Introduction
Strumenti optogenetic stanno guadagnando popolarità, in parte perché possono essere utilizzati per decifrare il cablaggio delle vie di segnalazione 1-4. Essi si basano sulla capacità delle proteine fotoattivabile di cambiare la loro conformazione e affinità di legame quando illuminato con luce. Fondendo queste proteine ad elementi di segnalazione consente la normativa specifica di un singolo giocatore all'interno di complesse vie di segnalazione intracellulare 5-12. Di conseguenza, un percorso di segnalazione può essere studiato con alta risoluzione temporale e spaziale.
La maggior parte degli studi optogenetic basati su celle utilizzano metodi di microscopia a base combinati con coltura in presenza di luce, seguita da analisi biochimiche 11,12. Al contrario, un flusso singolarizza citometro celle lungo un capillare e misura la dimensione della cella, granularità e intensità di fluorescenza. Questo metodo ha importanti vantaggi rispetto microscopia o biochimici metodi, tra cui la capacità di analizzare thousands di cellule alla risoluzione di una singola cellula vivente in un tempo molto breve. Quindi, è desiderabile combinare optogenetics con citometria di flusso.
A nostra conoscenza, non vi è alcun protocollo stabilito per citometria a flusso optogenetic. Una procedura largamente accettata è di illuminare manualmente le cellule da fuori tubo di reazione con i dispositivi torcia elettrica. Tuttavia, illuminazione manuale nel flusso richiede citometro alla luce di passare attraverso il tubo di reazione e, per l'imaging cellulare dal vivo, cilindrica, camera di acqua riscaldata. Ciò causa sostanziale dispersione della luce e la perdita di luce. Inoltre, l'intensità della luce fornita da illuminazione manuale non è riproducibile tra esperimenti (angolo, distanza, ecc) e vi è un limite pratico al numero di lunghezze d'onda in un esperimento.
Con la costruzione del dispositivo Thermo flusso LED, siamo stati in grado di superare questi limiti. Con questo dispositivo, le cellule possono essere illuminati con specifiche lunghezze d'onda in una temperaturaerature controllato modo durante le misure di citometria a flusso. Questo permette di quantità precise e riproducibili di luce all'interno e tra esperimenti.
Per dimostrare l'utilità del nostro dispositivo in vivo, abbiamo registrato il segnale di fluorescenza di Dronpa nelle cellule Ramos B durante photoswitching. le cellule Ramos B sono derivati da un linfoma di Burkitt umana. Dronpa è una proteina fluorescente che esiste come monomero, dimero o tetramero. Nella sua forma monomerica, è non fluorescente. Illuminazione con 400 nm luce induce dimerizzazione e tetramerizzazione e rende fluorescente proteina Dronpa. Questo processo può essere invertito illuminazione con 500 luce nm. La proteina Dronpa è stato usato per controllare la funzione e la posizione di segnalazione proteine 4,13.
Qui, abbiamo espresso una proteina Dronpa-Linker-Dronpa nelle cellule Ramos B per studiare photoswitching di Dronpa in un citofluorimetro. Utilizzando il nostro dispositivo, siamo stati in grado di efficienza eFOTOINTERRUTTORE riproducibile Dronpa durante la registrazione la sua intensità di fluorescenza in tempo reale. Questo metodo fornisce vantaggi sostanziali rispetto protocolli illuminazione attuale con illuminazione manuale e amplia notevolmente il repertorio sperimentale per strumenti optogenetic e composti gabbia. Utilizzando il nostro dispositivo semplificherà e accelerare la scoperta e lo sviluppo di strumenti innovativi optogenetic in modo significativo.
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Protocol
1. Progettare e costruire il dispositivo
- esperimenti pilota
NOTA: L'intensità luminosa necessaria per uno specifico strumento e delle cellule di tipo optogenetic può variare in modo significativo. Esperimenti pilota con prototipi sono utili per stimare l'intensità luminosa minima necessaria. Lo strumento optogenetic utilizzato per i seguenti esperimenti è una fusione costrutto Dronpa-Linker-Dronpa. La sequenza è stata Dronpa commercialmente ottenuto (vedere elenco dei materiali). Un lungo linker è stato clonato tra due sequenze Dronpa per consentire il costrutto espresso per formare dimeri intramolecolari (e intermolecolari). I passi descritti di seguito possono essere adattati a molti altri strumenti optogenetic o sostanze otticamente controllate.- Trasdurre linfociti B Ramos con un Dronpa-Linker-Dronpa contenente costrutto seguendo le istruzioni del produttore per la trasduzione usando il surnatante retrovirale contenente da cellule di imballaggio. Harvest e le cellule di conteggio secondo un preprecedentemente pubblicato protocollo 13.
