Introduction
그들은 1-4 경로 신호의 배선를 해독하는데 사용할 수 있기 때문에 Optogenetic 도구 부분에서 인기를 얻어왔다. 이들은 광이 조명 될 때 그 형태 및 결합 친화도를 변경하는 광활성 단백질의 능력에 기초한다. 신호 요소에이 단백질을 융합하는 복잡한 세포 내 신호 전달 경로 5-12 내에서 단일 플레이어의 특정 규제 수 있습니다. 결과적으로, 신호 전달은 높은 공간적 해상도를 연구 할 수있다.
대부분의 셀 기반 optogenetic 연구 생화학 분석 11,12 뒤에 빛의 존재하에 배양 결합 현미경 기반 방법을 사용한다. 대조적으로, 플로우 사이토 모세관 따라 세포 단수형 셀 크기, 입도 및 형광 강도를 측정한다. 이 방법은 thousan 분석 할 수있는 기능을 포함하여 현미경 또는 생화학 적 방법에 비해 큰 장점을 가지고 있습니다매우 짧은 시간에 단일 셀 해상도에서 살아있는 세포의 DS. 그러므로, 유동 세포 계측법에 optogenetics을 결합하는 것이 바람직하다.
우리의 지식에, optogenetic 유동 세포 계측법에 대한 확립 된 프로토콜이 없습니다. 광범위하게 허용 절차는 수동 플래쉬 장치 반응 관 외부로부터 셀을 조명하기위한 것이다. 그러나, 유동의 수동 조명 사이토 생균 촬상 원통형 가열 수조를 들어, 반응 관을 통과하는 광을 필요로한다. 이것은 상당한 광 산란 빛의 손실이 발생합니다. 또한, 수동에 의해 제공된 조명의 광 강도 (등 각도 간격) 실험 간 재현성이없는 한 실험에서 파장의 수에는 실제적인 한계가있다.
LED가 열 유량 장치를 구성함으로써, 이러한 한계를 극복 할 수 있었다. 이 장치로, 세포는 임시의 특정 파장으로 조명 될 수있다erature 제어 유세포 측정 중에 방식. 이것은 내 실험 사이의 빛의 정확하고 재현성있는 양의 수 있습니다.
생체 내에서 우리의 장치의 유틸리티를 설명하기 위해, 우리는 photoswitching 동안 라모스 B 세포에서 Dronpa의 형광 신호를 기록했다. 라모스 B 세포는 인간 버킷 림프종으로부터 유도된다. Dronpa는 단량체, 이량 체 또는 사량 체로서 존재 형광 단백질이다. 그 단량체 형태에서, 비 형광이다. 400 nm의 빛 조명은 이량 및 테트라을 유도하고 Dronpa 단백질의 형광을 렌더링합니다. 이 프로세스는 500 nm의 광을 조사하여 반전 될 수있다. Dronpa 단백질은 단백질 4,13 시그널링의 기능과 위치를 제어하는 데 사용되어왔다.
여기, 우리는 사이토의 흐름에 Dronpa의 photoswitching을 연구하는 라모스의 B 세포에서 Dronpa-링커 Dronpa 단백질을 표현했다. 우리의 장치를 사용하여, 우리가 할 수 있었다 효율적이고실시간으로 그 형광 강도를 기록하는 동안 재현 Dronpa을 포토 스위치. 이 방법은 수동 조명 현재 조명 프로토콜을 통해 상당한 이점을 제공하고 크게 optogenetic 도구와 케이지 화합물에 대한 실험적인 레퍼토리를 넓혀. 크게 간소화 및 신규 optogenetic 도구의 발견과 개발을 촉진 할 우리의 장치를 사용.
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Protocol
1. 디자인 및 장치 구축
- 파일럿 실험
참고 : 특정 optogenetic 도구 및 세포 유형에 필요한 빛의 강도는 상당히 다를 수 있습니다. 프로토 타입 파일럿 실험에 필요한 최소 광량을 측정하는 데 유용하다. 이하의 실험에 사용되는 툴은 optogenetic Dronpa - 링커 Dronpa 융합 작 제물이다. Dronpa 순서는 상업적으로 (자료 목록을 참조)를 얻었다. 긴 링커 발현 구조는 분자 (및 분자간) 이량 체를 형성 할 수 있도록 두 Dronpa 서열 사이에 클로닝 하였다. 이하의 단계는 많은 다른 optogenetic 도구 나 광 제어 물질로 구성 될 수있다.- 포장 세포에서 레트로 바이러스 함유 뜨는을 사용하여 전달하기위한 제조업체의 지침을 따르는 Dronpa-링커 Dronpa 포함하는 구조로 라모스 B 림프구를 형질 도입. 사전에 따라 수확 및 카운트 세포viously 프로토콜 13을 발표했다.
