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Biology

Analisi di SCAP doi: 10.3791/54709 Published: November 8, 2016

Summary

Descriviamo un metodo modificato per l'isolamento frazione di membrana da cellule umane e preparazione del campione per la rilevazione di -glycosylation SCAP N e proteine totali mediante western blot. Introduciamo inoltre un metodo GFP-etichettatura per monitorare il traffico di SCAP usando la microscopia confocale. Questo protocollo può essere utilizzato in laboratori di biologia regolare.

Introduction

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La deregolamentazione del metabolismo dei lipidi è una caratteristica comune di cancro e metaboliche malattie 1-6. In questi processi, steroli normativi proteine elemento vincolante (SREBPs), una famiglia di fattori di trascrizione, giocano un ruolo critico nel controllo della espressione di geni importanti per l'assorbimento e la sintesi del colesterolo, acidi grassi e fosfolipidi 7-10.

SREBPs, tra cui SREBP-1a, SREBP-1c e SREBP-2, sono sintetizzate come precursori inattivi che si legano alla membrana del reticolo endoplasmatico (ER) in virtù di due domini transmembrana 7. L'N-terminale di SREBPs contiene un dominio di legame al DNA per la transattivazione di geni bersaglio 11. Il C-terminale di precursori SREBP lega al SREBP scissione-attivando proteina (SCAP) 12,13, una proteina di membrana politopica che gioca un ruolo fondamentale nella regolazione della stabilità SREBP e l'attivazione 14-16.

all'attuazione della funzione trascrizionale richiede la traslocazione del complesso SCAP / SREBP dal pronto soccorso al Golgi, dove due proteasi in sequenza fendono SREBP e rilasciare il suo frammento N-terminale, che entra poi nel nucleo per la transattivazione di geni lipogenici 7. In questi processi, i livelli di steroli nella membrana ER controllano l'uscita del complesso SCAP / SREBP dal ER 7,17. In condizioni di elevate steroli, steroli lega alla SCAP o ER-residente insulino-indotta gene della proteina-1 (Insig-1) o -2 (Insig-2), migliorando l'associazione di SCAP con Insigs che mantengono il complesso SCAP / SREBP nel ER 18-20. Quando i livelli di steroli diminuiscono, SCAP dissocia con Insigs. Questo porta ad un cambiamento conformazionale SCAP, che consente l'interazione con proteine ​​di rivestimento SCAP comuni complesso (COP) II. Il complesso media l'inserimento del complesso SCAP / SREBP nelle vescicole erba e dirige il suo trasporto dal pronto soccorso al Golgi 21,22. Su Transloczione al Golgi, SREBPs vengono sequenzialmente scissi mediante Site-1 e Site-2 proteasi, porta al rilascio del N-terminale 7,23-29.

Proteine SCAP trasporta tre N -linked oligosaccaridi a asparagina (N) posiziona N263, N590, N641 e 15. Abbiamo recentemente rivelato che il glucosio-mediata N -glycosylation di SCAP in questi siti è un prerequisito per il traffico di SCAP / SREBP dal pronto soccorso al Golgi in condizioni di bassa steroli 30-32. Perdita di SCAP glicosilazione tramite mutazione di tutti e tre asparagina a glutammina (NNN a qqq) disabilita il traffico del complesso SCAP / SREBP e risultati nella instabilità della proteina SCAP e la riduzione dell'attivazione SREBP 31. I nostri dati recenti dimostrano inoltre che SREBP-1 è altamente attiva nel glioblastoma e regolamentata dalla SCAP N -glycosylation 4,31,33,34. Targeting SCAP / SREBP-1 segnalazione sta emergendo come una nuova strategia per il trattamento di tumori maligni e s metaboliciyndromes 1,3,35-38. Pertanto, è importante sviluppare un metodo efficace per analizzare i livelli di proteina SCAP e N -glycosylation e controllare tale traffico di cellule umane e tessuti del paziente.

