Summary
Bu Western blot ile SCAP N -glycosylation ve toplam proteinin belirlenmesi için insan hücrelerinden membran fraksiyonu izolasyonu ve numune hazırlama yönelik değişik bir metot tarif etmektedir. Biz daha konfokal mikroskopi kullanılarak SCAP ticaretini izlemek için bir GFP-etiketleme yöntemi tanıtmak. Bu protokol, normal bir biyolojik laboratuvarlarda kullanılabilir.
Introduction
Lipid metabolizması deregülasyon kanseri ve metabolizma hastalıkları 1-6 ortak bir özelliğidir. Bu işlemlerde, sterol düzenleyici elementi bağlayan proteinler (SREBPs), transkripsiyon faktörleri ailesidir, alım ve kolesterol, yağlı asitlerin sentezi ve fosfolipid 7-10 önemli genlerin ekspresyonunu kontrol etmede çok önemli bir rol oynar.
SREBP-1 a, SREBP-1 c ve SREBP-2 de dahil olmak üzere SREBPs, iki transmembran 7 sayesinde endoplazmik retikulum (ER) zarına bağlanan etkin olmayan öncüler olarak sentezlenir. SREBPs N-terminali, hedef genlerinin 11 transaktivasyonu için bir DNA-bağlama alanını içerir. SREBP öncülerinin C-terminali SREBP bölünmesi aktive edici protein (SCAP) 12,13, SREBP stabilitesi ve aktivasyon 14-16 düzenlenmesinde çok önemli bir rol oynayan bir politopik membran proteinine bağlanır.
implementranskripsiyonel fonksiyonunun yon iki proteazlar ardışık SREBP ayrılması ve daha sonra lipojenik genlerin 7 transaktivasyonu için çekirdeğin içine girer N-terminal fragmanı serbest Golgi, ER SCAP / SREBP kompleksinin, gerektirir. Bu işlemlerde, ER membran sterol seviyeleri ER 7,17 den SCAP / SREBP kompleksinin çıkış kontrol eder. Yüksek sterol koşullar altında, sterol Scap veya ER yerleşik bağlanan insülin ile uyarılan gen proteini-1 (INSIG-1) veya 2 (INSIG-2), içinde SCAP / SREBP kompleksi korumak Insigs ile Scap ilişkisini arttırıcı ER 18-20. sterol düzeyleri azalma olduğunda, SCAP Insigs ile ayrışmaktadır. Bu ortak kaplama proteinleri (COP) II kompleksi ile SCAP etkileşim sağlayan bir SCAP konformasyonel değişime yol açar. Karmaşık tomurcuklanma vezikülleri içine SCAP / SREBP kompleksi dahil edilmesine aracılık eder ve Golgi 21,22 ER; nakliye yönlendirir. TRANSLOC üzerineGolgi ation, SREBPs ardışık N-terminali 7,23-29 serbest kalmasına yol, alana, 1 ve-2 proteaz tarafından ayrılmaktadır.
SCAP proteini N asparajinde oligosakkaritler -bağlı üç taşır (N) N263, N590, N641 ve 15 konumlandırır. Biz son zamanlarda bu sitelerde SCAP glukoz aracılı N -glycosylation düşük sterol koşullarında 30-32 altında Golgi ER SCAP / SREBP kaçakçılığı için bir ön koşul olduğunu ortaya koymuştur. (NNN qqq için) glutamin için üç asparagin mutasyon yoluyla SCAP glikosilasyon kaybı SCAP protein ve SREBP aktivasyon 31 azaltılması istikrarsızlık SCAP / SREBP kompleksinin ve sonuçların ticaretini devre dışı bırakır. Bizim son veriler de bu SREBP-1 yüksek glioblastoma aktive ve SCAP N -glycosylation 4,31,33,34 tarafından düzenlenir göstermektedir. Hedefleme SCAP / SREBP-1 sinyal maligniteler ve metabolik s tedavisinde yeni bir strateji olarak ortaya çıkmaktadır1,3,35-38 yndromes. Bu nedenle, SCAP proteini ve N -glycosylation düzeylerini analiz etmek ve insan hücreleri ve hasta dokularda kaçakçılığı izlemek için etkin bir yöntem geliştirmektir önemlidir.
