Summary
我们通过使用蛋白质印迹描述了从人类细胞的膜级分的分离和样品制备用于检测SCAPÑ-glycosylation和总蛋白的改进方法。我们还引进了GFP标记法使用共聚焦显微镜监测SCAP贩卖。这种协议可以在常规生物学实验室使用。
Introduction
脂质代谢的失调是癌症和代谢性疾病1-6的一个共同特点。在这些方法中，固醇调节元件结合蛋白（SREBPs），一个家族的转录因子，在控制基因的摄取和胆固醇，脂肪酸的合成，和磷脂7-10重要的表达中起关键作用。
SREBPs，包括SREBP-1a中，SREBP-1c和SREBP-2，合成为凭借两个跨膜结构域7的结合于内质网（ER）膜活性的前体。 SREBPs的N-末端包含靶基因11的转录的DNA结合结构域。 SREBP前体的C末端结合至SREBP裂解激活蛋白（SCAP）12,13，即起着SREBP稳定性和活化14-16的调节中发挥关键作用一个多面体膜蛋白。
该implemen转录功能的塔季翁需要从ER到高尔基体，其中两个蛋白酶顺序裂解SREBP并释放其N-末端片段，然后进入细胞核为生脂基因7的反式激活的SCAP / SREBP复合物的转运。在这些过程中，甾醇的在ER膜的水平从ER 7,17控制SCAP / SREBP复合物的出口。下高固醇的条件下，固醇结合SCAP或ER驻留胰岛素诱导的基因蛋白-1（INSIG-1）或-2（INSIG-2），从而增强与保留SCAP / SREBP复杂的Insigs SCAP的关联ER 18-20。当固醇水平降低，SCAP解离与Insigs。这导致了SCAP构象变化，这允许具有共同的外壳蛋白（COP）的二复杂SCAP相互作用。复合介导SCAP / SREBP复合物的掺入出芽囊泡和从ER到高尔基体21,22指示其传输。当transloc通货膨胀到高尔基体，SREBPs依次由站点1和站点2蛋白酶裂解，导致N末端7,23-29的释放。
SCAP蛋白携带三个N天冬酰胺-连接低聚糖（N）位置N263，N590，N641和15。最近，我们发现，在这些网站SCAP的葡萄糖介导ñ-glycosylation是从低固醇条件下30-32内质网向高尔基SCAP / SREBP贩卖的先决条件。通过以谷氨酰胺（NNN到QQQ）所有三个天冬酰胺的突变SCAP糖基化的损失禁用SCAP / SREBP复杂并且导致SCAP蛋白和减少SREBP活化31的不稳定的贩卖。我们最近的数据还表明，SREBP-1在胶质母细胞瘤是高度激活和SCAPñ-glycosylation 4,31,33,34调节。针对SCAP / SREBP-1信号正在成为一个新的战略来治疗恶性肿瘤和代谢小号yndromes 1,3,35-38。因此，开发以分析SCAP蛋白和N -glycosylation水平和监测其在人类细胞和患者组织贩卖一种有效的方法是重要的。
SCAP蛋白质（氨基酸540-707）在ER腔区域包含了保护，当蛋白水解胎膜与胰蛋白酶处理15两个N -glycosylation网站（N590和N641）。这个管腔片段的分子量〜30kDa的的足够小，以允许通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）15,31的SCAP的个别糖基化变体的分辨率。这里，我们提供了用于检测SCAP 氮 -glycosylation和人类细胞中的总蛋白的方法。此协议是从由布朗和戈尔茨坦实验室15和我们最近出版31出版物中描述的方法的。该协议可以在T使用他从哺乳动物细胞SCAP蛋白的研究。
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Protocol
1.内源性的检测SCAP蛋白在人类细胞中
- 细胞培养和治疗
- 在10cm皿用Dulbecco补充有5％胎牛血清（FBS）的改良Eagle培养基（DMEM）种子〜1×10 6个 U87细胞和孵育所述细胞在37℃和5％CO 2的处理前24小时。
