Introduction
Outils optogénétiques ont gagné en popularité, en partie parce qu'ils peuvent être utilisés pour déchiffrer le câblage des voies de signalisation 1-4. Ils sont basés sur la capacité des protéines photoactivables pour changer leur conformation et l'affinité de liaison lorsqu'il est éclairé par la lumière. Fusionnant ces protéines à des éléments de signalisation permet la régulation spécifique d'un seul joueur dans complexes voies de signalisation intracellulaires 5-12. Par conséquent, une voie de signalisation peut être étudiée avec une résolution spatiale et temporelle élevée.
La plupart des études basées sur des cellules optogénétiques utilisent des méthodes basées sur la microscopie, combinée à la culture en présence de lumière, suivie par l' analyse biochimique 11,12. En revanche, un flux singularise cytomètre de cellules le long d'un capillaire et mesure la taille de la cellule, la granularité et l'intensité de fluorescence. Cette méthode présente des avantages majeurs sur la microscopie ou biochimiques méthodes, y compris la capacité d'analyser thousands de cellules à une résolution unique cellule vivante dans un temps très court. Par conséquent, il est souhaitable de combiner avec optogénétique cytométrie de flux.
À notre connaissance, il n'y a pas de protocole établi pour cytométrie de flux optogenetic. Une méthode largement acceptée consiste à éclairer manuellement les cellules à l'extérieur du tube de réaction avec des dispositifs d'affichage lumineux. Cependant, l'éclairage manuel du débit nécessite cytomètre la lumière de passer à travers le tube de réaction et, pour l'imagerie des cellules vivantes, une forme cylindrique, chambre d'eau chauffée. Cela provoque la diffusion de lumière importante et la perte de lumière. En outre, l'intensité de la lumière fournie par un éclairage manuel est pas reproductible entre les expériences (angle, distance, etc.) et il y a une limite pratique au nombre de longueurs d'onde dans une expérience.
En construisant le dispositif LED Thermo Flow, nous avons pu surmonter ces limitations. Avec ce dispositif, les cellules peuvent être éclairées par des longueurs d'onde spécifiques dans une températurelit- contrôlée de manière pendant les mesures de cytométrie en flux. Cela permet des quantités précises et reproductibles de la lumière à l'intérieur et entre les expériences.
Pour démontrer l'utilité de notre dispositif in vivo, nous avons enregistré le signal de fluorescence de Dronpa dans les cellules B Ramos pendant photocommutation. les cellules B Ramos sont dérivées d'un lymphome de Burkitt humain. Dronpa est une protéine fluorescente qui existe sous forme d'un monomère, dimère ou un tétramère. Dans sa forme monomère, il est non-fluorescent. Illumination avec 400 nm de lumière induit dimérisation et tétramérisation et rend la protéine fluorescente Dronpa. Ce processus peut être inversé par illumination avec 500 nm de lumière. La protéine Dronpa a été utilisé pour contrôler la fonction et la localisation des protéines de signalisation 4,13.
Ici, nous avons exprimé une protéine Dronpa-Linker-Dronpa dans les cellules B Ramos pour étudier photocommutation de Dronpa dans un cytomètre de flux. En utilisant notre dispositif, nous avons pu efficacement etPHOTOSWITCH reproductible Dronpa lors de l'enregistrement de son intensité de fluorescence en temps réel. Cette méthode offre des avantages substantiels par rapport aux protocoles d'éclairage actuels avec éclairage manuel et élargit considérablement le répertoire expérimental pour les outils optogénétiques et des composés de la cage. Grâce à notre dispositif simplifiera considérablement et d'accélérer la découverte et le développement de nouveaux outils de optogénétiques.
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Protocol
1. Conception et création de l'appareil
- Des expériences pilotes
NOTE: L'intensité lumineuse nécessaire pour un outil et une cellule optogenetic type spécifique peut varier de façon significative. Des expériences pilotes avec des prototypes sont utiles pour estimer l'intensité de la lumière minimale nécessaire. L'outil optogenetic utilisé pour les expériences suivantes est une construction de fusion Dronpa-Lieur-Dronpa. La séquence Dronpa a été obtenu dans le commerce (voir la liste des matériaux). Une longue liaison a été clone entre les deux séquences Dronpa pour permettre la construction exprimée pour former des dimères intramoléculaires (et intermoléculaires). Les étapes décrites ci-dessous peuvent être adaptées à de nombreux autres outils optogénétiques ou des substances optiquement contrôlées.- Transduction des lymphocytes B Ramos avec un contenant construction Dronpa-Linker-Dronpa suivant les instructions du fabricant pour la transduction en utilisant le surnageant retroviral contenant des cellules d'emballage. La récolte et des cellules de comptage en fonction d'un prédemment publié le protocole 13.