La regione luminale di proteine SCAP (aminoacidi 540-707) in un pronto soccorso contiene due siti -glycosylation N (N590 e N641) che sono protetti da proteolisi quando membrane intatte sono trattati con tripsina 15. Questo frammento luminale ha un peso molecolare di ~ 30 kDa che è abbastanza piccolo da consentire la risoluzione delle singole varianti glicosilate SCAP da sodio dodecil solfato gel di poliacrilammide (SDS-PAGE) 15,31. Qui, forniamo un metodo per rilevare N -glycosylation della SCAP e proteine totali nelle cellule umane. Questo protocollo è derivato dal metodo descritto nelle pubblicazioni dal laboratorio Brown e Goldstein 15 e la nostra recente pubblicazione 31. Il protocollo può essere utilizzato in tegli lo studio di proteine ​​SCAP da cellule di mammifero.

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Protocol

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1. Individuazione di endogena SCAP proteine ​​nelle cellule umane

  1. Colture cellulari e trattamento
    1. Cellule Seed ~ 1 × 10 6 U87 in 10 cm piatto con Modified Eagle Medium di Dulbecco (DMEM) supplementato con siero 5% bovino fetale (FBS) e incubare le cellule a 37 ° C e 5% CO 2 per 24 ore prima del trattamento.
    2. Lavare le cellule una volta con tampone fosfato salino (PBS), quindi passare cellule per mezzo DMEM fresco con o senza glucosio (5 mM) per 12 hr.
  2. Preparazione di Membrana cellulare frazioni e nucleari Estratti
    1. Lavare le cellule una volta con PBS, raschiare in 1 ml di PBS e centrifugare a 1000 xg per 5 minuti a 4 ° C.
    2. Risospendere le cellule in un buffer ghiacciata contenente 10 mM HEPES-KOH (pH 7,6), 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl 2, 1 mM di sodio dell'acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), 1 mM di acido etilen sodio glicole tetraacetico (EGTA), 250 mM saccarosio, ed una miscela di inibitori delle proteasi (5 μg / ml pepstatina A, 10 mg / ml leupeptina, 0,5 mM phenylmethylsulfonyl fluoruro (PMSF), 1 mM ditiotreitolo (DTT), e 25 ug / ml di N-acetil-Leu-Leu-Norleu-al (ALLN)) per 30 min sul ghiaccio.
    3. Passare estratti cellulari tramite un 22 G x 1 1/2 ago 30 volte e centrifugare a 890 xg a 4 ° C per 5 minuti per isolare nuclei.
    4. Utilizzare il supernatante per la separazione di frazioni di membrana (fase 1.2.7). Risospendere il pellet nucleare in 0,1 ml di tampone C (20 mM HEPES / KOH pH 7,6, 0,42 M di NaCl, 2,5% (v / v) glicerolo, 1,5 mM MgCl 2, 1 mM EDTA sodio, 1 mM di sodio EGTA ed una miscela di inibitori delle proteasi (5 mg / ml pepstatina A, 10 mg / ml leupeptina, 0,5 mM PMSF, 1 mM DTT, e 25 ug / ml ALLN)).
    5. Ruotare la sospensione a 4 ° C per 60 min e centrifugare a 20.000 xg in una microcentrifuga per 20 minuti a 4 ° C. Il surnatante è designato "estratti nucleari".
    6. Riscaldare gli estratti nucleari a 100 ° C per 10 min con tampone 5x carico (312.5 mM Tris-HCl pH 6,8, 10% SDS, 50% glicerolo, 12,5% β-mercaptoetanolo, e 0,05% blu di bromofenolo) prima di sottoporlo a SDS-PAGE.
    7. Centrifugare il surnatante dall'originale centrifuga 890 xg a 20.000 xg per 20 min a 4 ° C. Per la successiva analisi di western blot, sciogliere il precipitato in 0,1 ml di tampone SDS lisi (10 mM Tris-HCl pH 6,8, 100 mM NaCl, 1% (v / v) sodio dodecil solfato (SDS), 1 mM di sodio EDTA, e 1 mM EGTA sodio). Questo è designato "frazione di membrana".
      NOTA: Usiamo 20.000 xg per 20 minuti per far sedimentare le membrane. 100.000 xg per 10 - 20 minuti è stato usato nei documenti dal laboratorio Brown e Goldstein 15.
    8. Incubare la frazione di membrana a 37 ° C per 30 min e determinare la concentrazione di proteina Metodo di Bradford. Aggiungere 1 ml 100x bromofenolo soluzione blu prima di sottoporre i campioni a SDS-PAGE.
    9. Carico 25 - 50 mg di proteine totali di membrana su un gel SDS-PAGE 10% 39. Eseguire il gela 80 V per 15 minuti, poi cambiare a 130 V e correre per un altro 115 min. Trasferimento a 140 mA per 130 min 39.
      1. Per l'analisi Western blotting, utilizzare l'anticorpo anti-SCAP per rilevare la proteina totale SCAP. Utilizzare proteina disolfuro isomerasi (PDI), una proteina ER-residente 40, come controllo interno. Utilizzare anti-SREBP-1 anticorpi per rilevare il gruppo N-terminale di SREBP-1. Utilizzare Lamina A come controllo interno per estratti nucleari 31.

