البصريات الوراثي
- ثقافة الخلايا راموس B في RPMI المتوسطة (RPMI 1640، و 10٪ الحرارة المعطل FCS، 2 مم L-الجلوتامين، و 100 U / مل البنسلين، و 100 U / مل الستربتومايسين، و 50 ميكرومتر 2-المركابتويثانول) في كثافة 3- 10 × 10 6 خلية / مل عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
- حصاد الخلايا راموس B عن طريق الطرد المركزي في 350 x ج و 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
- عد الخلايا باستخدام غرفة عد نويباور باتباع إرشادات الشركة المصنعة و resuspend 1-5 × 10 6 خلايا في 600 ميكرولتر المتوسطة.
- نقل الخلايا إلى أنبوب FACS الزجاج، ووضعها على الجليد وحمايتها من ضوء حتى القياس.
- وصل الجهاز إلى مضخة مياه ساخنة وضبط درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية.
- عند استخدام أنابيب زجاجية نظام مراقبة الأصول الميدانية، تبادل سوداء يا الدائري من قياس التدفق الخلوي مع المطاط يا الدائري وبالإضافة إلى تطبيق غرام السيليكونسهولة.
- إدراج بعناية الزجاج FACS أنبوب في الجهاز وتوصيله إلى قياس التدفق الخلوي (الشكل 3).
- بدء تشغيل قياس وتسجيل Dronpa كثافة الفلورسنت (قناة GFP).
- إلقاء الضوء على عينة الخلايا مع 400 نانومتر أو 500 نانومتر الخفيفة على التوالي وسجل كثافة مضان Dronpa (قناة GFP).
- تحليل البيانات التجريبية مع تدفق مناسب الكريات البرمجيات. مؤامرة مبعثر إلى الأمام ضد مبعثر sideward وبوابة الخلايا الحية. رسم كثافة مضان Dronpa مع مرور الوقت.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باستخدام التدفق الحراري LED مع عداد الكريات تدفق
جوهر الوظيفي للجهاز هو غرفة اسطوانية يتم ترتيب أضواء بطريقة دائرية لافتا إلى الداخل التي الصمام. هذه القاعة يمكن توصيل إمدادات المياه والمضخات، والذي يسمح للسيطرة على درجة حرارة المصابيح، فضلا عن عينة الخلية. يتم توصيل المصابيح على المحولات وبالتالي شدة الضوء لكل طول موجي يمكن السيطرة عليها بشكل فردي. مركز الجهاز يستوعب أنبوب حجم FACS القياسية، والتي يمكن ان تكون مرتبطة على معظم أجهزة قياس التدفق الخلوي القياسية (أرقام 4 و 5). تبين أن الإضاءة في الجهاز لدينا لا يؤدي إلى تسخين غير مرغوب فيها من الخلايا، قمنا بقياس درجة الحرارة من برنامج تلفزيوني مضيئة على مر الزمن (الشكل 6) لمدة ثلاثة أطوال موجية مختلفة. الإضاءة مع 360 نانومتر و 400 نانومتر أو 500 نانومتر تؤدي إلا لارتفاع درجة الحرارة الحدية. وعموما، فإن جهاز المعروضة هنا يسمح للإضاءة استنساخه من خلية عينات التحكم في درجة حرارته إلى أن تقاس في قياس التدفق الخلوي.
Photoswitching من Dronpa
تم استنساخ ناقلات التعبير ترميز Dronpa-رابط-Dronpa 13،16 الانصهار بناء وtransduced في الخلايا راموس ب. كما هو مبين في الشكل 7، كان الهدف هو السيطرة على التشكل من هذا البروتين الانصهار مع ضوء أطوال موجية محددة. استخدام الجهاز لدينا، وphotoswitched في عصاري خلوي Dronpa-رابط-Dronpa انصهار بروتين عدة مرات (الشكل 8، يسار). التحول إلى دولة مظلمة يحدث ببطء، في حين أن التحول إلى دولة مشرق يحدث على الفور تقريبا. انتعاش مضان عفوية من Dronpa في الظلام ويظهر أن photoswitching فعال لنموذج مشرق يتطلب إضاءة معينة وفقط يحدث ببطء من تلقاء أنفسهم (الشكل 8، يمين).
أجرينا التحليل الحركي من خصائص photoswitching (الشكل 9). حسبت المنحدرات لحركية التحول لمدة 4 دقائق الأولي من الإضاءة. تم حساب المنحدر من أجل استعادة عفوية لمدة 4 دقائق الأولي في الظلام.
