Summary
نحن تصف طريقة تعديل لعزل غشاء جزء من الخلايا البشرية وإعداد العينات للكشف عن -glycosylation سكاب N والبروتين الكلي باستخدام طخة غربية. علينا مواصلة إدخال طريقة GFP وضع العلامات لمراقبة الاتجار سكاب باستخدام متحد البؤر المجهري. هذا البروتوكول يمكن استخدامها في مختبرات البيولوجيا العادية.
Introduction
تحرير ايض الدهون هو سمة مشتركة من السرطان وأمراض التمثيل الغذائي 1-6. في هذه العمليات، ستيرول البروتينات التنظيمية ملزم عنصر (SREBPs)، وهي عائلة من عوامل النسخ، تلعب دورا حاسما في السيطرة على التعبير عن الجينات مهمة لامتصاص وتركيب الكولسترول والأحماض الدهنية، والدهون الفوسفاتية 7-10.
SREBPs، بما في ذلك SREBP-1A، SREBP-1C، وSREBP-2، ويتم تخليق كما السلائف الخاملة التي تربط لغشاء الشبكة الإندوبلازمية (أوروبا) بحكم اثنين من المجالات عبر الغشاء 7. وN-محطة من SREBPs تحتوي مجال الحمض النووي ملزم للtransactivation من الجينات المستهدفة 11. سي محطة السلائف SREBP بربط SREBP البروتين تفعيل الانقسام (سكاب) 12،13، وهو بروتين غشاء polytopic التي تلعب دورا محوريا في تنظيم الاستقرار SREBP وتفعيل 14-16.
وimplemenالكساء وظيفة النسخي يتطلب النبات من مجمع سكاب / SREBP من لائحة لجولجي، حيث اثنين من البروتياز بالتتابع يلتصق SREBP والافراج عن جزء-N محطة، والذي يدخل بعد ذلك في نواة لtransactivation الجينات اكتناز الشحم 7. في هذه العمليات، ومستويات الجامدة في الغشاء ER السيطرة على الخروج من المجمع سكاب / SREBP من لائحة 7،17. في ظل ظروف ستيرول عالية، ستيرول بربط سكاب أو-ER المقيمين الانسولين التي يسببها الجين البروتين 1 (Insig-1) أو -2 (Insig-2)، وتعزيز ارتباط SCAP مع Insigs التي تحتفظ مجمع سكاب / SREBP في ER 18-20. عندما تنخفض مستويات ستيرول، SCAP تنأى مع Insigs. وهذا يؤدي إلى تغيير متعلق بتكوين سكاب، والذي يسمح التفاعل SCAP مع بروتينات الغلاف المشتركة (COP) II معقدة. مجمع يتوسط تأسيس مجمع سكاب / SREBP إلى الحويصلات في مهدها ويوجه انتقاله من لائحة لجولجي 21،22. على translocأوجه لجولجي، والمشقوق SREBPs بالتسلسل الموقع 1 والموقع-2 البروتياز، مما أدى إلى الإفراج عن N-محطة 7،23-29.
البروتين سكاب يحمل ثلاثة N -linked يغوساكاريدس في الهليونين (N) مواقف N263، N590، N641 و15. نحن كشفت مؤخرا أن بوساطة الجلوكوز N -glycosylation من سكاب في هذه المواقع هو شرط مسبق لتهريب سكاب / SREBP من لائحة لجولجي في ظل ظروف ستيرول منخفضة 30-32. فقدان بالغليكوزيل سكاب عبر تحور كل الهليونين ثلاثة إلى الجلوتامين (NNN إلى QQQ) تعطيل الاتجار من سكاب / مجمع SREBP والنتائج في عدم الاستقرار من البروتين سكاب والحد من تفعيل SREBP 31. أيضا تظهر لدينا بيانات حديثة أن SREBP-1 تفعيلها بشكل كبير في الإصابة بالورم الأرومي الدبقي وينظمها سكاب N -glycosylation 4،31،33،34. استهداف سكاب / SREBP-1 الإشارات يبرز بوصفه استراتيجية جديدة لعلاج الأورام الخبيثة والصورة الأيضyndromes 1،3،35-38. وبالتالي، فمن المهم تطوير وسيلة فعالة لتحليل مستويات البروتين سكاب وN -glycosylation ومراقبة الاتجار في خلايا وأنسجة جسم الإنسان المريض.
