Introduction
Оптогенетика инструменты набирает популярность, отчасти потому , что они могут быть использованы , чтобы расшифровать проводку сигнальных путей 1-4. Они основаны на способности белков фотоактивируемых изменять свою конформацию и аффинностью связывания при освещении светом. Соединяя эти белки сигнальных элементов позволяет для конкретного регулирования одного игрока в сложных внутриклеточных сигнальных путей 5-12. Следовательно, путь передачи сигналов может быть исследована с высоким временным и пространственным разрешением.
Большинство сотовых на основе оптогенетика исследования используют методы микроскопии на основе в сочетании с культивированием в присутствии света с последующим биохимического анализа 11,12. В противоположность этому, проточный цитометр singularizes клеток вдоль капилляра и измеряет размер клеток, зернистость и интенсивности флуоресценции. Этот метод имеет значительные преимущества по сравнению с микроскопии или биохимических методов, в том числе способность анализировать thousanDS живых клеток при разрешении одноклеточного в очень короткое время. Следовательно, желательно, чтобы совместить оптогенетика с проточной цитометрии.
Насколько нам известно, не существует никакого установленного протокола для оптогенетика цитометрии. Широко принято процедура вручную освещать клетки снаружи реакционной трубки с фонариком устройствами. Тем не менее, ручное освещение в проточном цитометре требует свет, чтобы пройти через реакционную трубу и, для клеток живого изображения, цилиндрический, нагретой камере воды. Это приводит к тому существенное рассеивание света и потери света. Кроме того, интенсивность света, заданные вручную освещения не является воспроизводимой между экспериментами (угол, расстояние и т.д.) и существует практический предел числу длин волн в одном эксперименте.
Построив устройство LED Thermo Flow, мы смогли преодолеть эти ограничения. С помощью этого устройства, клетки могут быть освещен с определенными длинами волн в ТЕмпратуре-контролируемым образом в процессе измерений цитометрическими потока. Это позволяет точные и воспроизводимые количества света внутри и между экспериментами.
Чтобы продемонстрировать полезность нашего устройства в естественных условиях, мы записали флуоресценции сигнал Dronpa в клетках Ramos B во photoswitching. Ramos B клетки получают из человеческой лимфомы Беркитта. Dronpa представляет собой флуоресцентный белок, который существует в виде мономера, димера или тетрамера. В своей мономерной форме, она нефлуоресцирующего. Освещение с 400 нм светом вызывает димеризацию и тетрамеризации и делает белок флуоресцентной Dronpa. Этот процесс может быть отменено при освещении 500 нм светом. Белок Dronpa был использован для управления функцией и расположение сигнальных белков 4,13.
Здесь мы выразили белок Dronpa-линкер-Dronpa в В-клетках Ramos для изучения photoswitching из Dronpa в проточном цитометре. С помощью нашего прибора, мы смогли эффективно ивоспроизводимо photoswitch Dronpa во время записи его интенсивность флуоресценции в реальном времени. Этот метод обеспечивает существенные преимущества по сравнению с современными протоколами освещения с ручным освещения и значительно расширяет экспериментальный репертуар оптогенетика инструментов и каркасных соединений. С помощью нашего прибора позволит значительно упростить и ускорить открытие и разработку новых инструментов оптогенетика.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Проектирование и создание устройства
- Пилотные эксперименты
Примечание: Требуемая интенсивность света для конкретного оптогенетика инструмента и клеточного типа могут существенно различаться. Пилотные эксперименты с прототипами являются полезными для оценки минимальной интенсивности света необходимо. Оптогенетика инструмент, используемый для следующих экспериментов является слитая конструкция Dronpa-линкер-Dronpa. Последовательность Dronpa был коммерчески получен (см перечень материалов). Длинный линкер был клонирован между двумя последовательностями Dronpa, чтобы позволить выраженная конструкция с образованием межмолекулярных (и межмолекулярные) димеров. Шаги, описанные ниже, могут быть адаптированы ко многим другим оптогенетика инструментов или оптически контролируемых веществ.- Трансдукции Ramos В-лимфоциты с содержащей конструкцию Dronpa-линкер-Dronpa следующей инструкции производителя по трансдукции с помощью ретровирусов, содержащих супернатант от упаковки клеток. Урожай и подсчета клеток в соответствии с заранееviously опубликован протокол 13.
- Ресуспендируют клеток в концентрации 1 × 10 6 / мл в среде (RPMI 1640, 10% инактивированной нагреванием FCS, 2 мМ L-глутамина, 100 ед / мл пенициллина, 100 ед / мл стрептомицина и 50 мкМ 2-меркаптоэтанола) и передавать их в стеклянную трубку FACS.