- Risospendere le cellule ad una concentrazione di 1 x 10 6 / ml in mezzo (RPMI 1640, 10% FCS inattivato al calore, 2 mM L-glutammina, 100 U / mL di penicillina, 100 U / mL di streptomicina, e 50 mM 2-mercaptoetanolo) e trasferirli ad un tubo di vetro FACS.
- Inserire il tubo in un citofluorimetro e misurare l'intensità di fluorescenza di Dronpa (canale GFP) 14,15.
- Indossare occhiali di protezione per tutte le ulteriori passi per proteggere gli occhi da lunghezze d'onda possibilmente dannose.
- inserire manualmente una luce 500 nm LED sulla parte esterna del tubo e continuare a misurare l'intensità di fluorescenza di Dronpa.
- Aumentare il numero e / o intensità delle luci a LED fino intensità di fluorescenza Dronpa diminuisce.
- inserire manualmente una luce 400 nm LED sulla parte esterna del tubo e continuare a misurare l'intensità di fluorescenza di Dronpa.
- Aumentare il numero e / o intensità delle luci a LED fino a quando il fluo Dronparescence intensità aumenta.
- Utilizzare almeno tante luci a LED per la costruzione del dispositivo come predetto di essere necessario dal photoswitching in passi 1.1.5 e 1.1.7.
- La costruzione del dispositivo
NOTA: Il dispositivo è stato costruito da un negozio di lavorazione professionale, la Arbeitsgruppe Technik presso l'Università di Friburgo. La maggior parte dei pezzi sono realizzati su misura e non disponibili in commercio. Le esatte dimensioni di ciascuna parte sono raffigurati nelle figure 1 e 2. Per chiarire il montaggio di questo dispositivo, complementare Video 1 è fornito e si descrivono le fasi essenziali di seguito.- Mill piece A da cloruro di polivinile (PVC) con le esatte misure indicate in figura 1A.
- Inserire luci a LED nei fori di pezzo A e sigillare ogni foro con colla per PVC per evitare perdite d'acqua.
- Collegare i LED ad un trasformatore multicanale (ogni lunghezza d'onda dovrebbe occupare una chann separatael) con potenza di uscita regolabile da 0-29 mA.
- Fissare la guaina esterna (B) con 3 viti per pezzo A come raffigurato per proteggere i LED da danni fisici.
- Per poter collegare il dispositivo ad una pompa dell'acqua, colla nelle clip tubo (C) nei fori del pezzo A (mostrato in Figura 1a, sezione trasversale Y: 9 mm e 61,5 millimetri) utilizzando colla PVC.
- Tagliare un tubo di plexiglas lungo 58,5 millimetri (D1).
- Fabbricazione pezzi D2 e D3 di plexiglas come illustrato nella Figura 2.
- piece colla D3 al fondo D1 con colla plexiglas.
- Collegare un O-ring di gomma per pezzo D2 e la colla in cima D1 con la colla plexiglas.
NOTA: I pezzi D1, D2 e D3 insieme formano pezzo D. - Inserire pezzo D in pezzo A con 3 viti.
- Testare il dispositivo per perdite d'acqua prima di applicare l'alimentazione al trasformatore.
2. Misurare la cinetica di uno strumento optogenetic
- Culture cellule Ramos B in RPMI-mezzo (RPMI 1640, 10% FCS inattivato al calore, 2 mM L-glutammina, 100 U / mL di penicillina, 100 U / mL di streptomicina, e 50 mM 2-mercaptoetanolo) ad una densità di 3- 10 x 10 6 cellule / ml a 37 ° C e 5% CO 2.
- Harvest Ramos B cellule per centrifugazione a 350 xg e 4 ° C per 5 min.
- Contare le cellule utilizzando una camera di conteggio Neubauer seguito le istruzioni del produttore e risospendere 1-5 x 10 6 cellule in 600 microlitri di media.
- Trasferire le cellule in una provetta di vetro FACS, metterli su ghiaccio e proteggerli dalla luce fino alla misura.