- 用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗一次细胞，然后切换细胞新鲜DMEM培养基有或没有葡萄糖（5毫米）12小时。
- 细胞膜组份和核提取物的制备
- 洗涤细胞一次，用PBS，刮成1ml的PBS，并离心在1000 xg离心在4℃下5分钟。
- 悬浮细胞在含有10mM HEPES-KOH（pH值7.6），10mM的氯化钾，1.5mM的MgCl 2的，1毫钠乙二胺四乙酸（EDTA），1mM的乙烯钠乙二醇四乙酸（EGTA），250毫冰冷的缓冲蔗糖，和蛋白酶抑制剂的混合物（5μ微克/毫升胃酶抑素A，10μg/ ml的亮肽素，0.5mM的苯甲基磺酰氟（PMSF），1mM的二硫苏糖醇（DTT），和25微克/毫升的N-乙酰基亮氨酸 - 亮氨酸 - 正Leu-人（ALLN））30分钟在冰上。
- 通过一个22国祥通过细胞提取物1 1/2针30倍和离心机在890 xg离心在4℃下5分钟，以分离细胞核。
- 使用上清液用于膜级分（步骤1.2.7）的分离。重悬核沉淀在0.1的缓冲液C（20mM的HEPES / KOH pH 7.6中，0.42 M氯化钠，2.5％（体积/体积）甘油的溶液，1.5毫的MgCl 2，1mM的EDTA钠，1mM的钠EGTA和的混合物蛋白酶抑制剂（5微克/毫升胃酶抑素A，10μg/ ml的亮肽素，0.5mM的PMSF，1毫摩尔DTT，和25微克/毫升ALLN））。
- 在4℃下旋转，在4℃进行60分钟，并离心悬浮液以20,000 xg离心在微量20分钟。上清液被指定为“核提取物”。
- 加热在100℃下的核提取物10分钟，用5×上样缓冲液（312.5毫的Tris-HCl pH 6.8的，10％的SDS，50％甘油，12.5％β巯基乙醇和0.05％溴酚蓝）经受SDS-PAGE之前。
- 离心从原来的890 XG自旋上清液以20,000 xg离心在4℃下20分钟。用于随后的免疫印迹分析，溶解沉淀在0.1ml SDS裂解缓冲液（10mM的Tris-HCl pH 6.8的，100毫摩尔NaCl，1％（V / V）十二烷基硫酸钠（SDS），1mM的EDTA钠和1毫EGTA钠）。这被指定为“膜部分”。
注意：我们用20000×g离心20分钟以沉淀膜。 100000×g离心10 - 20分钟已经从Brown和戈尔茨坦实验室15的文件被使用。 - 孵育膜级分在37℃下30分钟，并确定由Bradford蛋白测定蛋白质浓度。对样品进行SDS-PAGE前，加入1μl100X溴酚蓝的解决方案。
- 负载25 -总膜蛋白质的50微克在10％SDS-PAGE凝胶39。运行凝胶在80伏15分钟，然后换到130 V和再运行115分钟。转移在140毫安130分钟39。
- 对于Western印迹分析，使用抗SCAP抗体检测总蛋白SCAP。使用蛋白质二硫键异构酶（PDI），一个ER驻留蛋白40，作为内部对照。使用抗SREBP-1抗体来检测SREBP-1的N末端带。使用拉明A作为内部控制的核提取物31。
2. SCAP分析ň-glycosylation在人类细胞
- 细胞培养，转染，和治疗
- 用于膜分析，在10cm皿用DMEM种子〜1×10 6个 HEK293T细胞补充有5％FBS和孵育在37℃下将细胞与5％CO 2的转染前24小时。
- 稀释4 - 8微克GFP-SCAP质粒（彼得Espenshade博士的礼物）22在1毫升降低血清培养基，轻轻混匀。
- 通过直接吹打成1ml的降低含质粒的血清的培养基16微升DNA转染试剂，轻轻混匀 - 添加8。
- 孵育转染试剂/质粒复合物，在室温下25分钟。
- 添加转染复合物与新鲜培养基中的细胞，并继续培养在5％CO 2和37℃24小时。
- 用PBS洗一次并具有或不具有在衣霉素（1微克/毫升） 中，N -glycosylation抑制剂的存在或不存在葡萄糖（5毫摩）处理细胞12小时。
- 在步骤1.2.1，1.2.2，1.2.3，1.2.7和介绍准备细胞膜颗粒。
- SCAPñ-glycosylation检测
- 胰蛋白酶蛋白水解