ويظهر التحليل الحركي، أن سرعة photoswitching Dronpa هي عموما استنساخه جدا. في المقابل، الشفاء التلقائي من Dronpa مضان في الظلام غير فعال جدا. حتى بعد حضانة أطول في الظلام، يتم استرداد سوى حوالي 10٪ من مضان Dronpa. وهذا يدل على أن الواقع الإضاءة في الجهاز لدينا يدفع photoswitching.
وبالتالي، باستخدام طريقة وصفها، ويمكن أن تولد في الوقت الحقيقي photoswitching البيانات في قياس التدفق الخلوي، والتي يمكنأن تترجم إلى تقييم الحركية من العديد من الأدوات علم البصريات الوراثي.
الشكل 1: خطة بناء الطبقة الخارجية. والعرف كل قطعة يصور من البولي فينيل كلورايد (PVC). قطعة ج: قطعة اسطوانية PVC مع حفر ثقوب لإدخال المصابيح ومقاطع الأنبوب. قطعة ب: غمد الخارجي لحماية المصابيح من الأضرار المادية. قطعة C: مقطع الأنبوب الذي يربط تجويف الداخلي مع أنابيب مطاطية للسماح للمياه التبريد. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: خطة بناء الطبقة الداخلية. كلها مصنوعة قطع يصور من زجاجي. قطعة D: تتألف هذه القطعة من ثلاث قطع D1 و D2 و D3 ويشكل وحدة تضم أنبوب FACS. قطعة D1: أسطواني زجاجي أنبوب. قطعة D2: الغطاء السفلي من الطبقة الداخلية. قطعة D3: غطاء للطبقة الداخلية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3: استخدام الجهاز مع قياس التدفق الخلوي. A1: عينة مدخل لقياس التدفق الخلوي. A2: أنبوب FACS متصلا مدخل العينة. ب: الجهاز يحتوى على أنبوب FACS. C: مدخل عينة. D: مدخل عينة مع الجهاز.ove.com/files/ftp_upload/54707/54707fig3large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: سير العمل التخطيطي للجهاز. تضاء خلايا في الجهاز (أسفل اليسار) واتخذت في وقت واحد صعودا وتحليلها في قياس التدفق الخلوي (أعلى اليسار): A. وهذا ما يسمح، على سبيل المثال، وتحليل خصائص الحركية للأداة علم البصريات الوراثي (أعلى اليمين). باء: المقطع العرضي للجهاز. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5: عملية تدفق الرسم البياني للجهاز. واحد أو مور البريد أضواء LED من موجات محددة تضيء عينة الخلية في أنبوب FACS. ويحيط المصابيح عن طريق المياه، التي يتم تبادلها باستمرار من قبل دائري حمام ساخن للحفاظ على درجة حرارة مستقرة عينة الخلية. للتجارب الخلية الحية، ويتم ضبط درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية. خلال هذه الإضاءة التي تسيطر عليها درجة الحرارة، ويتم أخذ خلايا تصل إلى الكريات تدفق للتحليل. يسمح هذا الإعداد، على سبيل المثال، لتحليل الخصائص الحركية للأداة علم البصريات الوراثي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: درجة الحرارة من برنامج تلفزيوني مضيئة عبر الزمن. كانت مضاءة 1 مل من برنامج تلفزيوني في كوب أنبوب FACS مع مرور الوقت مع 360 ضوء نانومتر و 400 نانومتر الخفيفة أو 500 نانومتر الخفيفة.تحميل / 54707 / 54707fig6large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 7: نموذج لphotoswitching من البروتين Dronpa-رابط-Dronpa. وإضاءة مع 400 نانومتر الخفيفة dimerize (وtetramerize) Dronpa وتجعله الفلورسنت. وإضاءة مع 500 نانومتر الخفيفة يؤدي إلى تفكك البروتينات Dronpa، حيث مركب بسيط Dronpa غير قابلة للفلوري. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 8: توصيف خصائص photoswitching Dronpa باستخدام الحرارية تدفق LED جنبا إلى جنب مع f الخلوي منخفض. أضيئت الخلايا كما هو مبين أعلاه المحور العاشر وDronpa يعني كثافة مضان (MFI) ويصور مرور الوقت. البروتين الانصهار Dronpa-رابط-Dronpa يمكن photoswitched عدة مرات باستخدام جهاز (يسار). الشفاء التلقائي من كثافة مضان Dronpa يحدث إلا ببطء وغير فعال (يمين). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 9: تحليل الحركية من Dronpa photoswitching. حسبت حركية Dronpa photoswitching لمدة 4 دقائق الأولي. من الإضاءة والانتعاش وحسبت لمدة 4 دقائق الأولي. حضانة في الظلام كما يتضح من المناطق الملونة. وصفت المنحدرات لكل حساب في أعداد جريئة.ource.jove.com/files/ftp_upload/54707/54707fig9large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
والحرارية تدفق الصمام هو أداة مبتكرة لدراسة أدوات علم البصريات الوراثي في عداد الكريات التدفق.