- Collegare il dispositivo ad una pompa acqua riscaldata e regolare la temperatura a 37 ° C.
- Quando si utilizzano tubi di vetro FACS, scambiare l'O-ring nero del citofluorimetro con un O-ring di gomma e di applicare in aggiunta gr di siliciofacilità.
- Inserire con cura il tubo di vetro FACS nel dispositivo e collegarlo al citofluorimetro (Figura 3).
- Avviare la misurazione e registrare Dronpa intensità fluorescente (GFP canale).
- Illuminare il campione di cellule con 400 nm o 500 nm luce, rispettivamente, e registrare l'intensità di fluorescenza Dronpa (canale GFP).
- Analizzare i dati sperimentali con flusso adeguato citometro software. Grafico a dispersione in avanti contro dispersione laterale e porta le cellule viventi. Tracciare l'intensità di fluorescenza Dronpa nel corso del tempo.
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Representative Results
Utilizzando il flusso Thermo LED con un citometro di flusso
Il nucleo funzionale del dispositivo è una camera cilindrica in cui LED sono disposti in modo circolare che punta verso l'interno. Questa camera può essere collegato alla rete idrica e la pompa, che consente il controllo della temperatura dei LED, così come il campione cellulare. I LED sono collegati ad un trasformatore e quindi l'intensità luminosa per ogni lunghezza d'onda possono essere controllati singolarmente. Il centro del dispositivo ospita un tubo formato FACS standard che può essere collegato alla maggior citometri a flusso standard (Figure 4 e 5). Per mostrare che l'illuminazione nel nostro dispositivo non porta al riscaldamento indesiderato delle cellule, abbiamo misurato la temperatura illuminata PBS nel tempo (figura 6) per tre diverse lunghezze d'onda. Illuminazione con 360 nm, 400 nm o 500 nm comporta soloaumento della temperatura marginale. Nel complesso, il dispositivo qui presentato permette l'illuminazione riproducibile di campioni di cellule temperatura controllata da misurare in un citometro a flusso.
Photoswitching di Dronpa
Un vettore di espressione che codifica per una Dronpa-Linker-Dronpa 13,16 fusione costrutto è stato clonato e trasdotto in cellule Ramos B. Come illustrato nella figura 7, l'obiettivo era di controllare la conformazione della proteina di fusione con la luce di lunghezze d'onda specifiche. Utilizzando il nostro dispositivo, la proteina di fusione Dronpa-Linker-Dronpa citosolico è stato photoswitched più volte (figura 8, a sinistra). Il passaggio allo stato scuro avviene lentamente, mentre il passaggio allo stato luminoso avviene quasi istantaneamente. Il recupero di fluorescenza spontanea della Dronpa nel buio dimostra che efficiente photoswitching alla forma luminosa richiede un'illuminazione specifica esolo si verifica lentamente spontaneamente (figura 8, a destra).
Abbiamo condotto un'analisi cinetica delle proprietà photoswitching (Figura 9). Le piste per la cinetica di commutazione sono stati calcolati per l'iniziale 4 min di illuminazione. La pendenza di recupero spontaneo è stato calcolato per il iniziale 4 minuti al buio.
L'analisi cinetica mostra, che la velocità photoswitching Dronpa è nel complesso molto riproducibile. Al contrario, il recupero spontaneo della Dronpa fluorescenza nel buio è molto inefficiente. Anche dopo incubazione più al buio, solo circa il 10% della fluorescenza Dronpa viene recuperato. Questo dimostra che in effetti l'illuminazione nel nostro dispositivo induce photoswitching.
Quindi, usando il metodo descritto, possiamo generare in tempo reale photoswitching dati in un citometro a flusso, che puòessere tradotto in una valutazione cinetica di molti strumenti optogenetic.