- Resuspendre les cellules à une concentration de 1 x 10 6 / ml dans du milieu (RPMI 1640, 10% de FCS, 2 mM de L-glutamine inactivé par la chaleur, 100 U / ml de pénicilline, 100 U / ml de streptomycine et 50 pM de 2-mercaptoéthanol) et les transférer dans un tube FACS de verre.
- Insérer le tube dans un cytomètre de flux et de mesurer l'intensité de fluorescence de Dronpa (canal de GFP) 14,15.
- Porter des lunettes de protection pour toutes les autres mesures pour protéger les yeux des longueurs d'onde éventuellement dommageables.
- Placer manuellement un éclairage à LED 500 nm à l'extérieur du tube et continuer à mesurer l'intensité de fluorescence de Dronpa.
- Augmenter le nombre et / ou l'intensité des lumières LED jusqu'à Dronpa intensité de fluorescence diminue.
- Placer manuellement un éclairage à LED 400 nm à l'extérieur du tube et continuer à mesurer l'intensité de fluorescence de Dronpa.
- Augmenter le nombre et / ou l'intensité des lumières LED jusqu'à ce que le fluo Dronparescence intensité augmente.
- Utilisez au moins autant de lumières LED pour la construction de l'appareil comme prévu nécessaire du photocommutation dans les étapes 1.1.5 et 1.1.7.
- Construire le dispositif
REMARQUE: L'appareil a été construit par un atelier d'usinage professionnel, le Arbeitsgruppe Technik de l'Université de Fribourg. La plupart des pièces sont fabriquées sur mesure et non disponibles dans le commerce. Les dimensions exactes de chaque pièce sont représentés sur les figures 1 et 2. Pour clarifier l'ensemble de ce dispositif, complémentaire vidéo 1 est fourni et les étapes les plus essentielles sont décrites ci-dessous.- Un broyeur pièce à partir de chlorure de polyvinyle (PVC) , avec les dimensions exactes représentées sur la figure 1A.
- Insérez les lumières LED dans les trous percés de la pièce A et sceller chaque trou avec de la colle PVC pour éviter les fuites d'eau.
- Connecter les LED à un transformateur multicanal (chaque longueur d'onde doit occuper une chann séparéeel) avec une puissance de sortie réglable 0-29 mA.
- Fixer la gaine extérieure (B) avec 3 vis à la pièce A comme représenté pour protéger les LED contre les dommages physiques.
- Pour être en mesure de connecter l'appareil à une pompe à eau, de la colle dans les colliers de serrage (C) dans les trous forés de la pièce A (représentée sur la figure 1a, section transversale Y: 9 mm et 61,5 mm) à l' aide de la colle PVC.
- Coupez un long tube en plexiglas de 58,5 mm (D1).
- Fabriquer des pièces D2 et D3 à partir de Plexiglas comme cela est représenté sur la figure 2.
- Pièce de colle D3 au fond de D1 en Plexiglas avec de la colle.
- Fixer un joint torique en caoutchouc pour pièce D2 et il colle à la partie supérieure de D1 avec Plexiglas colle.
NOTE: Les pièces D1, D2 et D3 forment ensemble pièce D. - Insérez la pièce D dans la pièce A avec 3 vis.
- Testez le dispositif de fuite d'eau avant la mise sous tension du transformateur.
2. Mesurer la cinétique d'un outil optogénétiques
- La culture de cellules B Ramos dans le milieu RPMI (RPMI 1640, 10% de FCS, 2 mM de L-glutamine inactivé par la chaleur, 100 U / ml de pénicilline, 100 U / ml de streptomycine et 50 pM de 2-mercaptoéthanol) à une densité de 3- 10 x 10 6 cellules / mL à 37 ° C et 5% de CO 2.
- la récolte des cellules B Ramos par centrifugation à 350 x g et 4 ° C pendant 5 min.
- Nombre de cellules en utilisant une chambre de comptage de Neubauer en suivant les instructions du fabricant et resuspendre 1-5 x 10 6 cellules dans 600 ul de milieu.