حتى الآن، تم مضيئة عينات علم البصريات الوراثي فقط مع الليزر المجهر أو الأجهزة مصباح يدوي 11،12. اعتمادا على زاوية ومسافة المصباح للعينة، ومن المتوقع تقلب كبير في كمية الإضاءة بين التجارب. وعلاوة على ذلك، هناك حد اقصى لعدد من البطاريات يمكن لشخص واحد يعمل في تجربة. وهذا يحد من ذخيرة التجريبية والتكاثر. وتم تناول هذه القيود خلال تطوير الجهاز لدينا، والتي يمكن استخدامها لوصف حركية photoswitching الوقت الحقيقي في الخلايا الحية. على حد علمنا، لا يوجد جهاز مشابه.
في التكوين الحالي، وتصل إلى 30 المصابيح يمكن أن يبنى في واحدة غرفة الحرارية التدفق. وهكذا، وهذا يتوقف على شدة الضوء المطلوبة لكل طول موجي، يمكن لجهاز واحد يكون لناإد لمجموعة واسعة من أدوات علم البصريات الوراثي. ويمكن بعد ذلك أن يكون الأمثل البروتوكولات photoswitching التي أنشئت لقراءات وظيفية، على سبيل المثال، قياسات تدفق الكالسيوم. قد يكون لدينا جهاز مناسبة للمواد الخاضعة للرقابة بصريا، مثل المركبات في قفص أو fluorophores photoactivatable.
اعتمادا على مسألة علمية والعينة المستخدمة، يمكن أن تنشأ بروتوكولات فردية بسرعة. من المستحسن استخدام أنابيب زجاجية بدلا من البوليسترين أو البولي بروبيلين أنابيب للحد من السمية الخلوية التي يسببها الضوء بأطوال موجية بين 400-500 نانومتر. نجا جميع خطوط الخلايا اختبار إضاءة (360 نانومتر و 400 نانومتر أو 500 نانومتر) لمدة تصل إلى ساعة واحدة في أنابيب زجاجية. حاولنا تحقيق في سبب موت الخلايا خلال الإضاءة في أنابيب بلاستيكية عن طريق إجراء التجارب نقل. نحن مضيئة الخلايا في برنامج تلفزيوني أو RPMI مع ضوء أطوال موجية مختلفة، ثم نقل إلى طاف الخلايا غير مضاءة لقياس موت الخلايا. أيا من جمعهاsupernatants تسبب موت الخلايا كبير في خلايا المتلقي (لا تظهر البيانات). أيضا، ودرجة الحرارة من برنامج تلفزيوني مضيئة في البوليسترين، أو أنابيب البولي بروبلين هي متطابقة تقريبا لدرجة الحرارة في أنابيب زجاجية. ومن هنا، يمكننا التكهن فقط على سبب موت الخلايا. البلاستيك مضيئة قد تفرج مادة غير مستقرة أو الإشعاع من الطول الموجي التي هي سامة للخلايا.
إن اختيار الوسيلة المستخدمة لكل تجربة مهم. يجب النظر في قدرة التخزين المؤقت والكواشف المختلفة، مثل الرقم الهيدروجيني، المؤشرات، تمتص موجات مختلفة بدرجات مختلفة. وعلاوة على ذلك، بقاء الخلية يختلف إلى حد كبير، على سبيل المثال، عند مقارنة حرة FCS لFCS التي تحتوي على وسائل الاعلام.
هدف المعايرة الخفيفة إلى استخدام كمية ضئيلة من الضوء الضروري لتحقيق أقصى قدر photoswitching. بالنسبة لمعظم التجارب، فمن مواتية لتحقيق أقصى قدر من سرعة photoswitch وبالتالي تحقيق أقصى قدر من شدة الضوء. ولكن، وهذا يتوقف على wavelength ونوع من الخلايا، يمكن أن الضوء تؤثر بشكل مباشر على سلوك الإشارات، ولهذا السبب ينبغي تجنب الإضاءة المفرطة.