ER 'in içinde SCAP proteini (amino asitler 540-707) luminal bölgesi sağlam zarları tripsin 15 ile muamele edildiğinde proteoliz korunur iki N -glycosylation sitesi (N590 ve N641) içerir. Bu lümen parçası, sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) 15,31 ile Scap bireysel glikosile varyantlarının çözünürlüğünü sağlamak için yeterince küçüktür ~ 30 kDa'lık bir moleküler ağırlığa sahiptir. Burada, N Scap arasında -glycosylation ve insan toplam hücre proteini tespit etmek için bir yöntem sağlar. Bu protokol, Brown ve Goldstein, laboratuarda 15 ve son yayın 31 'den yayınlarda açıklanan yönteme elde edilir. Protokol t kullanılabilirO memeli hücrelerinden SCAP protein çalışma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
İnsan hücrelerinde 1. Tespit endojen SCAP Protein
- Hücre Kültürü ve İşlem
- Tohum yaklaşık 1 x 10 6 U87% 5 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş Dulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM) ile 10 cm'lik bir tabak hücreleri ve tedaviden önce 24 saat boyunca CO2, 37 ° C'de inkübe hücreleri ve% 5.
- fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile bir kez hücreler yıkanır, daha sonra 12 saat boyunca (5 mM) ile birlikte ya da glükoz ihtiva etmeyen taze DMEM ortamı hücreleri geçer.
- Hücre membran fraksiyonları ve Nükleer özütlerin hazırlanması
- Yıkama hücreler bir kez PBS ile 4 ° C 'de 5 dakika boyunca 1000 x g'de 1 mi PBS içine kazıma ve santrifüjlenir.
- 10 mM HEPES-KOH (pH 7.6), 10 mM KCI, 1.5 mM MgCI2, 1 mM sodyum etilendiamintetraasetik asit (EDTA), 1 mM sodyum etilen glikol tetraasetik asit (EGTA), 250 mM ihtiva eden buzla soğutulmuş bir tampon maddesi içinde yeniden süspanse hücreleri sakroz ve proteaz inhibitörleri karışımı (5 μug / ml pepstatin A, 10 ug / ml löpeptin, 0.5 mM fenilmetilsülfonil florid (PMSF), 1 mM ditiotreitol (DTT) ve 25 ug / ml N-asetil-Leu-Leu-norLeu-al, 30 dakika boyunca (ALLN)) buzda.
- çekirdekleri izole etmek için 5 dakika boyunca 4 ° C'de 890 x g'de 22 x g ile 1 1/2 iğne 30 kez ve santrifüj hücre ekstreleri geçirin.
- Membran fraksiyonlarının (aşama 1.2.7) ayrılması için supernatant kullanın. Tampon C (20 mM HEPES / KOH, pH 7.6, 0.42 M NaCl,% 2.5 (h / h) gliserol, 0.1 mi nükleer pelet yeniden süspanse edin, 1.5 mM MgCI2, 1 mM sodyum EDTA, 1 mM sodyum EGTA ve karışım proteaz inhibitörleri (5 ug / ml pepstatin A, 10 ug / ml löpeptin, 0.5 mM PMSF, 1 mM DTT ve 25 ug / ml ALLN)).
- 4 ° C'de 20 dakika boyunca bir mikrosantrifüj içinde 20,000 x g'de 60 dakika santrifüj boyunca 4 ° C 'de süspansiyon döndürün. süpernatant "nükleer özler" olarak belirlenmiştir.