- 의 농도로 재현 탁 된 세포를 1 × 106 매질 / ㎖ (1640 RPMI, 10 %의 열 - 불 활성화 FCS, 2 mM L- 글루타민, 100 U / ㎖ 페니실린, 100 U / ㎖ 스트렙토 마이신, 50 μM 2- 머 캅토 에탄올) 및 유리 FACS 튜브로 전송.
- 사이토 흐름에 튜브를 삽입하고 Dronpa (GFP 채널) 14, 15의 형광 강도를 측정한다.
- 아마도 손상 파장으로부터 눈을 보호하기위한 모든 추가 단계에 대한 보호 안경을 착용 할 것.
- 수동으로 튜브의 외측에 500 nm의 LED 광을두고 Dronpa의 형광 강도를 측정 계속한다.
- Dronpa의 형광 강도가 감소 할 때까지 LED 조명의 수 및 / 또는 강도를 높입니다.
- 수동으로 튜브의 외부에 400 nm의 LED 조명을 배치하고 Dronpa의 형광 강도를 측정 계속합니다.
- Dronpa의 FLUO 때까지 LED 조명의 수 및 / 또는 강도를 증가강도 증가 rescence.
- 단계 1.1.5과 1.1.7에서 photoswitching에서 필요하다고 예측으로 장치를 구축하기위한 최소한 많은 LED 조명을 사용합니다.
- 장치 구축
주 : 장치 전문 가공 숍, 프라이 부르크 대학에서 Arbeitsgruppe Technik에 의해 지어졌다. 대부분의 부품은 맞춤 제작 한 상업적으로 사용할 수 없습니다. 각 부분의 정확한 치수는도 1 및도 2에 도시된다. 이 장치의 조립을 명확히하기 위해, 부가 비디오 1은 제공되고, 가장 중요한 단계는 아래에 설명된다.- 도 1a에 도시 된 정확한 측정을 폴리 비닐 클로라이드 (PVC)로부터 밀 피스를했다.
- 조각 (A)의 드릴 구멍에 LED 조명을 삽입하고 누수를 방지하기 위해 PVC 접착제와 각 구멍을 밀봉.
- 멀티 채널 변압기에 LED를 연결하면 (각각의 파장은 별도의 chann를 차지한다0-29mA에서 조정 가능한 출력 전력과 엘).
- 물리적 손상으로부터 LED를 보호하는 도시 된 부분 (A)에 3 개의 나사를 외장 시스 (B)를 부착.
- 부분 (A)의 천공 구멍에 튜브 클립 (C)에 물 펌프, 접착제에 장치를 연결할 수 있도록 (도 1a에 도시 된 바와 같이, 단면 Y : 9 mm와 61.5 mm) PVC 접착제를 사용.
- 58.5 mm 긴 플렉시 글라스 튜브 (D1)를 잘라.
- 그림 2에 도시 된 바와 같이 유기 유리로 만들어진 조각 D2와 D3를 생산하고 있습니다.
- 플렉시 유리 접착제와 D1의 바닥에 접착제 조각 D3.
- 조각 D2에 고무 O 링을 부착하고 플렉시 유리 접착제와 D1의 상단에 접착제.
참고 : 조각 D1, D2와 D3가 함께 조각 D.을 형성 - 3 나사 부분 (A) 내로 조각 D를 삽입합니다.
- 변압기에 전원을 공급하기 전에 누수에 대한 장치를 테스트합니다.
2. Optogenetic 도구의 속도론을 측정
- RPMI-배지에서 배양 라모스 B 세포 (RPMI 1640, 10 % 열 - 불 활성화 FCS, 2 mM L- 글루타민, 100 U / ㎖ 페니실린, 100 U / ㎖ 스트렙토 마이신, 50 μM 2- 머 캅토 에탄올) -3-의 밀도 10 × 106 세포 / ㎖, 37 ℃에서 5 % CO 2.
- 350 XG에 5 분간 4 ℃에서 원심 분리하여 수확 라모스 B 세포.
- 제조업체의 지침에 따라 노이 바 우어 계산 챔버를 사용하여 세포를 계산하고 600 μL 매체에 1-5 × 10 6 세포를 재현 탁.