- Transférer les cellules dans un tube de FACS de verre, mettez-les sur de la glace et de les protéger de la lumière jusqu'à la mesure.
- Connectez l'appareil à une pompe à eau chauffée et régler la température à 37 ° C.
- Lors de l'utilisation des tubes FACS de verre, échanger le joint torique noir de la cytométrie de flux avec un joint torique en caoutchouc et appliquer en plus gr de siliciumfacilité.
- Insérez soigneusement le verre FACS tube dans le dispositif et le connecter à la cytométrie de flux (Figure 3).
- Lancer la mesure et enregistrer Dronpa intensité de fluorescence (canal GFP).
- Illuminez l'échantillon de cellules avec 400 nm ou 500 nm de lumière, respectivement, et enregistrer l'intensité de fluorescence Dronpa (canal GFP).
- Analyser les données expérimentales avec un débit approprié cytomètre logiciel. Plot diffusion vers l'avant contre la dispersion et la porte latéralement les cellules vivantes. Tracer l'intensité de fluorescence Dronpa au fil du temps.
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Representative Results
Utilisation de la Thermo flux LED avec un cytomètre de flux
Le noyau fonctionnel du dispositif est une chambre cylindrique dans laquelle les lumières LED sont disposées de manière circulaire pointant vers l'intérieur. Cette chambre peut être reliée à une alimentation et une pompe d'eau, ce qui permet de contrôler la température des diodes électroluminescentes, ainsi que de l'échantillon de cellules. Les DEL sont connectées à un transformateur et par conséquent l'intensité lumineuse pour chaque longueur d'onde peuvent être commandés individuellement. Le centre du dispositif loge un tube de taille de FACS standard, qui peut être relié à la plupart des cytomètres classiques (figures 4 et 5). Pour montrer que l' éclairage dans notre dispositif ne conduit pas à un chauffage indésirable des cellules, nous avons mesuré la température du PBS éclairé au fil du temps (figure 6) pour trois longueurs d' onde différentes. Illumination avec 360 nm, 400 nm ou 500 nm conduit à seulementmarginal augmentation de la température. Dans l'ensemble, le dispositif présenté ici permet l'éclairage reproductible des échantillons cellulaires à température contrôlée pour être mesurée dans un cytomètre de flux.
Photocommutation de Dronpa
Un vecteur d'expression codant pour une Dronpa-Lieur-Dronpa 13,16 construction de fusion a été cloné et transduit dans des cellules B Ramos. Comme cela est représenté sur la figure 7, l'objectif est de contrôler la conformation de cette protéine de fusion avec de la lumière de longueurs d'onde spécifiques. En utilisant notre dispositif, la protéine de fusion Dronpa-Linker-Dronpa cytosolique a été photoswitched plusieurs fois (Figure 8, à gauche). Le passage à l'état sombre se produit lentement, alors que le passage à l'état lumineux se produit presque instantanément. La récupération de fluorescence spontanée de Dronpa dans l'obscurité montre que photocommutation efficace pour la forme lumineuse nécessite un éclairage spécifique etne se produit lentement spontanément (Figure 8, à droite).
Nous avons effectué une analyse cinétique des propriétés de photocommutation (figure 9). Les pentes de la cinétique de commutation ont été calculées pour la première 4 min de l'illumination. La pente de la récupération spontanée a été calculé pour la première 4 min dans l'obscurité.
L'analyse cinétique montre que la vitesse de photocommutation Dronpa est globalement très reproductible. En revanche, la récupération spontanée de Dronpa fluorescence dans l'obscurité est très inefficace. Même après une longue période d'incubation dans l'obscurité, seulement environ 10% de la fluorescence Dronpa est récupérée. Cela montre qu'en effet, l'éclairage dans notre dispositif induit photocommutation.
Par conséquent, en utilisant la méthode décrite, on peut générer en temps réel des données photocommutation dans un cytomètre de flux, qui peutêtre traduit en une évaluation cinétique des nombreux outils optogénétiques.