المنطقة اللمعية من البروتين سكاب (الأحماض الأمينية 540-707) في لائحة تحتوي على موقعين -glycosylation N (N590 وN641) التي يتم حمايتها من التحلل البروتيني عندما يتم التعامل مع الأغشية سليمة مع التربسين 15. هذا جزء اللمعية لها وزنها الجزيئي ~ 30 كيلو دالتون التي هي صغيرة بما يكفي للسماح للقرار من المتغيرات الغليكوزيلاتي الفردية سكاب من الصوديوم دوديسيل هلام كبريتات بولي أكريلاميد الكهربائي (SDS-PAGE) 15،31. هنا، ونحن نقدم وسيلة للكشف عن N -glycosylation من سكاب والبروتين الكلي في الخلايا البشرية. ويستمد هذا البروتوكول من الطريقة الموصوفة في المنشورات من براون وغولدشتاين المختبر 15 و لدينا نشر مؤخرا 31. بروتوكول يمكن استخدامها في تيانه دراسة من البروتين سكاب من خلايا الثدييات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. البروتين الكشف عن الذاتية سكاب في الخلايا البشرية
- ثقافة الخلية والعلاج
- خلايا البذور ~ 1 × 10 6 U87 في صحن 10 سم مع Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM) تستكمل مع 5٪ مصل بقري جنيني (FBS) واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 24 ساعة قبل العلاج.
- غسل خلايا مرة واحدة مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، ثم تبديل الخلايا المتوسطة DMEM جديدة مع أو بدون الجلوكوز (5 ملم) لمدة 12 ساعة.
- إعداد خلية غشاء الكسور والنووية مقتطفات
- غسل الخلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني، تتخلص في 1 مل برنامج تلفزيوني، وأجهزة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
- Resuspend الخلايا في وجود مخزن مؤقت الجليد الباردة التي تحتوي على 10 ملي HEPES-KOH (الرقم الهيدروجيني 7.6)، 10 ملي بوكل، 1.5 ملي MgCl 2، 1 ملم الصوديوم ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA)، 1 ملم حمض الإثيلين الصوديوم غليكول tetraacetic (EGTA)، 250 مم السكروز، وخليط من مثبطات الأنزيم البروتيني (5 μز / مل pepstatin A، 10 ميكروغرام / مل leupeptin، 0.5 ملي phenylmethylsulfonyl فلوريد (PMSF)، 1 ملم dithiothreitol (DTT)، و 25 ميكروغرام / مل N-أسيتيل-لوي-لوي-Norleu-آخرون (ALLN)) لمدة 30 دقيقة على الجليد.
- تمرير مستخلصات الخلية من خلال 22 G × 1 1/2 إبرة 30 مرات وأجهزة الطرد المركزي في 890 x ج في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لعزل النوى.
- استخدام طاف للفصل بين كسور غشاء (الخطوة 1.2.7). resuspend الكرية النووي في 0.1 مل من العازلة C (20 ملي HEPES / كوه الرقم الهيدروجيني 7.6، 0.42 م كلوريد الصوديوم، 2.5٪ (ت / ت) الجلسرين، 1.5 ملي MgCl 2، 1 ملم EDTA الصوديوم، 1 ملم EGTA الصوديوم وخليط من مثبطات الأنزيم البروتيني (5 ميكروغرام / مل pepstatin A، 10 ميكروغرام / مل leupeptin، 0.5 ملي PMSF، 1 ملم DTT، و 25 ميكروغرام / مل ALLN)).
- تدوير تعليق في 4 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة، وأجهزة الطرد المركزي في 20000 x ج في microcentrifuge لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية. يعين طاف ب "مقتطفات النووية".
- تسخين مقتطفات النووية عند 100 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة مع العازلة 5X تحميل (312.5 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 6.8، و 10٪ SDS، 50٪ الجلسرين، 12.5٪ β-المركابتويثانول، و 0.05٪ برموفينول الأزرق) قبل إخضاع إلى SDS-PAGE.
- أجهزة الطرد المركزي لطاف من الأصلي تدور 890 x ج في 20000 x ج لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية. للتحليل لطخة غربية لاحق، حل بيليه في 0.1 مل من العازلة SDS تحلل (10 ملم تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 6.8، 100 مم كلوريد الصوديوم، 1٪ (ت / ت) كبريتات الصوديوم دوديسيل (SDS)، 1 ملم EDTA الصوديوم، و1 ملي EGTA الصوديوم). يتم تعيين هذا "جزء غشاء".