2. -glycosylation Analisi di SCAP N nelle cellule umane

  1. Cell Culture, Transfection, e trattamento
    1. Per l'analisi della membrana, cellule seme ~ 1 × 10 6 HEK293T in 10 cm piatto con DMEM integrato con 5% FBS e incubare le cellule a 37 ° C e 5% CO 2 per 24 ore prima della transfezione.
    2. Diluire 4-8 mcg GFP-SCAP plasmide (un dono del Dr. Peter Espenshade) 22 in 1 ml di una riduzione media di siero e mescolare delicatamente.
    3. Aggiungere 8 - 16 microlitri di reagente di trasfezione del DNA pipettando direttamente nelle 1 ml ridotti medio siero contenente plasmidi e mescolare delicatamente.
    4. Incubare il complesso reattivo / plasmide trasfezione per 25 min a temperatura ambiente.
    5. Aggiungere complesso trasfezione le cellule con mezzo fresco e continuare a coltura per 24 ore a 5% di CO 2 e 37 ° C.
    6. Risciacquare una volta con PBS e trattare le cellule per 12 ore con o senza glucosio (5 mM) in presenza o assenza di tunicamicina (1 ug / ml), un inibitore N -glycosylation.
  2. Preparare pellet membrana cellulare come descritto ai punti 1.2.1, 1.2.2, 1.2.3, 1.2.7 e.
  3. Rilevamento di SCAP N -glycosylation
    1. tripsina proteolisi
      1. Risospendere il pellet di membrana da cellule che sovraesprimono GFP-SCAP in 114 pl di tampone contenente 10 mM HEPES · KOH (pH 7,4), 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl 2, 1 mM EDTA sodio e 100 mM NaCl.
      2. incubare 5781; l aliquote di proteine ​​di membrana in assenza o presenza di 1 ml di tripsina (1 mg / mL), in un volume totale di 58 microlitri, per 30 min a 30 ° C.
      3. Arrestare reazioni con l'aggiunta di 2 ml (400 unità) di inibitore soia tripsina.
    2. Deglycosylation da Peptide- N- glicosidasi F (PNGase F)
      1. Per successivo trattamento con PNGase F, aggiungere 10 ml di soluzione contenente 3,5% (peso / volume) SDS e il 7% (vol / vol) 2-mercaptoetanolo per ogni campione.
      2. Dopo riscaldamento a 100 ° C per 10 min, sequenzialmente aggiungere 7 ml di 0,5 M sodio fosfato (pH 7,5), 7 ml di 10% (v / v) Nonidet P-40 con 12 × inibitori della proteasi, e 2 microlitri (0,5 U / ml) di PNGase F.
      3. Dopo incubazione a 37 ° C per 3 ore, interrompere le reazioni con l'aggiunta di tampone 5x carico (312,5 mM Tris-HCl pH 6,8, 10% SDS, 50% glicerolo, 12,5% β-mercaptoetanolo, e 0,05% blu di bromofenolo). Riscaldare le miscele a 100 ° C per 10 me soggetta a SDS-PAGE. Carico 25-50 mg di proteine totali di membrana su un gel SDS-PAGE 10% 39. Attivare il gel a 80 V per 15 minuti, poi passare a 130 V per un altro 115 min. Trasferimento a 140 mA per 130 min.
      4. Per il Western Blot, utilizzare 10 anticorpo ug / ml di anti-SCAP (9D5) per rilevare N -glycosylation e proteine totali SCAP.