- 从细胞中114微升含有10mM HEPES·KOH（pH 7.4）中，10毫米氯化钾，1.5mM的MgCl 2的，1毫钠EDTA和100mM NaCl的缓冲液中过表达的GFP-SCAP重悬膜粒料。
- 57孵育81;在无或1微升胰蛋白酶（1微克/微升）存在膜蛋白质的等分试样，在58微升在30℃下的总体积，为30分钟。
- 通过加入大豆胰蛋白酶抑制剂的2微升（400单位）停止反应。
- 通过肽N-糖苷酶F去糖基化（PNG酶F）
- 用于与酶F随后的治疗中，添加10微升含3.5％（重量/体积）SDS和7％（体积/体积）溶液2-巯基乙醇至每个样品。
- 在100℃下加热10分钟后，按顺序添加的0.5M磷酸钠（pH 7.5），7微升10％（V / V）的Nonidet P-40的12×蛋白酶抑制剂，和2微升的7微升（0.5单位PNG酶F的/微升）
- 在37℃下3小时温育后，通过加入5×上样缓冲液（312.5毫的Tris-HCl pH 6.8的，10％的SDS，50％甘油，12.5％β巯基乙醇和0.05％溴酚蓝）的停止反应。加热在100℃下的混合物为10米在并受到SDS-PAGE。负载25-50在10％SDS-PAGE凝胶39总的膜蛋白的微克。在运行80伏的凝胶15分钟，然后换到130 V代表另一个115分钟。转移在140毫安130分钟。
- 对于Western印迹，使用10μg/ ml的抗SCAP（9D5）抗体来检测Ñ-glycosylation和总SCAP蛋白。
- 胰蛋白酶蛋白水解
3.从ER到高尔基贩运SCAP检测由人体细胞用GFP-SCAP
- 在60毫米培养皿用DMEM种子2.5×10 5个 U87细胞补充有5％FBS和孵育在37℃下将细胞与5％CO 2的转染前24小时。
- 稀释0.5ml的4微克GFP-SCAP质粒降低血清培养基混合。
- 吹打直接进入0.5毫升含质粒的降低血清中添加8微升DNA转染试剂，轻轻混匀。
- 孵育转染试剂/质粒复合物，在室温25分钟温度。
- 添加转染复合物与新鲜培养基中的细胞，并继续培养在5％CO 2和37℃24小时。
- 补种5 - 10×10 4个细胞到含玻璃盖玻片（22毫米×22毫米）6孔板，并继续培养，在37℃和5％CO 2的24小时。
- 用PBS洗一次并具有或不具有在衣霉素（1微克/毫升）的存在或不存在葡萄糖（5毫摩）处理细胞12小时。
- 用PBS洗涤细胞一次，并在4％的甲醛固定10分钟。
- 洗涤细胞三次，用PBS，反转盖玻片，在幻灯片上与抗淬灭剂一起安装，并且使用指甲油密封盖玻片。
- 检查激光扫描共聚焦显微镜41使用63X油浸物镜的GFP-SCAP贩卖。
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Representative Results
图1示出了响应于人脑胶质瘤U87细胞内源性SCAP蛋白和SREBP-1的核形式的检测通过使用免疫印迹对葡萄糖刺激。膜蛋白SCAP在“膜部分”检测的。 SREBP-1的核形式（N末端）中的“核提取物”被检测。 SCAP蛋白的水平（PDI作为ER膜蛋白内部对照）和SREBP-1的核形式由葡萄糖刺激都显着增强。这些结果表明，该协议能够检测在人类细胞中的内源性SCAP蛋白。
图2示出了响应SCAPÑ-glycosylation和总的GFP-SCAP蛋白水平的分析对葡萄糖在HEK293T细胞刺激和治疗衣霉素表达GFP标记的仓鼠SCAP 图
图3示出从ER到高尔基体响应于葡萄糖刺激GFP-SCAP贩卖通过在U87细胞衣霉素治疗抑制。 如图3A中所示，共焦显微镜图像显示，GFP的SCAP蛋白存在于在不存在葡萄糖的内质网，如由它的共定位使用PDI，一个ER驻留蛋白（红色）。相反，在葡萄糖的存在下，GFP-SCAP移动到高尔基，由共定位与高尔基体蛋白质标记Giantin（红色）（ 图3B）所示。此外，衣霉素治疗从ER到高尔基体（ 图3A和B）抑制GFP-SCAP的葡萄糖诱导贩卖。