Figure 1: Plan de la couche extérieure de la construction. Toutes les pièces représentées sont fabriqués à partir de chlorure de polyvinyle (PVC). Pièce A: pièce cylindrique en PVC avec des trous percés pour insérer les LED et les colliers de serrage. Pièce B: La gaine extérieure pour protéger les LED contre les dommages physiques. Pièce C: La pince de tube qui relie la cavité intérieure avec des tubes en caoutchouc pour permettre le refroidissement de l' eau. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Plan de la couche intérieure de la construction. Toutes les pièces représentées sont fabriqués à partir de plexiglas. Pièce D: Cette pièce est constituée de trois éléments D1, D2 et D3 et qui forme l'unité enfermant le tube FACS. Pièce D1: Cylindrique Plexiglas tube. Piece D2: le couvercle inférieur de la couche intérieure. Piece D3: Couvercle de la couche intérieure. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Utilisation de l'appareil avec un cytomètre de flux. A1: entrée de l' échantillon d'un cytomètre de flux; A2: tube FACS reliée à l'entrée de l' échantillon; B: Le dispositif entourant le tube FACS; C: entrée de l' échantillon; D: entrée de l' échantillon avec le dispositif.ove.com/files/ftp_upload/54707/54707fig3large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: Flux schématique du dispositif. A: Les cellules sont allumées dans le dispositif ( en bas à gauche) et en même temps pris et analysés dans le cytomètre de flux ( en haut à gauche). Cela permet, par exemple, l'analyse des propriétés cinétiques d'un outil optogenetic (en haut à droite). B: section transversale du dispositif. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5: Déroulement Schéma de l'appareil. Un ou mor e DEL de lumières de longueurs d'onde spécifiques éclairent l'échantillon de cellules dans un tube FACS. Les LED sont entourés d'eau, qui est constamment échangé par un circulateur de bain chauffé pour maintenir la température de l'échantillon cellulaire stable. Pour les expériences de cellules vivantes, la température est ajustée à 37 ° C. Au cours de cette illumination à température contrôlée, les cellules sont reprises dans le cytomètre de flux pour l'analyse. Cette configuration permet, par exemple, pour analyser les propriétés cinétiques d'un outil de optogenetic. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6: Température de PBS lumineux au fil du temps. 1 ml de PBS dans un verre FACS tube a été illuminé au fil du temps à 360 nm de lumière, 400 nm ou 500 nm de lumière lumière.télécharger / 54707 / 54707fig6large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 7: Modèle pour photocommutation de la protéine Dronpa-Linker-Dronpa. Illumination avec 400 nm lumière dimériser (et tetramerize) Dronpa et le rendre fluorescent. Illumination avec 500 nm de lumière va conduire à la dissociation des protéines Dronpa, où monomère Dronpa est non fluorescent. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 8: Caractérisation des propriétés photocommutation Dronpa en utilisant le flux de thermo DEL combinée à la f faible cytométrie. Les cellules ont été illuminées comme indiqué ci-dessus de l'axe des X et l'Dronpa intensité de fluorescence moyenne (MFI) est représenté au fil du temps. La protéine de fusion Dronpa-Lieur-Dronpa peut être photoswitched plusieurs fois en utilisant le dispositif (gauche). La guérison spontanée de l'intensité de fluorescence Dronpa ne se produit que lentement et inefficacement (à droite). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 9: Analyse cinétique de Dronpa photocommutation. La cinétique de la Dronpa photocommutation ont été calculées pour la première 4 min. l'éclairage et la récupération a été calculée pour la première 4 min. l'incubation dans l'obscurité, comme indiqué par les zones colorées. Les pistes pour chaque calcul sont représentés en caractères gras.ource.jove.com/files/ftp_upload/54707/54707fig9large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Le Thermo flux LED est un dispositif innovant pour étudier les outils optogénétiques dans un cytomètre de flux.
Jusqu'à présent, les échantillons optogénétiques ont été illuminée seulement avec des lasers de microscopie ou des dispositifs de lampe de poche 11,12. En fonction de l'angle et la distance de la lampe torche à l'échantillon, la variabilité importante de la quantité d'éclairement est prévu entre les expériences. En outre, il y a une limite au nombre de lampes de poche une seule personne peut fonctionner dans une expérience. Cela restreint le répertoire expérimental et la reproductibilité. Ces limitations ont été abordées au cours du développement de notre dispositif, qui peut être utilisé pour caractériser la cinétique de photocommutation en temps réel dans les cellules vivantes. À notre connaissance, aucun dispositif comparable existe.
Dans la configuration actuelle, jusqu'à 30 LEDs peuvent être intégrés dans une chambre Thermo Flow. Ainsi, en fonction des intensités lumineuses requises pour chaque longueur d'onde, un seul appareil peut être noused pour une grande variété d'outils optogénétiques. Les protocoles de photocommutation établis peuvent alors être optimisés pour des affichages fonctionnels, par exemple, des mesures de flux de calcium. Notre dispositif peut être adapté à d'autres substances optiquement contrôlées, tels que les composés en cage ou fluorophores photoactivables.