3. Rilevamento di SCAP Tratta dal ER al Golgi mediante GFP-SCAP nelle cellule umane

  1. Seed 2.5 × 10 5 cellule U87 in piastre da 60 mm, con DMEM integrato con 5% FBS e incubare le cellule a 37 ° C e 5% CO 2 per 24 ore prima della transfezione.
  2. Diluire 4 mg GFP-SCAP plasmide in 0,5 ml di siero ridotto di medie e mescolare.
  3. Aggiungere 8 ml di reagente di trasfezione del DNA pipettando direttamente in 0,5 ml ridotto medio siero contenente plasmidi e mescolare delicatamente.
  4. Incubare il complesso reattivo / plasmide trasfezione per 25 min a cameratemperatura.
  5. Aggiungere complesso trasfezione le cellule con mezzo fresco e continuare a coltura per 24 ore a 5% di CO 2 e 37 ° C.
  6. Reseed 5 - 10 × 10 4 celle in un 6-pozzetti contenente un vetrino di vetro (22 mm x 22 mm) e continuare a coltura a 37 ° C e 5% di CO 2 per 24 ore.
  7. Risciacquare una volta con PBS e trattare le cellule per 12 ore con o senza glucosio (5 mM) in presenza o assenza di tunicamicina (1 mg / ml).
  8. Lavare le cellule una volta con PBS e fissare nel 4% di formaldeide per 10 min.
  9. Lavare le cellule tre volte con PBS, invertire i vetrini, montare su vetrini con antifade reagente, e sigillare il coprioggetto con smalto.
  10. Controllare il traffico di GFP-SCAP utilizzando un obiettivo ad immersione 63X in una scansione laser confocale microscopio 41.

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Representative Results

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La Figura 1 mostra il rilevamento di proteine endogene SCAP e SREBP-1 forma nucleare in cellule glioblastoma U87 umane in risposta al glucosio stimolazione mediante western blot. Il SCAP proteina di membrana viene rilevato nella "frazione di membrana". La forma nucleo (N-terminale) di SREBP-1 viene rilevata nelle "estratti nucleari". Il livello di proteine ​​SCAP (PDI funge da controllo interno delle proteine ​​di membrana ER) e SREBP-1 forma nucleare sono notevolmente migliorata dalla stimolazione di glucosio. Questi risultati dimostrano che il protocollo è in grado di rilevare la proteina SCAP endogena in cellule umane.


Figura 2 mostra l'analisi di -glycosylation SCAP N e livelli totali di proteina GFP-SCAP in risposta al glucosio stimolazione e trattamento tunicamicina in cellule HEK293T esprimono GFP-etichettata criceto SCAP. Figura N. Il frammento di SCAP contenente aa 540 - 707, situato nel 6 ° ciclo luminale nel ER, è tripsina resistente 15 e viene utilizzato per l'analisi di N -glycosylation sui siti N590 e N641. Come mostrato nella Figura 2B (pannello superiore), dopo il trattamento con tripsina, le bande di peso superiore (contenenti aa 540 - 707) indica proteina SCAP contenente uno o due N -linked oligosaccaridi (N590 e N641) in presenza di glucosio e assenza di PNGase o tunicamicina (rilevato da anticorpi IgG-9D5). In presenza di PNGase F, oligosaccaridi N-collegati sono stati rimossi dalla proteina SCAP, causando il frammento (aa 540 - 707) a muoversi più velocemente in SDS-PAGE. Coerentemente, bloccando il processo di iniziazione -glycosylation N da tunicamicina completamente abolito SCAP N -glycosylation, indicato dalla comparsa di un minorebanda di SCAP frammento (Figura 2B, pannello superiore). Inoltre, proteine totali GFP-SCAP (rilevata da un anticorpo contro GFP) è stato ridotto in assenza di glucosio o tramite trattamento tunicamicina (Figura 2B, pannello inferiore). Questi risultati dimostrano che il protocollo è adatto per l'analisi di SCAP N -glycosylation.


La figura 3 mostra che GFP-SCAP traffico dal pronto soccorso al Golgi in risposta al glucosio stimolazione è stata soppressa dal trattamento tunicamicina nelle cellule U87. Come mostrato in figura 3A, microscopia confocale mostrano che la proteina GFP-SCAP risiede nel ER in assenza di glucosio, come dimostra la sua co-localizzazione con PDI, un ER-proteina residente (rosso). Al contrario, in presenza di glucosio, GFP-SCAP muove al Golgi, indicato dalla co-localizzazione con Golgi proteina marker Giantin (rosso) (Figura 3B). Inoltre, tunicamicinatrattamento soppresso il traffico di glucosio-indotta di GFP-SCAP dal pronto soccorso al Golgi (Figura 3A e B).