- (5x yükleme tamponu ile 10 dakika boyunca 31 100 ° C'de çekirdek özütleri IsıSDS-PAGE maruz kalmadan önce 2.5 mM Tris-HCI, pH 6.8,% 10 SDS,% 50 gliserol,% 12.5 β-mersaptoetanol ve mavi,% 0.05 bromofenol).
- 4 ° C'de 20 dakika boyunca 20,000 x g'de orijinal 890 xg dönüş süpernatant santrifüjleyin. daha sonra Western blot analizi için, 0.1 SDS liziz tamponu (10 mM Tris-HCI pH 6.8, 100 mM NaCI,% 1 (h / h) sodyum dodesil sülfat (SDS), 1 mM sodyum EDTA ve 1 pelet çözülür mM sodyum EGTA). Bu, "membran fraksiyonu" olarak adlandırılır.
NOT: membranlar pelet 20.000 xg 20 dakika kullanın. 10 100,000 xg - 20 dakika Brown ve Goldstein, laboratuarda 15 ile kağıt kullanılmaktadır. - 30 dakika boyunca 37 ° C 'de membran fraksiyonu inkübe ve Bradford protein tahliliyle protein konsantrasyonu belirlenir. SDS-PAGE için numuneler tabi önce 1 ul 100x bromofenol mavi çözeltisi ekleyin.
- % 10 SDS-PAGE jeli 39 toplam membran proteinlerinin 50 ug - Yük 25. jel çalıştırın80 V 15 dakika, daha sonra da 130 V değiştirmek ve başka bir 115 dakika boyunca çalışır. 130 dakika 39 için 140 mA aktarın.
- Western blot analizi için, toplam SCAP proteini tespit etmek için bir anti-SCAP antikoru kullanımı. Bir iç kontrol olarak, protein disülfid izomeraz (KAE), bir ER-yerleşik protein 40 kullanın. SREBP-1 N-terminal grubu tespit etmek için bir anti-SREBP-1 antikoru kullanın. Nükleer ekstreler 31 için bir iç kontrol olarak lamin A kullanın.
İnsan hücrelerinde 2. Analiz Scap N -glycosylation
- Hücre Kültürü, transfeksiyon, ve Tedavi
- Membran analizi için, DMEM ile 10 cm'lik bir tabak tohum yaklaşık 1 x 10 6 HEK293T hücreleri,% 5 FBS ile takviye edilmiş ve transfeksiyondan 24 saat önce CO2, 37 ° C'de inkübe hücreleri ve% 5.
- Serum orta azaltılmış 1 ml 8 mg GFP-SCAP plazmid (Dr. Peter Espenshade bir hediye) 22 ve hafifçe karıştırın - 4 seyreltin.
- plazmaları ihtiva serum orta azaltılmış 1 ml doğrudan pipetleme 16 ul DNA transfeksiyon ayıracı ve hafifçe karıştırın - 8 ekleyin.
- Oda sıcaklığında 25 dakika boyunca transfeksiyon reaktifi / plazmid kompleksi inkübe edin.
- Taze ortam ile hücrelere transfeksiyon kompleksi ilave edin ve% 5 CO2 ve 37 ° C'de 24 saat boyunca kültüre devam etmektedir.
- Bir kez PBS ile yıkayın ve veya tunikamisin (1 ug / ml), bir N -glycosylation inhibitörün varlığında veya yokluğunda, glikoz (5 mM) olmaksızın 12 saat boyunca hücre tedavisi.
- adımlar 1.2.1, 1.2.2, 1.2.3 ve 1.2.7 de açıklandığı gibi hücre zarı pelet hazırlayın.
- SCAP N -glycosylation tespiti
- tripsin Proteoliz
- 10 mM HEPES · KOH (pH 7.4), 10 mM KCI, 1.5 mM MgCI2, 1 mM sodyum EDTA ve 100 mM NaCl ihtiva eden tampon 114 ul GFP SCAP aşırı ifade eden hücrelerden membran pelet yeniden süspanse edin.