Figura 1: Programma della costruzione dello strato esterno. Tutti i pezzi sono realizzati su misura raffigurati da cloruro di polivinile (PVC). Pezzo A: pezzo cilindrico in PVC con fori per inserire i LED e le clip dei tubi. Piece B: La guaina esterna per proteggere i LED da danni fisici. Piece C: La clip tubo che collega la cavità interna con tubi in gomma per consentire il raffreddamento ad acqua. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Programma della costruzione dello strato interno. Tutti i pezzi raffigurati sono realizzati in plexiglas. Piece D: Questo pezzo è composto da tre parti D1, D2 e D3 e forma l'unità racchiude il tubo FACS. Pezzo D1: tubo cilindrico in plexiglas. Pezzo D2: coperchio inferiore dello strato interno. Pezzo D3: Coperchio dello strato interno. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Utilizzo del dispositivo con un citofluorimetro. A1: Ingresso campione di un citofluorimetro; A2: tubo FACS collegata all'ingresso del campione; B: Il dispositivo che racchiude il tubo FACS; C: Ingresso campione; D: Ingresso campione con il dispositivo.ove.com/files/ftp_upload/54707/54707fig3large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Workflow schematica del dispositivo. A: Le cellule sono illuminati nel dispositivo (in basso a sinistra) e contemporaneamente ripreso e analizzato nel citometro a flusso (in alto a sinistra). Ciò consente, ad esempio, l'analisi delle proprietà cinetiche di uno strumento optogenetic (in alto a destra). B: sezione trasversale del dispositivo. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Process Flow Diagram del dispositivo. Uno o mor E LED luci di lunghezze d'onda specifiche illuminano il campione di cellule in una provetta FACS. I LED sono circondati da acqua, che viene costantemente scambiato da un circolatore bagno a riscaldamento per mantenere la temperatura del campione cellulare stabile. Per gli esperimenti di cellule vive, la temperatura viene regolata a 37 ° C. Durante questa illuminazione temperatura controllata, le cellule vengono assorbiti nel citometro di flusso per l'analisi. Questa configurazione permette, per esempio, per analizzare le proprietà cinetiche di uno strumento optogenetic. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Temperatura di illuminazione PBS nel tempo. 1 ml di PBS in una provetta di vetro FACS è stata illuminata nel corso del tempo con la luce nm 360, 400 luce nm o 500 nm luce.caricare / 54707 / 54707fig6large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Modello per photoswitching della proteina Dronpa-Linker-Dronpa. Illuminazione con 400 nm luce sarà dimerize (e tetramerize) Dronpa e rendere fluorescente. Illuminazione con 500 nm luce porterà alla dissociazione delle proteine Dronpa, dove monomerica Dronpa è non fluorescente. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 8: Caratterizzazione delle proprietà photoswitching Dronpa utilizzando la Thermo flusso LED combinato con f basso citometria. Le cellule sono state illuminate come sopra indicato l'asse X e l'Dronpa intensità media di fluorescenza (MFI) è raffigurata nel tempo. La proteina di fusione Dronpa-Linker-Dronpa può essere photoswitched più volte l'utilizzo del dispositivo (a sinistra). Recupero spontaneo dell'intensità di fluorescenza Dronpa verifica solo lentamente e inefficiente (a destra). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 9: analisi cinetica di Dronpa photoswitching. La cinetica di Dronpa photoswitching sono stati calcolati per l'iniziale 4 min. di illuminazione e il recupero è stato calcolato per la prima 4 min. incubazione al buio come indicato dalle aree colorate. Le piste per ogni calcolo sono rappresentati in grassetto.ource.jove.com/files/ftp_upload/54707/54707fig9large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La Thermo flusso LED è un dispositivo innovativo per studiare strumenti optogenetic in un citometro di flusso.
Finora, i campioni sono stati optogenetic illuminata solo con i laser microscopia o dispositivi torcia elettrica 11,12. A seconda dell'angolo e della distanza della torcia al campione, sostanziale variabilità nella quantità di illuminazione è previsto tra esperimenti. Inoltre, vi è un limite al numero di torce una singola persona può operare in un esperimento. Questo limita il repertorio sperimentale e riproducibilità. Queste limitazioni sono state affrontate durante lo sviluppo del nostro dispositivo, che può essere utilizzato per caratterizzare la cinetica photoswitching tempo reale in cellule viventi. A nostra conoscenza, non esiste alcun dispositivo analogo.
Nella configurazione attuale, fino a 30 LED possono essere integrati in una camera Thermo Flow. Pertanto, a seconda delle intensità luminose richieste per ciascuna lunghezza d'onda, un singolo dispositivo può essere noiED per una vasta gamma di strumenti optogenetic. I protocolli stabiliti photoswitching possono essere ottimizzate per letture funzionali, per esempio, misurazioni di flusso di calcio. Il nostro dispositivo può essere adatto per altre sostanze otticamente controllate, come i composti in gabbia o fluorofori fotoattivabile.