ملاحظة: نحن نستخدم 20000 x ج لمدة 20 دقيقة لتكوير الأغشية. وقد تم استخدام 20 دقيقة في الصحف من براون وغولدشتاين المختبر 15 - 100000 x ج لمدة 10. - احتضان جزء الغشاء عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، وتحديد تركيز البروتين برادفورد البروتين الفحص. إضافة 1 ميكرولتر برموفينول 100X حل الأزرق قبل إخضاع العينات إلى SDS-PAGE.
- الحمل 25-50 ميكروغرام من البروتين الكلي غشاء على 10٪ هلام SDS-PAGE 39. تشغيل هلامفي 80 V لمدة 15 دقيقة، ثم قم بتغيير إلى 130 V وتشغيل 115 دقيقة أخرى. نقل في 140 مللي أمبير لمدة 130 دقيقة 39.
- لتحليل النشاف الغربي، استخدم مكافحة سكاب الأجسام المضادة للكشف عن البروتين الكلي سكاب. استخدام إيزوميراز بروتين ثاني كبريتيد (PDI)، وهو بروتين-ER مقيم 40، والرقابة الداخلية. استخدام مكافحة SREBP-1 الأجسام المضادة للكشف عن فرقة N-الطرفية من SREBP-1. استخدام امين وباعتبارها الرقابة الداخلية لمقتطفات النووية 31.
2. -glycosylation تحليل سكاب N في الخلايا البشرية
- ثقافة الخلية، ترنسفكأيشن، والعلاج
- لتحليل الغشاء، وخلايا البذور ~ 1 × 10 6 HEK293T في صحن 10 سم مع DMEM تستكمل مع 5٪ FBS واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 24 ساعة قبل ترنسفكأيشن.
- تمييع 4-8 ميكروغرام GFP-سكاب البلازميد (هدية من الدكتور بيتر Espenshade) 22 في 1 مل خفض سيرم وتخلط بلطف.
- إضافة 8-16 ميكرولتر الحمض النووي كاشف ترنسفكأيشن من قبل pipetting مباشرة في 1 مل خفض سيرم التي تحتوي على البلازميدات وتخلط بلطف.
- احتضان ترنسفكأيشن الكاشف / البلازميد المجمع لمدة 25 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- إضافة مجمع ترنسفكأيشن إلى الخلايا مع المتوسط الطازجة والاستمرار في ثقافة لمدة 24 ساعة على 5٪ CO 2 و 37 درجة مئوية.
- يغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني وعلاج الخلايا لمدة 12 ساعة مع أو بدون الجلوكوز (5 ملم) في وجود أو عدم وجود tunicamycin (1 ميكروغرام / مل)، مثبط N -glycosylation.
- إعداد الكريات غشاء الخلية كما هو موضح في الخطوات 1.2.1، 1.2.2، 1.2.3، 1.2.7 و.
- الكشف عن سكاب N -glycosylation
- التربسين التحلل البروتيني
- Resuspend والكريات الغشاء من خلايا overexpressing GFP-سكاب في 114 ميكرولتر من العازلة التي تحتوي على 10 ملي HEPES · KOH (7.4 درجة الحموضة)، و 10 ملي بوكل، 1.5 ملي MgCl 2، 1 ملم EDTA الصوديوم، وكلوريد الصوديوم 100 ملم.
- احتضان 57قسامات لتر من بروتينات الغشاء في وجود أو غياب من 1 ميكرولتر من التربسين (1 ميكروغرام / ميكرولتر)، في الحجم الإجمالي من 58 ميكرولتر، لمدة 30 دقيقة عند 30 درجة مئوية؛ 81.
- وقف ردود الفعل من خلال إضافة 2 ميكرولتر (400 وحدة) من مثبط التربسين فول الصويا.
- Deglycosylation التي كتبها Peptide- N- غليكوزيداز F (PNGase F)
- لمعالجة لاحقة مع PNGase F، إضافة 10 ميكرولتر من محلول يحتوي على 3.5٪ (وزن / المجلد) SDS و 7٪ (المجلد / المجلد) 2-المركابتويثانول لكل عينة.