- 57 inkübe81; 30 ° C 'de 30 dakika boyunca 58 ul'lik bir toplam hacimde, yokluğu veya tripsin 1 ul (1 ug / ml) varlığında membran proteinlerinin l tümbölenler.
- soya fasulyesi tripsin inhibitörü 2 ul (400 birim) eklenerek reaksiyonlar durur.
- Peptid N glikosidaz F deglikosilasyon (PNGase F)
- PNGase F ile muamele için,% 3.5 (ağırlık / hacim) SDS ve% 7 (hacim / hacim) ihtiva eden bir çözeltiden 10 ul her bir örnek için 2-merkaptoetanol ekleyin.
- 10 dakika boyunca 100 ° C'de ısıtıldıktan sonra, sırayla, 0.5 M sodyum fosfat (pH 7.5),% 10 (h / h) Nonidet 12 x proteaz inhibitörleri P-40 ve 2 ul 7 ul 7 ul (0.5 U ekleme PNGase F. / ml)
- 3 saat 37 ° C'de inkübasyondan sonra, 5x yükleme tamponu (312.5 mM Tris-HCI pH 6.8,% 10 SDS,% 50 gliserol,% 12.5 β-merkaptoetanol ve% 0.05 bromofenol mavisi) eklenerek reaksiyonlar durur. 10 m, 100 ° C'de karışımın ısı İleve SDS-PAGE tabi. % 10 SDS-PAGE jeli 39 toplam membran proteinlerinin yük 25-50 ug. daha sonra başka bir 115 dakika boyunca 130 V değiştirmek 15 dakika boyunca 80 V jel üzerinde çalıştırıldı. 130 dakika boyunca 140 mA aktarın.
- Western Blot için, N -glycosylation toplam SCAP proteini tespit etmek için 10 ug / ml anti-SCAP (9D5) antikoru kullanımı.
- tripsin Proteoliz
İnsan hücrelerinde GFP-SCAP kullanarak Algılama Golgi ER SCAP Ticareti 3.
- DMEM ile 60 mm çanak Tohum 2.5 x 10 5 U87 hücreler% 5 FBS ile takviye edilmiş ve transfeksiyondan 24 saat önce CO2, 37 ° C'de inkübe hücreleri ve% 5.
- 0.5 ml 4 mg GFP-SCAP plazmid azaltılmış serum orta sulandırmak ve karıştırın.
- şirketinden 0.5 ml plazmidleri içeren düşük serum ortamı pipetleme 8 ul DNA transfeksiyon reaktifi ekleyin ve yavaşça karıştırın.
- oda 25 dakika boyunca transfeksiyon reaktifi / plazmid kompleksi inkübesıcaklık.
- Taze ortam ile hücrelere transfeksiyon kompleksi ilave edin ve% 5 CO2 ve 37 ° C'de 24 saat boyunca kültüre devam etmektedir.
- Cam kapak kayma (22 mm x 22 mm) ihtiva eden bir 6-yuvalı plaka 10 x 10 4 hücreleri ve 24 saat boyunca 37 ° C ve% 5 CO2 kültüre devam - 5 reseed.
- Bir kez PBS ile yıkayın ve veya tunikamisin (1 ug / ml) varlığında ya da yokluğunda, glikoz (5 mM) olmaksızın 12 saat boyunca hücre tedavisi.
- Bir kez PBS ile yıkayın hücreleri ve 10 dakika boyunca% 4 formaldehit içinde çözmek.
- , Lamelleri ters, PBS ile hücreleri üç kez yıkayın antifade reaktif ile birlikte slaytlar monte ve tırnak cilası kullanarak lamelleri mühür.