- Вставьте трубу в проточном цитометре и измеряют интенсивность флуоресценции Dronpa (GFP) канала 14,15.
- Носите защитные очки для всех дальнейших шагов, чтобы защитить глаза от возможного повреждения длин волн.
- Установите вручную на 500 нм светодиод свет на внешней стороне трубки и продолжать измерение интенсивности флуоресценции Dronpa.
- Увеличение числа и / или интенсивность света СИД, пока не снижается интенсивность флуоресценции Dronpa.
- Установите вручную на 400 нм светодиод свет на внешней стороне трубки и продолжать измерение интенсивности флуоресценции Dronpa.
- Необходимо увеличить число и / или интенсивность света СИД до флуо Dronpaценция интенсивность увеличивается.
- Используйте по крайней мере столько же света СИД для создания устройства, так как по прогнозам, будет необходимо с photoswitching на этапах 1.1.5 и 1.1.7.
- Создание устройства
ПРИМЕЧАНИЕ: Устройство было построено профессиональным обрабатывающего цеха, в Arbeitsgruppe Technik из Университета Фрайбурга. Большинство деталей изготовлены на заказ и не являются коммерчески доступными. Точные размеры каждой части изображены на рисунках 1 и 2. Для пояснения сборки этого устройства, Дополнительное видео 1 обеспечивается и наиболее существенные шаги описаны ниже.- Мельница часть А из поливинилхлорида (ПВХ) с точным измерениям , показанным на фиг.1А.
- Вставьте светодиодные фонари в просверленные отверстия кусок A и запечатать каждое отверстие с ПВХ клеем, чтобы предотвратить утечку воды.
- Подключение светодиодов к многоканальному трансформатора (каждая длина волны должна занимать отдельную Channэл) с регулируемой выходной мощностью от 0-29 мА.
- Приложить внешнюю оболочку (В) с 3-мя винтами к части А, как показано, чтобы защитить светодиоды от физических повреждений.
- Для того, чтобы иметь возможность подключить устройство к водяному насосу, клея в трубе зажимов (C) в просверленные отверстия кусок A (изображен на рисунке 1а, поперечное сечение Y: 9 мм и 61,5 мм) с помощью клея ПВХ.
- Вырезать 58,5 мм из плексигласа трубки (D1).
- Производство частей D2 и D3 из оргстекла , как показано на рисунке 2.
- Клей кусок D3 в нижней части D1 с Plexiglas клеем.
- Прикрепите резиновую уплотнительное кольцо кусок D2 и приклейте ее к верхней части D1 с плексигласа клеем.
Примечание: Части D1, D2 и D3 вместе образуют кусок D. - Вставьте кусок D в кусок А с 3-мя винтами.
- Проверьте устройство на предмет утечки воды перед подачей питания к трансформатору.
2. Измерение Кинетика с оптогенетика Tool
- Культура Ramos В-клетки в RPMI-среде (RPMI 1640, 10% инактивированной нагреванием FCS, 2 мМ L-глутамина, 100 ед / мл пенициллина, 100 ед / мл стрептомицина и 50 мкМ 2-меркаптоэтанола) при плотности 3- 10 х 10 6 клеток / мл при 37 ° С и 5% СО 2.
- Урожай Ramos B-клеток путем центрифугирования при 350 х г и 4 ° С в течение 5 мин.
- Граф клеток с использованием счетной камеры Нейбауера следующие инструкции изготовителя и ресуспендируют 1-5 × 10 6 клеток в 600 мкл среды.
- Передача клеток в FACS стеклянной трубки, положить их на лед и защитить их от света до измерения.
- Подключите устройство к водяной насос с подогревом и регулировать температуру до 37 ° С.
- При использовании стекла FACS труб, замена черный уплотнительное кольцо потока цитометр с резиновым уплотнительным кольцом и дополнительно нанесите водоотталкивающее грлегкость.
- Осторожно вставьте стеклянную трубку FACS в устройство и подключить его к проточного цитометра (рисунок 3).
- Начните измерение и запись Dronpa интенсивности флуоресценции (GFP канала).
- Осветите образец клеток с 400 нм или 500 нм света соответственно и регистрируют интенсивность флуоресценции (GFP Dronpa канала).