فمن الممكن لبرنامج جداول خفيفة لدينا جهاز وتوصيله إلى جهاز الكمبيوتر كما هو شائع لأجهزة ضوء الأخرى. ومع ذلك، لأن معظم أجهزة قياس التدفق الخلوي هي في أماكن العمل المشتركة بين العديد من مختبرات مختلفة، فمن الأفضل للحفاظ على جهاز صغيرة ومحمولة ممكن. وعلاوة على ذلك، والتعامل اليدوي للجهاز من أجل الإعداد اللونين كما وردت هنا هو في غاية البساطة، من شأنه أن البرمجة تحسين هامشي إجراء التجارب.
مجتمعة، فإننا نقدم هنا جهاز المبتكر، الذي يجمع بين قوة من أدوات علم البصريات الوراثي والتدفق الخلوي. وهذا تبسيط كبير في توصيف وتطوير أدوات علم البصريات الوراثي في الجسم الحي وتوسيع ذخيرة التجريبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass FACS tube | Thermo Fisher Scientific; Waltham, USA | 14-961-26 | Borosilicate glass tubes 12x75 mm |
| Flow Cytometer | BD Bioscienceg; Heidelberg, Germany | Fortessa II | Special Order |
| Dronpa: pcDNA3-mNeptune2-N | Addgene; Cambridge, USA | 41645 | |
| PolyJet | SignaGen, Rockville, USA | SL100688 | |
| LED 505 nm | Avago Technologies; Boeblingen, Germany | HLMP-CE34-Y1CDD | |
| LED 400 nm | Avago Technologies; Boeblingen, Germany | UV5TZ-400-15 | |
| Plexiglas tube 15 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 76999 | |
| Plexiglas 3 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692230 | |
| Plexiglas 2.5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692225 | |
| Plexiglas 1.5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692215 | |
| PVC tile 5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.005 | |
| PVC tile 6 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.006 | |
| PVC block 50 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.050 | |
| RPMI | Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany | 61870-010 | |
| 2-Mercaptoethanol | EMD; Germany | 805740 | |
| FCS | PAN Biotech; Aidenbach, Germany | P30-3302 | |
| Penicillin/Strptomycin (10,000 U/mL) | Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany | 15140-122 | |
| Acrifix plexiglas glue | Evonic industries, Essen, Germany | 1R0192 | |
| Tangit PVC-U glue | Henkel, Düsseldorf, Germany |
References
- Dugue, G. P., Akemann, W., Knopfel, T.
- Tischer, D., Weiner, O. D. Illuminating cell signalling with optogenetic tools. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 551-558 (2014).
- Toettcher, J. E., Voigt, C. A., Weiner, O. D., Lim, W. A. The promise of optogenetics in cell biology: interrogating molecular circuits in space and time. Nat Methods. 8 (1), 35-38 (2011).
- Zhang, K., Cui, B. Optogenetic control of intracellular signaling pathways. Trends Biotechnol. 33 (2), 92-100 (2015).
- Bugaj, L. J., Choksi, A. T., Mesuda, C. K., Kane, R. S., Schaffer, D. V. Optogenetic protein clustering and signaling activation in mammalian cells. Nat Methods. 10 (3), 249-252 (2013).
- Bugaj, L. J., et al. Regulation of endogenous transmembrane receptors through optogenetic Cry2 clustering. Nat Commun. 6, 6898 (2015).
- Strickland, D., et al. TULIPs: tunable, light-controlled interacting protein tags for cell biology. Nat Methods. 9 (4), 379-384 (2012).
- Taslimi, A., et al. An optimized optogenetic clustering tool for probing protein interaction and function. Nat Commun. 5, 4925 (2014).
- Toettcher, J. E., Gong, D., Lim, W. A., Weiner, O. D. Light-based feedback for controlling intracellular signaling dynamics. Nat Methods. 8 (10), 837-839 (2011).
- Toettcher, J. E., Weiner, O. D., Lim, W. A. Using optogenetics to interrogate the dynamic control of signal transmission by the Ras/Erk module. Cell. 155 (6), 1422-1434 (2013).
- Wang, J., et al. Utilization of a photoactivatable antigen system to examine B-cell probing termination and the B-cell receptor sorting mechanisms during B-cell activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (5), E558-E567 (2016).
- Wend, S., et al. Optogenetic control of protein kinase activity in mammalian cells. ACS Synth Biol. 3 (5), 280-285 (2014).
- Zhou, X. X., Chung, H. K., Lam, A. J., Lin, M. Z. Optical control of protein activity by fluorescent protein domains. Science. 338 (6108), 810-814 (2012).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J Immunol Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
- Givan, A. L.
- Brakemann, T., et al. A reversibly photoswitchable GFP-like protein with fluorescence excitation decoupled from switching. Nat Biotechnol. 29 (10), 942-947 (2011).