- بعد التسخين على 100 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، بالتتابع إضافة 7 ميكرولتر من 0.5 M فوسفات الصوديوم (7.5 درجة الحموضة)، و 7 ميكرولتر من 10٪ (ت / ت) Nonidet P-40 مع 12 × مثبطات الأنزيم البروتيني، و 2 ميكرولتر (0.5 U / ميكرولتر) من PNGase F.
- بعد مرور فترة الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات، ووقف ردود الفعل من خلال إضافة العازلة 5X تحميل (312.5 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 6.8، و 10٪ SDS، 50٪ الجلسرين، 12.5٪ β-المركابتويثانول، و 0.05٪ برموفينول الأزرق). تسخين خليط عند 100 درجة مئوية لمدة 10 مفي وتخضع لSDS-PAGE. الحمل 25-50 ميكروغرام من البروتين الكلي غشاء على 10٪ هلام SDS-PAGE 39. تشغيل هلام في 80 فولت لمدة 15 دقيقة، ثم قم بتغيير إلى 130 V 115 دقيقة أخرى. نقل في 140 مللي أمبير لمدة 130 دقيقة.
- لطخة غربية، استخدم 10 ميكروغرام / مل مكافحة سكاب (9D5) الأجسام المضادة للكشف عن N -glycosylation والبروتين الكلي سكاب.
- التربسين التحلل البروتيني
3. الكشف عن سكاب الاتجار من ER إلى جولجي باستخدام GFP-سكاب في الخلايا البشرية
- البذور 2.5 × 10 5 خلايا U87 في صحن 60 ملم مع DMEM تستكمل مع 5٪ FBS واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 24 ساعة قبل ترنسفكأيشن.
- تمييع 4 ميكروغرام GFP-سكاب البلازميد في 0.5 مل خفض سيرم وتخلط.
- إضافة 8 ميكرولتر الحمض النووي كاشف ترنسفكأيشن من قبل pipetting مباشرة إلى 0.5 مل خفض سيرم التي تحتوي على البلازميدات وتخلط بلطف.
- احتضان ترنسفكأيشن الكاشف / البلازميد المجمع لمدة 25 دقيقة في غرفةدرجة الحرارة.
- إضافة مجمع ترنسفكأيشن إلى الخلايا مع المتوسط الطازجة والاستمرار في ثقافة لمدة 24 ساعة على 5٪ CO 2 و 37 درجة مئوية.
- RESEED 5-10 × 10 4 خلايا في لوحة 6 جيدا تحتوي على زلة غطاء زجاجي (22 ملم × 22 ملم) والاستمرار في الثقافة عند 37 درجة مئوية وCO 2 5٪ لمدة 24 ساعة.
- يغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني وعلاج الخلايا لمدة 12 ساعة مع أو بدون الجلوكوز (5 ملم) في وجود أو عدم وجود tunicamycin (1 ميكروغرام / مل).
- غسل خلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني والإصلاح في 4٪ الفورمالديهايد لمدة 10 دقيقة.
- غسل خلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني، عكس لل coverslips، جبل على الشرائح جنبا إلى جنب مع antifade الكاشف، وختم لل coverslips باستخدام طلاء الأظافر.
- تحقق الاتجار GFP-سكاب باستخدام الهدف الغمر النفط 63X في المسح الضوئي ليزر متحد البؤر المجهر 41.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويبين الشكل 1 الكشف عن البروتين سكاب الذاتية وشكل النووي SREBP-1 في خلايا ورم أرومي U87 الإنسان ردا على الجلوكوز التحفيز باستخدام طخة غربية. يتم الكشف عن سكاب بروتين الغشاء في "جزء غشاء". تم الكشف عن شكل النواة (N-النهائي) من SREBP-1 في "مقتطفات النووية". مستوى البروتين سكاب (PDI بمثابة الرقابة الداخلية للبروتينات غشاء ER) وشكل النووي SREBP-1 تتعزز بشكل ملحوظ عن طريق تحفيز الجلوكوز. وتبين هذه النتائج أن البروتوكول هو قادرة على الكشف عن البروتين سكاب الذاتية في الخلايا البشرية.