- Анализ экспериментальных данных с подходящим программным обеспечением проточной цитометрии. Участок вперед разброс против бокового рассеяния и ворота живых клеток. Участок интенсивности флуоресценции Dronpa с течением времени.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Использование LED Thermo Flow с проточной цитометрии
Функциональное Ядро устройства представляет собой цилиндрическую камеру, в которой светодиоды расположены по кругу, указывая внутрь. Эта камера может быть соединена с источником воды и насосом, который позволяет контролировать температуру светодиодов, а также образец клеток. Светодиоды подключены к трансформатору, и, следовательно, интенсивность света для каждой длины волны может быть индивидуальным контролем. Центр устройства вмещает стандартный размер FACS трубки, которые могут быть подключены к большинству стандартных цитометров (4 и 5). Для того, чтобы показать , что освещение в нашем устройстве не приводит к нежелательному нагреву клеток, мы измерили температуру освещаемой PBS с течением времени (рисунок 6) для трех различных длин волн. Освещение с 360 нм, 400 нм или 500 нм, приводит к лишьнезначительное увеличение температуры. В целом, устройство, представленный здесь позволяет воспроизводимый освещение с регулируемой температурой образцов клеток для измерения в проточном цитометре.
Photoswitching из Dronpa
Вектор экспрессии , кодирующий Dronpa-линкер-Dronpa 13,16 слитая конструкция была клонирована и трансдуцированных в клетки Ramos B. Как показано на фигуре 7, цель состояла в том, чтобы контролировать конформацию этого гибридного белка с учетом определенных длин волн. С помощью нашего прибора, цитозольная Dronpa-линкер-Dronpa слитый белок photoswitched несколько раз (рисунок 8, слева). Переключение в темное состояние происходит медленно, в то время как переход в светлое состояние происходит почти мгновенно. Спонтанное восстановление флуоресценции Dronpa в темноте показывает, что эффективная photoswitching к яркой форме требует специального освещения итолько медленно происходит спонтанно (рис 8, справа).
Мы провели кинетический анализ свойств photoswitching (рисунок 9). Наклоны для переключения кинетики были рассчитаны для начального 4 мин освещения. Склон для спонтанного восстановления была рассчитана на начальный 4 мин в темноте.
Кинетический анализ показывает, что скорость photoswitching Dronpa является в целом очень воспроизводимым. В противоположность этому, спонтанное восстановление Dronpa флуоресценции в темноте очень неэффективно. Даже после длительного инкубации в темноте, лишь около 10% от флуоресценции Dronpa восстанавливается. Это показывает, что на самом деле освещение в нашем устройстве индуцирует photoswitching.
Следовательно, с помощью описанного метода, мы можем генерировать в реальном масштабе времени photoswitching данных в проточном цитометре, который можетпереводиться в кинетическую оценку многих оптогенетика инструментов.
Рисунок 1: Построение плана внешнего слоя. Все изображенные фигуры изготовлены на заказ из поливинилхлорида (ПВХ). Часть A: Круглое ПВХ кусок с просверленными отверстиями для вставки светодиодов и зажимы трубки. Часть B: Внешняя оболочка для защиты светодиодов от физических повреждений. Часть C: Зажим трубка , которая соединяет внутреннюю полость с резиновыми трубками , чтобы обеспечить охлаждение водой. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Построение плана внутреннего слоя. Все изображенные фигуры сделаны из плексигласа. Часть D: Эта часть состоит из трех частей D1, D2 и D3 и формирует блок закрывающий трубку FACS. Часть D1: цилиндрическая труба из плексигласа. Часть D2: Нижняя крышка внутреннего слоя. Кусок D3: Корпус внутреннего слоя. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Использование устройства с проточной цитометрии. A1: Образец на входе проточной цитометрии; А2: FACS - трубка соединена с входным отверстием образца; B: устройство ограждающих трубку FACS; C: Образец на входе; D: Образец на входе с устройством.ove.com/files/ftp_upload/54707/54707fig3large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: Рабочий процесс схема устройства. A: Клетки освещены в устройстве (внизу слева) и одновременно вынимали и анализировали в проточном цитометре (вверху слева). Это позволяет, например, анализ кинетических свойств оптогенетика инструмента (справа вверху). Б: поперечное сечение устройства. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5: Схема технологического процесса устройства. Один или мор е светодиодные огни определенных длин волн осветить образец клеток в трубку FACS. Светодиоды окружены водой, которая постоянно обменивается с помощью ванны циркулятора нагретой, чтобы поддерживать температуру клеточного образца стабильной. Для экспериментов живых клеток температуру доводят до 37 ° С. Во время этой контролируемой температурой освещения, клетки поглощают в цитометр потока для анализа. Эта установка позволяет, например, для анализа кинетических свойств инструмента оптогенетика. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 6: Температура освещенной PBS в течение долгого времени. 1 мл PBS в стеклянной трубке FACS освещалась в течение долгого времени с 360 нм свет, 400 нм света или света 500 нм.загрузить / 54707 / 54707fig6large.jpg "мишень =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 7: Модель для photoswitching белка Dronpa-линкер-Dronpa. Освещение с 400 нм света будет димеризуются (и tetramerize) Dronpa и сделать его флуоресцентные. Освещение с 500 нм света приведет к диссоциации белков Dronpa, где мономерный Dronpa является нефлуоресцирующего. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 8: Определение характеристик photoswitching свойств Dronpa с использованием LED Thermo Flow в сочетании с F низкая цитометрии. Клетки были освещены, как указано выше, по оси Х и Dronpa средней интенсивности флуоресценции (MFI) изображается с течением времени. Гибридный белок Dronpa-линкер-Dronpa можно photoswitched несколько раз с помощью устройства (слева). Спонтанное восстановление интенсивности флуоресценции Dronpa только происходит медленно и неэффективно (справа). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 9: Кинетический анализ Dronpa photoswitching. Рассчитаны кинетика Dronpa photoswitching для первоначального 4 мин. освещения и восстановления была рассчитана на начальный 4 мин. инкубации в темноте, как указано цветных областях. Склоны для каждого расчета изображены жирными цифрами.ource.jove.com/files/ftp_upload/54707/54707fig9large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Thermo Flow LED представляет собой инновационное устройство для изучения оптогенетика инструментов в цитометр потока.
До сих пор оптогенетика образцы были освещены только с микроскопией лазерами или фонарика устройств 11,12. В зависимости от угла и расстояния фонаря к образцу, существует значительная вариабельность в количестве освещения, как ожидается, между экспериментами. Кроме того, существует ограничение на количество фонариков один человек может работать в эксперименте. Это ограничивает экспериментальную репертуар и воспроизводимостью. во время развития нашего устройства, которое может быть использовано для характеристики кинетики photoswitching в реальном масштабе времени в живых клетках Эти ограничения были адресованы. Насколько нам известно, не сравнимой устройство не существует.
В текущей конфигурации, до 30 светодиодов могут быть встроены в одну камеру Thermo Flow. Таким образом, в зависимости от требуемых интенсивностей света для каждой длины волны, одно устройство может быть наме изд широкого спектра оптогенетика инструментов. Установленные протоколы photoswitching затем могут быть оптимизированы для функциональных считываниями, например, измерения потоков кальция. Наше устройство может быть пригодным для других оптически регулируемых веществ, таких как проарретированных соединений или фотоактивируемых флуорофоров.
В зависимости от научного вопроса и образца используются, индивидуализированные протоколы могут быть быстро установлены. Использование стеклянных трубок вместо полистирола или полипропиленовые пробирки рекомендуется ограничить светоиндуцированного цитотоксичность на длинах волн 400-500 нм. Все протестированные клеточные линии, выжила освещение (360 нм, 400 нм или 500 нм) в течение до одного часа в стеклянных трубках. Мы попытались выяснить причину гибели клеток при освещении в пластиковых трубах путем проведения экспериментов по передаче. Мы освещен клетки в PBS или RPMI светом различных длин волн, а затем переносили супернатант без подсветки клеток для измерения гибели клеток. Ни один из собраннойсупернатанты вызывали значительную гибель клеток в клетки-реципиенты (данные не показаны). Кроме того, температура освещенного PBS в полистироле, или полипропиленовые пробирки практически идентична температуре в стеклянных трубках. Следовательно, мы можем только догадываться о причинах гибели клеток. Световая пластик может выпустить неустойчивое вещество или излучение с длиной волны, которая является токсичным для клеток.
Выбор среды используется для каждого эксперимента важно. Буферная емкость необходимо учитывать и различные реагенты, как рН-индикаторы, поглощают различные длины волн в разной степени. Кроме того, выживаемость клеток значительно отличается, например, при сравнении FCS, свободных от ПСТ, содержащей средства массовой информации.
Цель светового титрования использовать минимальное количество света, необходимого для достижения максимальной photoswitching. Для большинства экспериментов, выгодно, чтобы максимизировать скорость photoswitch и, следовательно, увеличить интенсивность освещения. Но, в зависимости от wavelength и тип клеток, свет может оказывать прямое влияние на поведение сигнализации, поэтому чрезмерное освещение следует избегать.