Figura 1
Figura 1. Individuazione di endogena SCAP proteine e SREBP-1 Forma nucleare in cellule U87. Analisi Western Blot di membrana e nucleari estratti dalle cellule di glioblastoma U87 primarie umane coltivate in mezzi privi di siero con o senza glucosio (5 mm) per 12 ore. Anti-SCAP anticorpi contro SCAP aa umano 450-500 è stato utilizzato per rilevare la SCAP endogena in cellule umane. La forma attiva (N-terminale) di SREBP-1 viene rilevata nelle "estratti nucleari" utilizzando anticorpi contro il aa 301-407 frammento di SREBP-1 umano. Questo dato è stato modificato con il permesso di 31. Clicca qui per visualizzare un Versi più grandisu questa figura.

figura 2
Figura 2. Analisi Western Blot di SCAP N -glycosylation e livelli di proteina GFP-SCAP. A) Schema che mostra la struttura spanning SCAP attraversare la membrana ER. Ci sono tre asparagina (N) residui in SCAP, tutte risiedono nel lume ER e modificati da oligosaccaridi N-collegati. Il frammento di amminoacidi SCAP contenente 540-707 è resistente alla tripsina digestione. Esso contiene due porcili N-linked modifica oligosaccaridi, N590 e N641, che possono essere rilevati da anticorpi IgG-9D5 contro l'aa 540-707 di criceto SCAP da Western Blot B) Analisi Western Blot di SCAP N -glycosylation (superiore:. Con trattamento tripsina) o livelli di proteina GFP-SCAP (inferiore: nessun trattamento tripsina) a partire da cellule HEK293T transposi- zione ergonomica trasfettate con GFP-SCAP per 24 ore e poi coltivate in mezzi privi di siero con o senza glucosio (5 mM) in presenza o assenza di tunicamicina (1 ug / ml), un inibitore N -glycosylation, per 12 ore. I numeri sul lato sinistro del blot indicano il numero di siti -glycosylation N sulle proteine SCAP (siti N590 e N641) (superiore, rilevato da anticorpi IgG-9D5). Pannello inferiore per GFP-SCAP è stato rilevato da un anticorpo contro la proteina GFP. Questo dato è stato modificato con il permesso di 31. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. Rilevamento di SCAP Tratta dal pronto soccorso al Golgi. A, B) le immagini al microscopio confocale mostrano che GFP-SCAP risiede in un pronto soccorso o si sposta a tha Golgi in assenza o presenza di glucosio (5 mM) con / senza tunicamicina (1 ug / ml) trattamento in cellule U87 per 12 ore. PDI mostra ER colorazione (rosso) (A). Giantin, il marcatore Golgi (rosso) (B). DAPI (blu) colora il nucleo della cellula. Le barre di scala rappresentano 10 micron. Figura 3A è nuovi dati e non è stato pubblicato prima. Figura 3B è stata modificata con il permesso di 31. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

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In questo studio, si descrive un protocollo per l'isolamento di frazioni di membrana in cellule umane e per la preparazione dei campioni per l'individuazione di -glycosylation SCAP N e proteine totali mediante western blot. Forniamo inoltre un metodo per monitorare il traffico di SCAP utilizzando GFP-etichettatura e la microscopia confocale. Il metodo è specifico per analizzare proteina di membrana ed è uno strumento importante per indagare SCAP N -glycosylation e il traffico.

Rispetto al metodo che utilizza varie lectine di riconoscere diverse catene -glycan N e N identificare le proteine -glycosylated 42, il nostro metodo descritto qui utilizza PNGase F per eliminare la proteina-linked N -glycan e rileva il passaggio di migrazione per identificare la glicosilazione del frammento di proteina SCAP aa 540-707. La limitazione del metodo lectina dipende l'identificazione del tipo appropriato di lectina riconoscere la specifica N -glycosylation. Inoltre, il metodo può essere applicato anche per analizzare SCAP N -glycosylation e livello proteico in pazienti umani o tessuti animali dopo omogeneizzazione 2. Il nostro studio fornisce un nuovo strumento per analizzare la firma del metabolismo lipidico nelle malattie tumorali e metaboliche.