ويبين الشكل 2 تحليل -glycosylation سكاب N ومجموع مستويات البروتين GFP-سكاب ردا على الجلوكوز التحفيز والعلاج tunicamycin في الخلايا HEK293T معربا عن GFP المسمى الهامستر سكاب. الشكل
ويبين الشكل 3 أن الاتجار GFP-سكاب من لائحة لجولجي ردا على الجلوكوز التحفيز قمعت عن طريق العلاج tunicamycin في الخلايا U87. كما هو مبين في الشكل 3A، تظهر صور المجهر مبائر أن بروتين GFP-سكاب يقيم في لائحة في حالة عدم وجود الجلوكوز، كما هو مبين من قبل الجهات المشاركة في توطين مع PDI، و-ER المقيمين البروتين (الحمراء). في المقابل، في وجود الجلوكوز، يتحرك GFP-سكاب لجولجي، يتضح من شارك في التعريب مع جولجي البروتين علامة Giantin (أحمر) (الشكل 3B). وعلاوة على ذلك، tunicamycinالعلاج قمع الاتجار الناجم عن الجلوكوز من GFP-سكاب من لائحة لجولجي (الشكل 3A وباء).
الشكل 1. الكشف عن البروتين الذاتية سكاب وSREBP-1 نموذج النووية في خلايا U87. تحليل لطخة غربية من الغشاء ومقتطفات النووية من ورم أرومي الأساسي الخلايا U87 البشرية المستزرعة في وسائل الإعلام خالية من المصل مع أو بدون الجلوكوز (5 ملم) لمدة 12 ساعة. تم استخدام 500 للكشف عن سكاب الذاتية في الخلايا البشرية - مكافحة سكاب الأجسام المضادة ضد سكاب أأ البشري 450. تم الكشف عن النموذج النشط (N-النهائي) من SREBP-1 في "مقتطفات النووية" باستخدام الأجسام المضادة ضد أأ 301-407 جزء من SREBP-1 البشري. تم تعديل هذا الرقم بإذن من 31. الرجاء انقر هنا لعرض أكبر فيرسيعلى هذا الرقم.
الشكل 2. الغربية تحليل وصمة عار من سكاب N -glycosylation وGFP-سكاب مستويات البروتين. أ) رسم تخطيطي يظهر سكاب هيكل الممتدة عبر الغشاء ER. هناك ثلاثة الهليونين (N) المخلفات في سكاب، والتي تتواجد في التجويف ER ويتم تعديلها بواسطة يغوساكاريدس المرتبطة N. جزء من سكاب التي تحتوي على الأحماض الأمينية 540-707 مقاوم للهضم التربسين. أنه يحتوي على اثنين من sties N-ترتبط قليل السكاريد تعديل، N590 وN641، والتي يمكن الكشف عنها من قبل مفتش-9D5 الأجسام المضادة ضد أأ 540-707 من سكاب الهامستر التي كتبها الغربي لطخة ب) تحليل لطخة غربية من سكاب N -glycosylation (العلوي: مع العلاج التربسين) أو مستويات البروتين GFP-سكاب (أقل: لا يوجد علاج التربسين) من خلايا HEK293T العابرةtransfected iently مع GFP-سكاب لمدة 24 ساعة وبعد ذلك المثقف في وسائل الإعلام الحرة المصل مع أو بدون الجلوكوز (5 ملم) في وجود أو عدم وجود tunicamycin (1 ميكروغرام / مل)، مثبط N -glycosylation، لمدة 12 ساعة. الأرقام على الجانب الأيسر من وصمة عار تشير إلى عدد من المواقع -glycosylation N على البروتين سكاب (مواقع N590 وN641) (العلوي، الكشف عنها من قبل مفتش-9D5 الأجسام المضادة). تم الكشف عن اللوحة السفلى للGFP-سكاب من الأجسام المضادة ضد بروتين GFP. تم تعديل هذا الرقم بإذن من 31. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. الكشف عن الاتجار سكاب من لائحة لجولجي. A، B) تظهر الصور المجهري متحد البؤر التي GFP-سكاب يقيم في لائحة أو ينتقل إلى tانه جولجي في غياب أو وجود الجلوكوز (5 ملم) مع / بدون tunicamycin (1 ميكروغرام / مل) العلاج في الخلايا U87 لمدة 12 ساعة. يظهر PDI تلطيخ ER (أحمر) (A). Giantin، علامة جولجي (أحمر) (B). دابي (الأزرق) البقع نواة الخلية. تمثل الحانات نطاق 10 ميكرون. الشكل 3A هو البيانات الجديدة ولم تنشر من قبل. وقد تم الشكل 3B تعديل بإذن من 31. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذه الدراسة، ونحن تصف بروتوكول لعزل أجزاء الغشاء في الخلايا البشرية ولإعداد العينات للكشف عن -glycosylation سكاب N والبروتين الكلي باستخدام طخة غربية. علينا مواصلة توفير طريقة لمراقبة الاتجار سكاب باستخدام GFP وضع العلامات والفحص المجهري متحد البؤر. يتم استخدام الأسلوب خصيصا لتحليل البروتين الغشاء وأداة هامة لتحقيق سكاب N -glycosylation والاتجار.