- 유리 FACS 튜브에 세포 이동을 측정 할 때까지 빛으로부터 얼음에 넣어 그들을 보호한다.
- 가열 된 물 펌프에 장치를 연결하고 37 ° C의 온도를 조절합니다.
- 유리 FACS 튜브를 사용할 때, 사이토 고무 O 링으로 유동 검정 O 링을 교환하고 별도로 실리콘 GR 적용용이함.
- 조심스럽게 장치에 유리 FACS 튜브를 삽입하고 (그림 3) 흐름 cytometer에 연결합니다.
- 측정을 시작하고 Dronpa 형광 강도 (GFP 채널)를 기록.
- 각각 400 내지 500 nm의 빛으로 세포 샘플을 조명하고 Dronpa 형광 강도 (GFP 채널)를 기록한다.
- 소프트웨어 사이토 적합한 흐름 실험 데이터를 분석 할 수 있습니다. 측방 산란 및 게이트 살아있는 세포에 대한 플롯 앞으로 산란. 시간 경과 Dronpa 형광 강도를 플롯.
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Representative Results
플로우 사이토와 LED 열 흐름을 사용하여
장치의 기능은 코어 등이 내측 가리키는 원형 방식으로 배열 된 LED 된 원통형 챔버이다. 이 챔버는 LED의 온도뿐만 아니라, 세포 샘플을 제어 가능하게하는 급수 펌프에 연결될 수있다. LED는 변압기에 연결되어 있으며, 따라서 각각의 파장에 대한 광 세기가 개별적으로 제어 될 수있다. 장치의 중심은 가장 표준적인 유동 세포 계측기에 접속 될 수있는 표준 크기 FACS 튜브 수용한다 (도 4 및도 5). 세포의 바람직하지 않은 가열로 이어질하지 않는 우리의 장치에 그 조명을 표시하려면, 우리는 세 가지 다른 파장에 대해 시간에 조명 PBS의 온도 (그림 6)를 측정 하였다. 360 나노 미터, 400 나노 미터 또는 500 나노 미터와 조명 만 리드한계 온도 상승. 온도 조절 세포 샘플의 재현, 조명은 유세포 측정 될 수 있도록 전체적으로 여기에 제시된 장치를 허용한다.
Dronpa의 Photoswitching
Dronpa-링커 Dronpa 13, 16 융합 구조를 인코딩하는 발현 벡터는 복제와 라모스 B 세포로 형질 도입했다. 도 7에 도시 된 바와 같이, 목표는 특정 파장의 광이 융합 단백질의 형태를 제어하는 것이었다. 우리의 장비를 사용하여 세포질 Dronpa - 링커 Dronpa 융합 단백질 (왼쪽,도 8)을 여러 번 photoswitched 하였다. 밝은 상태로 전환하는 것은 거의 순간적으로 발생하는 반면, 어두운 상태로 전환, 서서히 발생합니다. 어둠 속에서 Dronpa의 자연 형광 복구는 밝은 양식에 효율적으로 photoswitching 특정 조명 및 필요하다는 것을 보여줍니다천천히 (오른쪽 그림 8) 자발적으로 발생합니다.
우리는 photoswitching 속성의 운동 분석을 (그림 9)을 수행 하였다. 스위칭 역학의 경사는 조명의 처음 4 분 동안 계산 하였다. 자발적 회복 기울기는 어두운의 초기 4 분 동안 계산 하였다.
운동 분석은 Dronpa의 photoswitching 속도가 전반적으로 매우 재현 할 수 있음을 보여줍니다. 반대로, 어두운 Dronpa 형광의 자발적 회복은 매우 비효율적이다. 어두운 곳에서도 이상 배양 한 후, Dronpa 형광의 약 10 %가 회수된다. 이것은 참으로 우리의 장치에서 조명 photoswitching을 유도 보여줍니다.
따라서, 상술 한 방법을 사용하여, 실시간으로 생성 할 수있는 수, 유세포 데이터를 photoswitching많은 optogenetic 도구 평가 운동으로 변환된다.