A seconda della domanda scientifica e campioni utilizzati, protocolli individualizzati possono essere stabiliti rapidamente. L'impiego di tubi di vetro invece di provette di polistirene o polipropilene raccomanda di limitare citotossicità indotta dalla luce a lunghezze d'onda tra 400-500 nm. Tutte le linee cellulari testate sono sopravvissuti illuminazione (360 nm, 400 nm o 500 nm) per un massimo di un'ora in tubi di vetro. Abbiamo cercato di indagare sulle cause di morte delle cellule durante l'illuminazione a tubi di plastica effettuando esperimenti di trasferimento. Abbiamo illuminati cellule in PBS o RPMI con la luce di diverse lunghezze d'onda e quindi trasferito il surnatante alle cellule non illuminati per misurare la morte cellulare. Nessuno della raccoltasurnatanti causato significativo morte cellulare nelle cellule riceventi (dati non riportati). Inoltre, la temperatura di illuminata PBS in polistirene, o tubi di polipropilene è quasi identica alla temperatura in tubi di vetro. Quindi, possiamo solo speculare sulla causa della morte cellulare. plastica illuminato può rilasciare una sostanza instabile o radiazione di lunghezza d'onda che è tossico per le cellule.
La scelta del mezzo utilizzato per ciascun esperimento è importante. Il potere tampone deve essere considerato e diversi reagenti, come pH-indicatori, assorbono diverse lunghezze d'onda di diversi gradi. Inoltre, la sopravvivenza cellulare differisce notevolmente, per esempio, quando si confrontano-FCS libere di FCS contenenti media.
L'obiettivo di titolazione luce è di utilizzare la minima quantità di luce necessaria per la massima photoswitching. Per la maggior parte degli esperimenti, è favorevole per massimizzare la velocità del photoswitch e quindi massimizzare l'intensità luminosa. Ma, a seconda del wavelength e tipo di cellula, la luce può avere effetti diretti sul comportamento di segnalazione, che è il motivo per cui l'illuminazione eccessiva dovrebbe essere evitato.
È possibile programmare orari di luce per il dispositivo e per collegarlo ad un computer come è comune per altri dispositivi luminosi. Tuttavia, poiché la maggior parte citometri a flusso sono in posti di lavoro comuni condivisi da numerosi laboratori differenti, è preferibile mantenere il dispositivo più piccolo e portabile possibile. Inoltre, la movimentazione manuale del nostro dispositivo per una configurazione a due colori, come presentato qui è così semplice, che la programmazione sarebbe solo marginalmente migliorare la procedura sperimentale.
Nel loro insieme, presentiamo qui un dispositivo innovativo che combina la potenza di strumenti optogenetic e citometria a flusso. Questo semplifica notevolmente la caratterizzazione e sviluppo di strumenti optogenetic in vivo ed espandere il repertorio sperimentale.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass FACS tube | Thermo Fisher Scientific; Waltham, USA | 14-961-26 | Borosilicate glass tubes 12x75 mm |
| Flow Cytometer | BD Bioscienceg; Heidelberg, Germany | Fortessa II | Special Order |
| Dronpa: pcDNA3-mNeptune2-N | Addgene; Cambridge, USA | 41645 | |
| PolyJet | SignaGen, Rockville, USA | SL100688 | |
| LED 505 nm | Avago Technologies; Boeblingen, Germany | HLMP-CE34-Y1CDD | |
| LED 400 nm | Avago Technologies; Boeblingen, Germany | UV5TZ-400-15 | |
| Plexiglas tube 15 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 76999 | |
| Plexiglas 3 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692230 | |
| Plexiglas 2.5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692225 | |
| Plexiglas 1.5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692215 | |
| PVC tile 5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.005 | |
| PVC tile 6 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.006 | |
| PVC block 50 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.050 | |
| RPMI | Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany | 61870-010 | |
| 2-Mercaptoethanol | EMD; Germany | 805740 | |
| FCS | PAN Biotech; Aidenbach, Germany | P30-3302 | |
| Penicillin/Strptomycin (10,000 U/mL) | Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany | 15140-122 | |
| Acrifix plexiglas glue | Evonic industries, Essen, Germany | 1R0192 | |
| Tangit PVC-U glue | Henkel, Düsseldorf, Germany |
References
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