مقارنة مع طريقة استخدام يكتينس مختلفة للاعتراف مختلفة N سلاسل -glycan وتحديد N البروتينات -glycosylated 42، أسلوبنا هو موضح هنا يستخدم PNGase F لإزالة البروتين مرتبط N -glycan وبالكشف عن تحول الهجرة إلى تحديد بالغليكوزيل من سكاب البروتين شظية أأ 540-707. الحد من طريقة كتين يتوقف على تحديد النوع المناسب من كتين الاعتراف محددة
في هذه الدراسة، البلازميد من سكاب GFP المسمى المستخدمة لتحليل N -glycosylation والاتجار في الخلايا البشرية هو الهامستر الأصل. سكاب الأجسام المضادة (مفتش-9D5) التي أثيرت ضد الأحماض الأمينية 540-707 جزء من البروتين سكاب يمكن فقط الكشف عن البروتين وN -glycosylation من سكاب الهامستر، مثل الهامستر الصيني المبيض الخط (CHO) خلية 15. الأجسام المضادة ضد الأحماض الأمينية 450-500 من سكاب البشري قادر على الكشف عن البروتين سكاب الذاتية في الخلايا البشرية، كما هو مبين في الشكل رقم 1 للكشف عن سكاب N -glyco.sylation في الخلايا البشرية أو الأنسجة، ونحن بحاجة لتطوير الأجسام المضادة المحددة ضد الأحماض الأمينية 540-707 جزء من سكاب البشري. وبالإضافة إلى ذلك، التعرف على كتين محددة للاعتراف N -glycan محددة سكاب هو وسيلة بديلة لتحليل سكاب البشري N -glycosylation 42. وعلاوة على ذلك، وتحديد تكوين وبنية كل سلسلة -glycan N ملزمة في سكاب (N263، N590 وN641) سوف يسهل فهمنا لآلية الكامنة وراء الاتجار سكاب من لائحة لجولجي.
وعلاوة على ذلك، للحصول على أفضل النتائج للكشف عن سكاب N -glycosylation، فإننا تعديل بعض المعلمات رد فعل وفقا لظروف تجريبية لدينا، والتي يتم تعديلها من الطرق الموضحة في المطبوعات من براون وغولدشتاين مختبر 15 و. للكشف عن البروتين بنجاح سكاب و-glycosylation N لها، ونوعية من الكسور الغشاء ومقتطفات النووية مهمة جدا. نحن مصممون مباشرة تركيز البروتين بعد الكسور غشاء المحتضنة في 37 درجة مئوية، وتجنب وضع العينة مرة أخرى على الجليد. الطريقة الموصوفة هنا يمكن تطبيقها على نطاق واسع في مجالات مختلفة في البحوث، بما في ذلك السرطان وأمراض القلب والأوعية الدموية، والسكري، والسمنة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent | Roche | 6366236001 | |
| Opti-MEMI medium | Life Technologies | 31985-070 | |
| trypsin | Sigma | T6567 | |
| soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9777 | |
| PNGase F | Sigma | P7367 | |
| Anti-SCAP (9D5) antibody | Santa Cruz | sc-13553 | |
| GFP antibody | Roche | 11814460001 | |
| SREBP-1 antibody (IgG-2A4) | BD Pharmingen | 557036 | |
| PDI Antibody (H-17) | Santa Cruz | sc-30932 | |
| Lamin A Antibody (H-102) | Santa Cruz | sc-20680 | |
| SCAP antibody (a.a 450-500) | Bethyl Laboratories, Inc. | A303-554A | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) without glucose, pyruvate and glutamine | Cellgro | 17-207-CV | Add 1 mM Pyravate and 4 mM Glutamine before use |
| 22 G x 1 1/2 needle | BD | 305156 | |
| pepstatin A | Sigma | P5318 | |
| leupeptin | Sigma | L2884 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| DTT | Sigma | 43819 | |
| ALLN | Sigma | A6185 | |
| Nitrocellulose membrane | GE | RPN3032D | |
| EDTA Solution 0.5 M pH 8.5 100 ml | VWR | 82023-102 | |
| EGTA 0.5 M sterile (pH 8.0) 50 ml | Fisher Scentific | 50255956 | |
| HyClone FBS | Thermo scientific | SH3007103 | |
| glycerol | Sigma | G5516 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| bromophenol blue | Sigma | B8026 | |
| prolong gold antifade reagent with dapi | Life Technologies | P36935 | |
| L-glutamine (200 mM) | Life Technologies | 25030081 | |
| sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 |
References
- Ru, P., Williams, T. M., Chakravarti, A., Guo, D. Tumor metabolism of malignant gliomas. Cancers (Basel). 5, 1469-1484 (2013).