그림 1 : 외부 층의 건축 계획. 모든 도시 조각 사용자 정의 폴리 염화 비닐 (PVC)에서 만들어집니다. 원피스 A : 드릴 구멍 원통형 PVC 조각 LED 및 튜브 클립을 삽입합니다. 조각 B : 물리적 손상으로부터 LED를 보호하는 외장 시스. 조각 C : 수냉 있도록 고무 튜브 내부 공동을 연결 튜브 클립. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 내부 층의 건축 계획. 모든 도시 조각 플렉시 유리에서 만들어집니다. 원피스 D :이 작품은 세 가지 D1, D2와 D3 구성 및 FACS 튜브를 둘러싸 단위를 형성한다. 조각 D1 : 원통형 플렉시 글라스 튜브. 조각 D2 : 내부 층의 바닥 덮개. 조각 D3 : 내부 층의 뚜껑. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3 : 유세포과 장치를 사용. A1 : 플로우 사이토 미터의 시료 투입구; A2 : 시료 주입구에 접속 FACS 튜브; B 다음 FACS 튜브를 둘러싸 장치; C : 샘플 입구; D : 장치와 샘플 입구.ove.com/files/ftp_upload/54707/54707fig3large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 장치의 워크 플로우 개략도. A : 세포 장치에 조명된다 (왼쪽 아래)과 동시에 (왼쪽 위) 채택과 흐름 cytometer에 분석했다. 이것은 예를 들어, 허용 optogenetic 도구 (오른쪽)의 운동 특성의 분석. B : 장치의 단면. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 장치의 프로세스 흐름 다이어그램. 하나 MOR 특정 파장의 전자 LED 조명은 FACS 튜브에 세포 샘플을 조명. LED는 지속적으로 세포 샘플 안정된 온도를 유지하도록 가열 욕 순환기에 의해 교환되는 물에 의해 둘러싸여있다. 생균 실험에서, 온도는 37 ℃로 조정한다. 이 온도 조절 조명하는 동안, 세포 분석을위한 흐름 세포 계측기로 흡수된다. 이 설정 허용, 예를 들면, optogenetic 공구의 운동 특성을 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 : 시간에 조명 PBS의 온도. 유리 FACS 튜브에 PBS 1 ml를 360 nm의 빛, 400 nm의 빛 또는 500 nm의 빛으로 시간이 지남에 따라 조명했다./ 54,707 / 54707fig6large.jpg "대상 ="_ 빈 "을 업로드>이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7 : Dronpa-링커 Dronpa 단백질의 photoswitching에 대한 모델입니다. 400 nm의 빛 조명은 이량 (그리고 tetramerize) Dronpa을하고 형광 렌더링됩니다. 500 nm의 빛 조명은 단량체 Dronpa 비 형광 인 Dronpa 단백질의 분리로 이어질 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8 : LED 열 흐름을 사용하여 Dronpa photoswitching 속성의 특성 F와 함께 낮은 세포 계측법. X 축 위에 표시하고, Dronpa 형광 강도를 의미한다 (MFI) 시간이 지남에 묘사 된 바와 같이 세포를 조명했다. Dronpa - 링커 Dronpa 융합 단백질은 장치 (좌측)를 사용하여 여러 번 photoswitched 수있다. Dronpa 형광 강도의 자발적 회복은 천천히하고 비효율적 (오른쪽)가 발생합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9 : Dronpa의 photoswitching의 운동 분석. Dronpa의 photoswitching의 동역학은 초기 4 분 동안 계산 하였다. 조명 및 복구의 초기 4 분 동안 계산 하였다. 어둠 속에서 배양 착색 영역으로 나타낸 바와 같이. 각 계산을위한 슬로프가 굵은 숫자로 묘사된다.ource.jove.com/files/ftp_upload/54707/54707fig9large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
LED가 열 흐름은 흐름 세포 계수기에 optogenetic 도구를 연구하는 혁신적인 장치입니다.
지금까지 optogenetic 샘플은 현미경 레이저 또는 플래시 장치 (11, 12)으로 조사되었다. 샘플을 플래쉬의 각 거리에 따라 조도의 양의 상당한 변화는 실험간에 예상된다. 또한, 한 사람이 실험에서 동작 할 수 손전등의 개수에는 제한이있다. 이 실험 레퍼토리와 재현성을 제한합니다. 이러한 제한은 살아있는 세포에서 실시간 photoswitching 동력학을 특성화하는데 사용될 수있는 우리의 장치의 개발 동안 해결 하였다. 우리의 지식에 더 유사한 장치가 없습니다.
현재 구성에서 최대 30 개의 LED는 하나의 열 유량 용기에 내장 될 수있다. 따라서, 각각의 파장에 필요한 빛의 강도에 따라, 하나의 장치는 우리가 될 수 있습니다optogenetic 도구의 광범위한 에드. 설정된 photoswitching 프로토콜이어서 판독 기능, 예를 들면, 칼슘 유량 측정을 위해 최적화 될 수있다. 우리의 장치는 갇힌 화합물 또는 광활성 형광 같은 다른 광학적으로 제어 물질에 적합 할 수있다.