In questo studio, il plasmide di SCAP GFP-etichettata utilizzato per l'analisi di N -glycosylation e il traffico di cellule umane è criceto origine. Anticorpo SCAP (IgG-9D5) che viene sollevata contro gli amminoacidi 540-707 frammento della proteina SCAP può solo rilevare la proteina e N -glycosylation del SCAP criceto, come nel criceto cinese linea ovarico (CHO) cellule 15. L'anticorpo contro amminoacidi 450 - 500 SCAP umano è in grado di rilevare la proteina SCAP endogena in cellule umane, come mostrato in Figura 1 Per rilevare SCAP N -glyco.sylation in cellule o tessuti umani, abbiamo bisogno di sviluppare un anticorpo specifico contro gli aminoacidi 540-707 frammento di SCAP umana. Inoltre, l'identificazione di una lectina specifica per riconoscere SCAP-bound N -glycan è un modo alternativo per analizzare SCAP umana N -glycosylation 42. Inoltre, definendo la composizione e la struttura di ogni N catena -glycan vincolante SCAP (N263, N590 e N641) faciliterà la nostra comprensione dei meccanismi alla base della tratta SCAP dal pronto soccorso al Golgi.

Inoltre, per ottenere i migliori risultati per la rilevazione di SCAP N -glycosylation, abbiamo regolato alcuni parametri di reazione secondo le nostre condizioni sperimentali, che sono modificati dai metodi descritti nelle pubblicazioni del Brown e Goldstein Laboratorio 15. Per rilevare correttamente proteina SCAP e la sua -glycosylation N, la qualità delle frazioni di membrana ed estratti nucleari sono molto importanti. Abbiamo determinato direttamente la concentrazione proteica dopo le frazioni di membrana incubate a 37 ° C, evitare di mettere il campione indietro sul ghiaccio. Il metodo descritto qui può essere ampiamente applicata a diversi campi di ricerca, tra cui il cancro, le malattie cardiovascolari, il diabete e l'obesità.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent Roche 6366236001
Opti-MEMI medium Life Technologies 31985-070
trypsin  Sigma T6567
soybean trypsin inhibitor Sigma T9777
PNGase F  Sigma P7367
Anti-SCAP (9D5) antibody   Santa Cruz sc-13553
GFP antibody  Roche 11814460001
SREBP-1 antibody (IgG-2A4) BD Pharmingen 557036
PDI Antibody (H-17) Santa Cruz sc-30932
Lamin A Antibody (H-102) Santa Cruz sc-20680
SCAP antibody (a.a 450-500) Bethyl Laboratories, Inc. A303-554A
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) without glucose, pyruvate and glutamine   Cellgro 17-207-CV Add 1 mM Pyravate and 4 mM Glutamine before use
22 G x 1 1/2 needle BD 305156
pepstatin A Sigma P5318
leupeptin Sigma L2884
PMSF Sigma P7626
DTT Sigma 43819
ALLN Sigma A6185
Nitrocellulose membrane GE RPN3032D
EDTA Solution 0.5 M pH 8.5 100 ml VWR 82023-102
EGTA 0.5 M sterile (pH 8.0) 50 ml Fisher Scentific 50255956
HyClone FBS Thermo scientific SH3007103
glycerol Sigma G5516
β-mercaptoethanol  Sigma M3148
bromophenol blue Sigma B8026
prolong gold antifade reagent with dapi Life Technologies P36935
L-glutamine (200 mM) Life Technologies 25030081
sodium pyruvate Life Technologies 11360-070

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Analisi di SCAP<em&gt; N</em&gt; -glycosylation E il traffico nelle cellule umane
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Cheng, C., Guo, J. Y., Geng, F., Wu, X., Cheng, X., Li, Q., Guo, D. Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells. J. Vis. Exp. (117), e54709, doi:10.3791/54709 (2016).More

Cheng, C., Guo, J. Y., Geng, F., Wu, X., Cheng, X., Li, Q., Guo, D. Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells. J. Vis. Exp. (117), e54709, doi:10.3791/54709 (2016).

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