- Moon, Y. A., et al. The Scap/SREBP pathway is essential for developing diabetic fatty liver and carbohydrate-induced hypertriglyceridemia in animals. Cell metabolism. 15, 240-246 (2012).
- Guo, D., Bell, E. H., Chakravarti, A. Lipid metabolism emerges as a promising target for malignant glioma therapy. CNS Oncology. 2, 289-299 (2013).
- Guo, D., et al. The AMPK agonist AICAR inhibits the growth of EGFRvIII-expressing glioblastomas by inhibiting lipogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 12932-12937 (2009).
- Menendez, J. A., Lupu, R. Fatty acid synthase and the lipogenic phenotype in cancer pathogenesis. Nat Rev Cancer. 7, 763-777 (2007).
- Guo, D., Cloughesy, T. F., Radu, C. G., Mischel, P. S. AMPK: A metabolic checkpoint that regulates the growth of EGFR activated glioblastomas. Cell Cycle. 9, 211-212 (2010).
- Goldstein, J. L., DeBose-Boyd, R. A., Brown, M. S. Protein sensors for membrane sterols. Cell. 124, 35-46 (2006).
- Shao, W., Espenshade, P. J. Expanding Roles for SREBP in Metabolism. Cell metabolism. 16, 414-419 (2012).
- Nohturfft, A., Zhang, S. C. Coordination of lipid metabolism in membrane biogenesis. Annual review of cell and developmental biology. 25, 539-566 (2009).
- Jeon, T. I., Osborne, T. F. SREBPs: metabolic integrators in physiology and metabolism. Trends in endocrinology and metabolism: TEM. 23, 65-72 (2012).
- Sato, R., et al. Assignment of the membrane attachment, DNA binding, and transcriptional activation domains of sterol regulatory element-binding protein-1 (SREBP-1). The Journal of biological chemistry. 269, 17267-17273 (1994).
- Sakai, J., Nohturfft, A., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Cleavage of sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs) at site-1 requires interaction with SREBP cleavage-activating protein. Evidence from in vivo competition studies. The Journal of biological chemistry. 273, 5785-5793 (1998).
- Sakai, J., et al. Identification of complexes between the COOH-terminal domains of sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs) and SREBP cleavage-activating protein. The Journal of biological chemistry. 272, 20213-20221 (1997).
- Hua, X., Nohturfft, A., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Sterol resistance in CHO cells traced to point mutation in SREBP cleavage-activating protein. Cell. 87, 415-426 (1996).
- Nohturfft, A., Brown, M. S., Goldstein, J. L. Topology of SREBP cleavage-activating protein, a polytopic membrane protein with a sterol-sensing domain. The Journal of biological chemistry. 273, 17243-17250 (1998).
- Nohturfft, A., Hua, X., Brown, M. S., Goldstein, J. L. Recurrent G-to-A substitution in a single codon of SREBP cleavage-activating protein causes sterol resistance in three mutant Chinese hamster ovary cell lines. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 13709-13714 (1996).
- Espenshade, P. J., Hughes, A. L. Regulation of sterol synthesis in eukaryotes. Annu Rev Genet. 41, 401-427 (2007).
- Yang, T., et al. Crucial step in cholesterol homeostasis: sterols promote binding of SCAP to INSIG-1, a membrane protein that facilitates retention of SREBPs in ER. Cell. 110, 489-500 (2002).
- Yabe, D., Brown, M. S., Goldstein, J. L. Insig-2, a second endoplasmic reticulum protein that binds SCAP and blocks export of sterol regulatory element-binding proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 12753-12758 (2002).