과학적 질문에 사용되는 시료에 따라 개별화 된 프로토콜은 빠르게 설정 될 수있다. 대신, 폴리스티렌 또는 폴리 프로필렌 튜브 유리 튜브의 사용은 400-500 나노 미터 사이의 파장에서 광 - 유도 세포 독성을 제한 할 것을 권장한다. 시험 된 모든 세포주는 조명 (360 내지 400 나노 미터 또는 500 나노 미터) 유리관에서 최대 1 시간 동안 살아 남았다. 우리는 전송 실험을 수행하여 플라스틱 튜브 조명 동안 세포의 죽음의 원인을 조사하기 위해 노력했다. 우리는 서로 다른 파장의 광을 PBS 또는 RPMI 세포를 조사하고 세포 사멸을 측정하기 비점 세포 상등액을 옮겼다. 수집 된 사항 없음상청액을받는 세포에서 현저한 세포 사멸을 유발 (데이터는 보이지 않음). 또한, 폴리스티렌, 폴리 프로필렌 튜브에 조명 된 PBS의 온도는 유리관의 온도와 거의 동일하다. 따라서, 우리는 세포 사멸의 원인을 추측 할 수있다. 조명 플라스틱 세포에 대한 독성이 파장의 불안정한 물질 또는 방사선을 방출 할 수있다.
각각의 실험에 사용 된 매체의 선택은 중요하다. 버퍼링 용량을 고려하고 다른 시약은, pH의 지표처럼, 다른도에 서로 다른 파장을 흡수해야합니다. FCS 함유 매체 FCS 무 비교시 더욱이, 세포 생존, 예를 들어, 상당히 다르다.
광 적정 목표 최대 photoswitching 필요한 빛의 최소량을 사용하는 것이다. 대부분의 실험에서, 상기 포토 스위치의 속도를 최대화하고 따라서 발광 강도를 극대화하는 것이 바람직하다. 단, wavele에 따라ngth 세포 유형은 광 과잉 조사 피해야한다 이유 시그널링 동작에 직접 영향을 미칠 수있다.
우리는 디바이스의 광 스케줄을 프로그래밍하는 다른 조명 장치에 공통으로 컴퓨터에 연결하는 것이 가능하다. 대부분의 유동 세포 계측기 수많은 다른 실험실에 의해 공유 된 공통의 작업 장소에 있기 때문에, 가능한 한 소형 및 휴대형 장치로 유지하는 것이 최선이다. 또한, 여기에 제시된 바와 같이 2 색 설정을위한 우리의 장치의 수동 조작이 매우 간단하고, 그 프로그램은 소폭 실험 절차를 개선하는 것입니다.
함께, 우리는 여기에 optogenetic 도구의 힘을 결합하고 유동 세포 계측법 혁신적인 장치를 제시한다. 이것은 실질적으로 생체 내에서 특성화 및 optogenetic 도구의 개발을 단순화하고 실험적인 레퍼토리를 확장합니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass FACS tube | Thermo Fisher Scientific; Waltham, USA | 14-961-26 | Borosilicate glass tubes 12x75 mm |
| Flow Cytometer | BD Bioscienceg; Heidelberg, Germany | Fortessa II | Special Order |
| Dronpa: pcDNA3-mNeptune2-N | Addgene; Cambridge, USA | 41645 | |
| PolyJet | SignaGen, Rockville, USA | SL100688 | |
| LED 505 nm | Avago Technologies; Boeblingen, Germany | HLMP-CE34-Y1CDD | |
| LED 400 nm | Avago Technologies; Boeblingen, Germany | UV5TZ-400-15 | |
| Plexiglas tube 15 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 76999 | |
| Plexiglas 3 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692230 | |
| Plexiglas 2.5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692225 | |
| Plexiglas 1.5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692215 | |
| PVC tile 5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.005 | |
| PVC tile 6 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.006 | |
| PVC block 50 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.050 | |
| RPMI | Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany | 61870-010 | |
| 2-Mercaptoethanol | EMD; Germany | 805740 | |
| FCS | PAN Biotech; Aidenbach, Germany | P30-3302 | |
| Penicillin/Strptomycin (10,000 U/mL) | Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany | 15140-122 | |
| Acrifix plexiglas glue | Evonic industries, Essen, Germany | 1R0192 | |
| Tangit PVC-U glue | Henkel, Düsseldorf, Germany |
References
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