- Bir lazer tarama konfokal mikroskop 41 63X immersiyon yağı hedefi kullanarak GFP-SCAP ticaretini kontrol edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1, Western blot Glükoz uyarısına karşı tepki olarak insan glioblastoma U87 hücrelerinde endojen SCAP protein ve SREBP-1 nükleer formunun belirlenmesini göstermektedir. zar proteini SCAP "zar fraksiyonu" tespit edilir. SREBP-1 çekirdeği bir şekilde (N-terminal) "Nükleer özler" tespit edilir. SCAP protein düzeyi belirgin glükoz uyarılması ile geliştirilmiş ve SREBP-1 nükleer formu (KAE bir ER membran proteinlerinin iç kontrol olarak hizmet vermektedir). Bu sonuçlar, bir protokol, insan hücrelerinde endojen SCAP proteinini tespit etmek mümkün olduğunu göstermektedir.
Şekil 2, GFP-etiketli Hamster SCAP ifade HEK293T hücrelerinde uyarılması ve tunikamisin tedavi glikoza tepki olarak SCAP N -glycosylation toplam GFP SCAP protein düzeylerinin analizini göstermektedir. Şekil
Şekil 3, Glükoz uyarısına karşı tepki Golgi ER GFP-SCAP trafik U87 hücrelerinin tunikamisin işlenerek bastırılmıştır göstermektedir. Şekil 3A'da gösterildiği gibi, konfokal mikroskopi resim PDI, bir ER yerleşik bir protein (kırmızı) ile eş-lokalizasyonu ile gösterildiği gibi GFP SCAP proteini, glukozun yokluğunda ER yer aldığını göstermektedir. Bunun aksine, glükoz mevcudiyetinde GFP-SCAP Golgi proteini markör Giantin (kırmızı) (Şekil 3B) ile eş-lokalizasyonu ile gösterilen, Golgi hareket eder. Ayrıca, tunikamisinTedavi Golgi (Şekil 3A ve B) ER GFP-SCAP glikoz kaynaklı ticaretini bastırılır.
Şekil 1. Tespit Endojen SCAP Protein ve SREBP-1 U87 hücrelerde nükleer formu. Zar 12 saat (5 mM) ile ya da bir glukoz içermeyen serumsuz ortam içinde kültürlenen insan primer glioblastoma U87 hücrelerinin nükleer ekstrelerin Batı benek analizi. İnsan SCAP aa 450 karşı anti-SCAP antikoru - 500, insan hücrelerinde endojen SCAP tespit etmek için kullanıldı. İnsan SREBP-1 407 fragmanı - SREBP-1 aktif formu (N-terminal) AA 301 karşı antikor kullanılarak "çekirdek özleri" tespit edilir. Bu rakam, 31 izni ile modifiye edilmiştir. Daha büyük bir versi görmek için buraya tıklayınızbu rakamın üzerinde.
Şekil 2. SCAP N -glycosylation ve GFP-SCAP Protein Düzeylerinin Western Blot Analizi. A) SCAP yapısı yayılan ER zarı çapraz gösteren şematik diyagramı. ER lümeninde bulunan ve N-bağlı oligosakaritler modifiye bunların hepsi Scap üç asparagin (N) kalıntıları vardır. SCAP ihtiva eden amino asitler 540-707 fragman tripsin sindirime dirençlidir. . Bu aa 540 karşı IgG-9D5 antikoru ile tespit edilebilir, iki N-bağlantılı oligosakarit modifikasyonu sties, N590 ve N641 içerir - western blot B Hamster Scap) üst SCAP N -glycosylation (Western blot analizi 707: ile tripsin tedavisi) veya GFP-SCAP protein düzeyleri (alt: HEK293T hücrelerinden trans hiçbir tripsin tedavisi)iently 24 saat boyunca, GFP-Scap ile transfekte