- Yabe, D., Xia, Z. P., Adams, C. M., Rawson, R. B. Three mutations in sterol-sensing domain of SCAP block interaction with insig and render SREBP cleavage insensitive to sterols. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 16672-16677 (2002).
- Espenshade, P. J., Li, W. P., Yabe, D. Sterols block binding of COPII proteins to SCAP, thereby controlling SCAP sorting in ER. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11694-11699 (2002).
- Nohturfft, A., Yabe, D., Goldstein, J. L., Brown, M. S., Espenshade, P. J. Regulated step in cholesterol feedback localized to budding of SCAP from ER membranes. Cell. 102, 315-323 (2000).
- Sakai, J., et al. Sterol-regulated release of SREBP-2 from cell membranes requires two sequential cleavages, one within a transmembrane segment. Cell. 85, 1037-1046 (1996).
- Wang, X., Sato, R., Brown, M. S., Hua, X., Goldstein, J. L. SREBP-1, a membrane-bound transcription factor released by sterol-regulated proteolysis. Cell. 77, 53-62 (1994).
- Brown, M. S., Goldstein, J. L. A proteolytic pathway that controls the cholesterol content of membranes, cells, and blood. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 11041-11048 (1999).
- Rawson, R. B., DeBose-Boyd, R., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Failure to cleave sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs) causes cholesterol auxotrophy in Chinese hamster ovary cells with genetic absence of SREBP cleavage-activating protein. J Biol Chem. 274, 28549-28556 (1999).
- Zelenski, N. G., Rawson, R. B., Brown, M. S., Goldstein, J. L. Membrane topology of S2P, a protein required for intramembranous cleavage of sterol regulatory element-binding proteins. J Biol Chem. 274, 21973-21980 (1999).
- Goldstein, J. L., Brown, M. S. A Century of Cholesterol and Coronaries: From Plaques to Genes to Statins. Cell. 161, 161-172 (2015).
- Espenshade, P. J., Cheng, D., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Autocatalytic processing of site-1 protease removes propeptide and permits cleavage of sterol regulatory element-binding proteins. The Journal of biological chemistry. 274, 22795-22804 (1999).
- Guo, D. SCAP links glucose to lipid metabolism in cancer cells. Mol Cell Oncol. 3, (2016).
- Cheng, C., et al. Glucose-Mediated N-glycosylation of SCAP Is Essential for SREBP-1 Activation and Tumor Growth. Cancer Cell. 28, 569-581 (2015).
- Shao, W., Espenshade, P. J. Sugar Makes Fat by Talking to SCAP. Cancer Cell. 28, 548-549 (2015).
- Guo, D., et al. EGFR signaling through an Akt-SREBP-1-dependent, rapamycin-resistant pathway sensitizes glioblastomas to antilipogenic therapy. Sci Signal. 2, 82 (2009).
- Guo, D., et al. An LXR agonist promotes GBM cell death through inhibition of an EGFR/AKT/SREBP-1/LDLR-dependent pathway. Cancer Discov. 1, 442-456 (2011).
- Guo, D., Bell, E. H., Mischel, P., Chakravarti, A. Targeting SREBP-1-driven lipid metabolism to treat cancer. Curr Pharm Des. 20, 2619-2626 (2014).
- Bell, E. H., Guo, D. Biomarkers for malignant gliomas. Malignant Gliomas, Radiation Medicine Rounds. 3, 339-357 (2012).
- Geng, F., et al. Inhibition of SOAT1 suppresses glioblastoma growth via blocking SREBP-1-mediated lipogenesis. Clin Cancer Res. , (2016).
- Ru, P., et al. Feedback Loop Regulation of SCAP/SREBP-1 by miR-29 Modulates EGFR Signaling-Driven Glioblastoma Growth. Cell Rep. , (2016).
- Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition). , (2012).
- Uehara, T., et al. S-nitrosylated protein-disulphide isomerase links protein misfolding to neurodegeneration. Nature. 441, 513-517 (2006).
- Miyashita, T. Confocal microscopy for intracellular co-localization of proteins. Methods Mol Biol. 1278, 515-526 (2015).
- Cao, J., Guo, S., Arai, K., Lo, E. H., Ning, M. Studying extracellular signaling utilizing a glycoproteomic approach: lectin blot surveys, a first and important step. Methods Mol Biol. 1013, 227-233 (2013).