En fonction de la question scientifique et l'échantillon utilisé, les protocoles individualisés peuvent être établis rapidement. L'utilisation de tubes en verre au lieu de tubes en polystyrène ou en polypropylène est recommandé de limiter la cytotoxicité induite par la lumière aux longueurs d'onde entre 400-500 nm. Toutes les lignées cellulaires testées ont survécu à l'illumination (360 nm, 400 nm ou 500 nm) pendant jusqu'à une heure dans des tubes en verre. Nous avons essayé d'enquêter sur la cause de la mort cellulaire pendant l'illumination dans des tubes en plastique en effectuant des expériences de transfert. Nous illuminés cellules dans PBS ou RPMI avec une lumière de différentes longueurs d'onde, puis transféré le surnageant dans des cellules non-éclairé pour mesurer la mort cellulaire. Aucun des collectésLes surnageants ont provoqué une mort cellulaire significative dans les cellules réceptrices (données non présentées). En outre, la température du système éclairage du PBS dans du polystyrène, ou des tubes en polypropylène est pratiquement identique à la température dans des tubes en verre. Par conséquent, nous ne pouvons que spéculer sur la cause de la mort cellulaire. plastique éclairé peut libérer une substance instable ou un rayonnement d'une longueur d'onde qui est toxique pour les cellules.
Le choix du moyen utilisé pour chaque expérience est importante. La capacité de la mémoire tampon doit être considérée et les différents réactifs, comme indicateurs de pH, d'absorber différentes longueurs d'onde à des degrés différents. En outre, la survie cellulaire diffère de manière significative, par exemple, lorsque l'on compare libre de FCS à FCS contenant des milieux.
Le but de titration lumière est d'utiliser la quantité minimale de lumière nécessaire pour photocommutation maximale. Pour la plupart des expériences, il est avantageux de maximiser la vitesse de la photocommutateur et donc de maximiser l'intensité lumineuse. Mais, selon le wavelength et type de cellule, la lumière peut avoir des effets directs sur le comportement de signalisation, ce qui explique pourquoi l'illumination excessive doit être évitée.
Il est possible de programmer des horaires de lumière pour notre appareil et de le relier à un ordinateur comme il est courant pour les autres appareils d'éclairage. Cependant, étant donné que la plupart des cytomètres de flux sont dans les lieux de travail communs partagés par de nombreux laboratoires différents, il est préférable de maintenir le dispositif aussi petit et portable que possible. En outre, la manutention manuelle de notre dispositif pour une configuration à deux couleurs tel que présenté ici est si simple, que la programmation serait que marginalement améliorer la procédure expérimentale.
Pris ensemble, nous présentons ici un dispositif innovant, qui combine la puissance des outils optogénétiques et cytométrie en flux. Cela va considérablement simplifier la caractérisation et le développement d'outils optogénétiques in vivo et élargir le répertoire expérimental.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass FACS tube | Thermo Fisher Scientific; Waltham, USA | 14-961-26 | Borosilicate glass tubes 12x75 mm |
| Flow Cytometer | BD Bioscienceg; Heidelberg, Germany | Fortessa II | Special Order |
| Dronpa: pcDNA3-mNeptune2-N | Addgene; Cambridge, USA | 41645 | |
| PolyJet | SignaGen, Rockville, USA | SL100688 | |
| LED 505 nm | Avago Technologies; Boeblingen, Germany | HLMP-CE34-Y1CDD | |
| LED 400 nm | Avago Technologies; Boeblingen, Germany | UV5TZ-400-15 | |
| Plexiglas tube 15 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 76999 | |
| Plexiglas 3 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692230 | |
| Plexiglas 2.5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692225 | |
| Plexiglas 1.5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692215 | |
| PVC tile 5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.005 | |
| PVC tile 6 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.006 | |
| PVC block 50 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.050 | |
| RPMI | Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany | 61870-010 | |
| 2-Mercaptoethanol | EMD; Germany | 805740 | |
| FCS | PAN Biotech; Aidenbach, Germany | P30-3302 | |
| Penicillin/Strptomycin (10,000 U/mL) | Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany | 15140-122 | |
| Acrifix plexiglas glue | Evonic industries, Essen, Germany | 1R0192 | |
| Tangit PVC-U glue | Henkel, Düsseldorf, Germany |
References
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