edilmiş ve 12 saat boyunca, ya da tunikamisin (1 ug / ml), N -glycosylation inhibitörün varlığında veya yokluğunda, glikoz (5 mM) olmadan, serumsuz ortamda kültür. Blot sol tarafındaki numaraları (IgG 9D5 antikoru ile tespit üst) SCAP protein (N590 ve N641 siteleri) N -glycosylation sitelerinin sayısını gösterir. GFP-SCAP için alt paneli GFP proteine karşı bir antikor ile tespit edilmiştir. Bu rakam, 31 izni ile modifiye edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Golgi. A ER SCAP Ticareti Şekil 3. Algılama B) mikroskopisi görüntüleri GFP-SCAP ER bulunur veya t hareket ettiğini göstermektedirO 12 saat U87 hücrelerinin tunikamisin (1 ug / ml) tedavi olmadan / yokluğunda ya da glikoz (5 mM) varlığında, Golgi. PDI ER boyama (kırmızı) (A) göstermektedir. Giantin, Golgi markör (kırmızı) (B). DAPI (mavi) hücre çekirdeğine boyar. Ölçek çubuklar 10 mikron temsil etmektedir. Şekil 3A yeni veri ve daha önce yayınlanmamıştır. Şekil 3B 31 izni ile modifiye edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada, insan hücrelerinde membran fraksiyonlarının izolasyonu için ve Western blot ile SCAP N -glycosylation ve toplam proteinin belirlenmesi için numune hazırlanması için bir protokol açıklar. Biz daha GFP-etiketleme ve konfokal mikroskopi kullanılarak SCAP kaçakçılığı izlemek için bir yöntem sağlar. Yöntem özellikle membran proteini analiz etmek için kullanılan ve SCAP N -glycosylation ve insan ticaretini soruşturma önemli bir araçtır.
Farklı N -glycan zincirleri tanır ve N- -glycosylated proteinleri 42 tespit için çeşitli lektinler kullanılarak yöntemi ile karşılaştırıldığında, burada tarif edilen eden bir yöntem SCAP protein parçacığı glikosilasyonu belirlemek için geçiş Shift proteine bağlı N -glycan kaldırmak için PNGase F kullanır tespit aa 540-707. lektin yönteminin sınırlama belirli tanımak için lektin uygun tip belirlenmesi bağlıdır
Bu çalışmada, insan hücrelerinde N -glycosylation ve trafik analizinde kullanılan GFP etiketli Scap plasmid hamster kökenlidir. SCAP proteininin 540-707 fragmanı, sadece protein ve Çin hamsteri yumurtalık (CHO) hücre hattı 15 deki gibi bir hamster Scap N -glycosylation algılayabilir amino asitlerine karşı yükseltilmiş SCAP antikoru (IgG-9D5). Amino asitlerine karşı antikor 450 - Şekil 1 'de gösterildiği gibi, insan Scap 500, insan hücrelerinde endojen SCAP proteinini tespit edebilmektedir SCAP N -glyco tespit etmek.İnsan Scap 707 fragmanı - insan hücreleri veya dokularda sylation, amino asitlerin karşı 540, belirli bir antikor geliştirmek gerekir. Buna ek olarak, belirli bir lektin tanımlanması SCAP-bağlı N -glycan insan SCAP N -glycosylation 42 analiz için alternatif bir yöntemdir tanımak için. Ayrıca, SCAP bağlama her N -glycan zincirin bileşimi ve yapısını tanımlayan (N263, N590 ve N641) Golgi ER SCAP ticareti yatan mekanizma anlayışımızı kolaylaştıracaktır.