Можно запрограммировать легкие расписания для нашего устройства и подключить его к компьютеру, как это характерно для других световых приборов. Однако, поскольку большинство цитометры потока в общих рабочих местах разделяют множество различных лабораторий, то лучше, чтобы поддерживать устройство в качестве компактен и универсален, насколько это возможно. Кроме того, ручная обработка нашего устройства для установки двухцветной, как представленный здесь настолько прост, что программирование будет лишь незначительно улучшить экспериментальную процедуру.
Взятые вместе, мы приведем здесь инновационное устройство, которое сочетает в себе мощь оптогенетика инструментов и проточной цитометрии. Это позволит существенно упростить характеристику и развитие оптогенетика инструментов в естественных условиях и расширить экспериментальный репертуар.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass FACS tube | Thermo Fisher Scientific; Waltham, USA | 14-961-26 | Borosilicate glass tubes 12x75 mm |
| Flow Cytometer | BD Bioscienceg; Heidelberg, Germany | Fortessa II | Special Order |
| Dronpa: pcDNA3-mNeptune2-N | Addgene; Cambridge, USA | 41645 | |
| PolyJet | SignaGen, Rockville, USA | SL100688 | |
| LED 505 nm | Avago Technologies; Boeblingen, Germany | HLMP-CE34-Y1CDD | |
| LED 400 nm | Avago Technologies; Boeblingen, Germany | UV5TZ-400-15 | |
| Plexiglas tube 15 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 76999 | |
| Plexiglas 3 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692230 | |
| Plexiglas 2.5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692225 | |
| Plexiglas 1.5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692215 | |
| PVC tile 5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.005 | |
| PVC tile 6 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.006 | |
| PVC block 50 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.050 | |
| RPMI | Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany | 61870-010 | |
| 2-Mercaptoethanol | EMD; Germany | 805740 | |
| FCS | PAN Biotech; Aidenbach, Germany | P30-3302 | |
| Penicillin/Strptomycin (10,000 U/mL) | Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany | 15140-122 | |
| Acrifix plexiglas glue | Evonic industries, Essen, Germany | 1R0192 | |
| Tangit PVC-U glue | Henkel, Düsseldorf, Germany |
References
- Dugue, G. P., Akemann, W., Knopfel, T. A comprehensive concept of optogenetics. Prog Brain Res. 196, 1-28 (2012).
- Tischer, D., Weiner, O. D. Illuminating cell signalling with optogenetic tools. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 551-558 (2014).
- Toettcher, J. E., Voigt, C. A., Weiner, O. D., Lim, W. A. The promise of optogenetics in cell biology: interrogating molecular circuits in space and time. Nat Methods. 8 (1), 35-38 (2011).
- Zhang, K., Cui, B. Optogenetic control of intracellular signaling pathways. Trends Biotechnol. 33 (2), 92-100 (2015).
- Bugaj, L. J., Choksi, A. T., Mesuda, C. K., Kane, R. S., Schaffer, D. V. Optogenetic protein clustering and signaling activation in mammalian cells. Nat Methods. 10 (3), 249-252 (2013).
- Bugaj, L. J., et al. Regulation of endogenous transmembrane receptors through optogenetic Cry2 clustering. Nat Commun. 6, 6898 (2015).
- Strickland, D., et al. TULIPs: tunable, light-controlled interacting protein tags for cell biology. Nat Methods. 9 (4), 379-384 (2012).
- Taslimi, A., et al. An optimized optogenetic clustering tool for probing protein interaction and function. Nat Commun. 5, 4925 (2014).
- Toettcher, J. E., Gong, D., Lim, W. A., Weiner, O. D. Light-based feedback for controlling intracellular signaling dynamics. Nat Methods. 8 (10), 837-839 (2011).
- Toettcher, J. E., Weiner, O. D., Lim, W. A. Using optogenetics to interrogate the dynamic control of signal transmission by the Ras/Erk module. Cell. 155 (6), 1422-1434 (2013).
- Wang, J., et al. Utilization of a photoactivatable antigen system to examine B-cell probing termination and the B-cell receptor sorting mechanisms during B-cell activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (5), E558-E567 (2016).
- Wend, S., et al. Optogenetic control of protein kinase activity in mammalian cells. ACS Synth Biol. 3 (5), 280-285 (2014).
- Zhou, X. X., Chung, H. K., Lam, A. J., Lin, M. Z. Optical control of protein activity by fluorescent protein domains. Science. 338 (6108), 810-814 (2012).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J Immunol Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
- Givan, A. L. Flow cytometry: an introduction. Methods Mol Biol. 699, 1-29 (2011).
- Brakemann, T., et al. A reversibly photoswitchable GFP-like protein with fluorescence excitation decoupled from switching. Nat Biotechnol. 29 (10), 942-947 (2011).