图1 内源SCAP蛋白及SREBP-1的核形态中U87细胞。膜，并从在具有或不具有葡萄糖（5毫米）12小时无血清培养基中培养的人原代成胶质细胞瘤U87细胞的核提取物的Western印迹分析检测 。针对人SCAP氨基酸450抗SCAP抗体 - 500被用来检测在人类细胞中的内源性SCAP。 SREBP-1的活性形式（N末端）中的“核提取物”被检测用抗体针对的氨基酸301 - 人类SREBP-1的407片段。这个数字已被修改与31的许可。 请点击此处查看大VERSI这个数字的。
图2. SCAPñ-glycosylation和GFP-SCAP蛋白质水平 的Western印迹分析 。A）显示SCAP结构跨越跨过内质网膜示意图。有三个天冬酰胺（N）残基在SCAP，所有这些都驻留在ER腔和由N-连接寡糖被修饰。含SCAP氨基酸540-707的片段是对胰蛋白酶消化抗性。它含有两个N-连接的寡糖修饰麦粒肿，N590和N641，这可以通过IgG的9D5抗体对氨基酸540来检测- 707通过免疫印迹乙仓鼠SCAP）SCAPñ-glycosylation（上部的Western印迹分析的：用胰蛋白酶处理）或GFP-SCAP蛋白水平（低：从HEK293T细胞无反式胰蛋白酶处理）用GFP-SCAP iently转染24小时，然后在无血清的培养基中培养具有或不具有在衣霉素（1微克/毫升），其N- -glycosylation抑制剂的存在或不存在葡萄糖（5毫米），12小时。在印迹的左侧的数字表示对SCAP蛋白（N590和N641位点）（上，通过IgG的9D5抗体检测）N -glycosylation位点的数目。的GFP-SCAP下面板由针对GFP蛋白的抗体进行检测。这个数字已被修改许可31。 请点击此处查看本图的放大版本。
图3.从ER到高尔基体， 一个 SCAP贩运的检测 ，B）共聚焦显微镜图像显示，GFP-SCAP驻留在ER或移动到t他高尔基与/不存在或葡萄糖（5毫摩）的存在而不衣霉素（1微克/毫升）处理在U87细胞12小时。 PDI显示ER染色（红色）（A）。 Giantin，高尔基标记（红色）（B）中。 DAPI（蓝色）染色的细胞核。刻度条表示10μm以下。图3A是新的数据和尚未发表过的。 图3B已被修改，从31的许可。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
在这项研究中，我们描述了在人细胞中膜部分的分离和用于通过使用免疫印迹制备样品用于检测SCAPÑ-glycosylation和总蛋白的一个协议。我们还提供采用GFP标记和共聚焦显微镜监测SCAP贩卖的方法。该方法是专门用于分析膜蛋白是研究SCAPñ-glycosylation和贩卖人口的重要工具。
使用各种凝集素识别不同氮肥 -glycan链，并确定ñ糖基蛋白42的方法相比，我们这里介绍的方法使用酶F去除蛋白质联N- -glycan并检测迁移转变，以确定SCAP蛋白片段的糖基化AA 540-707。凝集素的方法的限制是依赖于适当的型凝集素识别特定的识别
在这项研究中，用于n -glycosylation和贩卖人体细胞的分析GFP标记SCAP的质粒是仓鼠起源。 SCAP抗体（IgG-9D5），针对氨基酸SCAP蛋白的540-707片段只能检测蛋白质和N -glycosylation仓鼠SCAP的，例如在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系15上升。针对氨基酸的抗体450 - 500人类SCAP的是能够检测内源性SCAP蛋白在人细胞中， 如图1为了检测SCAPÑ-glyco。基化在人类细胞或组织，我们需要制定一个特异性抗体对氨基酸540 - 人类SCAP的707片段。此外，一个特定的外源凝集素的鉴定识别SCAP结合Ñ-glycan是分析人类SCAPÑ-glycosylation 42的另一种方式。此外，限定每个n -glycan链中SCAP装订的组成和结构（N263，N590和N641）将促进我们SCAP贩卖从ER到高尔基体的基本机制的理解。
此外，为了获得用于检测SCAPÑ-glycosylation的最佳效果，我们根据我们的实验条件下，这是从在由布朗和戈尔茨坦实验室15的出版物中描述的方法改性调整一些反应参数。成功检测SCAP蛋白和其N -glycosylation，膜级分和核提取物的质量是非常重要的。我们直接测定在37℃下温育的膜部分之后的蛋白质浓度，避免把样本回冰上。这里所描述的方法可广泛适用于不同的研究领域，包括癌症，心血管疾病，糖尿病和肥胖症。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent | Roche | 6366236001 | |
| Opti-MEMI medium | Life Technologies | 31985-070 | |
| trypsin | Sigma | T6567 | |
| soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9777 | |
| PNGase F | Sigma | P7367 | |
| Anti-SCAP (9D5) antibody | Santa Cruz | sc-13553 | |
| GFP antibody | Roche | 11814460001 | |
| SREBP-1 antibody (IgG-2A4) | BD Pharmingen | 557036 | |
| PDI Antibody (H-17) | Santa Cruz | sc-30932 | |
| Lamin A Antibody (H-102) | Santa Cruz | sc-20680 | |
| SCAP antibody (a.a 450-500) | Bethyl Laboratories, Inc. | A303-554A | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) without glucose, pyruvate and glutamine | Cellgro | 17-207-CV | Add 1 mM Pyravate and 4 mM Glutamine before use |
| 22 G x 1 1/2 needle | BD | 305156 | |
| pepstatin A | Sigma | P5318 | |
| leupeptin | Sigma | L2884 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| DTT | Sigma | 43819 | |
| ALLN | Sigma | A6185 | |
| Nitrocellulose membrane | GE | RPN3032D | |
| EDTA Solution 0.5 M pH 8.5 100 ml | VWR | 82023-102 | |
| EGTA 0.5 M sterile (pH 8.0) 50 ml | Fisher Scentific | 50255956 | |
| HyClone FBS | Thermo scientific | SH3007103 | |
| glycerol | Sigma | G5516 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| bromophenol blue | Sigma | B8026 | |
| prolong gold antifade reagent with dapi | Life Technologies | P36935 | |
| L-glutamine (200 mM) | Life Technologies | 25030081 | |
| sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 |
References
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