Ayrıca, SCAP N -glycosylation saptanması için en iyi sonuçları elde etmek için, Brown ve Goldstein Laboratory 15 ile yayınlarda tarif edilen yöntemlerle değiştirilmiş olan deneysel koşullara göre bir tepki parametreleri ayarlanabilir. Başarılı bir şekilde SCAP protein ve bunun N -glycosylation tespit etmek için, membran fraksiyonları ve nükleer özler kalitesi çok önemlidir. Bu, doğrudan buz üzerine örnek koyarak kaçınarak 37 ° C'de inkübe membran fraksiyonları sonra protein konsantrasyonu belirlenir. Burada tarif edilen yöntem yaygın kanser, kalp-damar hastalığı, diyabet ve obezite de dahil olmak üzere farklı araştırma alanları uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent | Roche | 6366236001 | |
| Opti-MEMI medium | Life Technologies | 31985-070 | |
| trypsin | Sigma | T6567 | |
| soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9777 | |
| PNGase F | Sigma | P7367 | |
| Anti-SCAP (9D5) antibody | Santa Cruz | sc-13553 | |
| GFP antibody | Roche | 11814460001 | |
| SREBP-1 antibody (IgG-2A4) | BD Pharmingen | 557036 | |
| PDI Antibody (H-17) | Santa Cruz | sc-30932 | |
| Lamin A Antibody (H-102) | Santa Cruz | sc-20680 | |
| SCAP antibody (a.a 450-500) | Bethyl Laboratories, Inc. | A303-554A | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) without glucose, pyruvate and glutamine | Cellgro | 17-207-CV | Add 1 mM Pyravate and 4 mM Glutamine before use |
| 22 G x 1 1/2 needle | BD | 305156 | |
| pepstatin A | Sigma | P5318 | |
| leupeptin | Sigma | L2884 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| DTT | Sigma | 43819 | |
| ALLN | Sigma | A6185 | |
| Nitrocellulose membrane | GE | RPN3032D | |
| EDTA Solution 0.5 M pH 8.5 100 ml | VWR | 82023-102 | |
| EGTA 0.5 M sterile (pH 8.0) 50 ml | Fisher Scentific | 50255956 | |
| HyClone FBS | Thermo scientific | SH3007103 | |
| glycerol | Sigma | G5516 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| bromophenol blue | Sigma | B8026 | |
| prolong gold antifade reagent with dapi | Life Technologies | P36935 | |
| L-glutamine (200 mM) | Life Technologies | 25030081 | |
| sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 |
References
- Ru, P., Williams, T. M., Chakravarti, A., Guo, D. Tumor metabolism of malignant gliomas. Cancers (Basel). 5, 1469-1484 (2013).
- Moon, Y. A., et al. The Scap/SREBP pathway is essential for developing diabetic fatty liver and carbohydrate-induced hypertriglyceridemia in animals. Cell metabolism. 15, 240-246 (2012).
- Guo, D., Bell, E. H., Chakravarti, A. Lipid metabolism emerges as a promising target for malignant glioma therapy. CNS Oncology. 2, 289-299 (2013).
- Guo, D., et al. The AMPK agonist AICAR inhibits the growth of EGFRvIII-expressing glioblastomas by inhibiting lipogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 12932-12937 (2009).
- Menendez, J. A., Lupu, R. Fatty acid synthase and the lipogenic phenotype in cancer pathogenesis. Nat Rev Cancer. 7, 763-777 (2007).
- Guo, D., Cloughesy, T. F., Radu, C. G., Mischel, P. S. AMPK: A metabolic checkpoint that regulates the growth of EGFR activated glioblastomas. Cell Cycle. 9, 211-212 (2010).
- Goldstein, J. L., DeBose-Boyd, R. A., Brown, M. S. Protein sensors for membrane sterols. Cell. 124, 35-46 (2006).
- Shao, W., Espenshade, P. J. Expanding Roles for SREBP in Metabolism. Cell metabolism. 16, 414-419 (2012).
- Nohturfft, A., Zhang, S. C. Coordination of lipid metabolism in membrane biogenesis. Annual review of cell and developmental biology. 25, 539-566 (2009).
- Jeon, T. I., Osborne, T. F. SREBPs: metabolic integrators in physiology and metabolism. Trends in endocrinology and metabolism: TEM. 23, 65-72 (2012).
- Sato, R., et al. Assignment of the membrane attachment, DNA binding, and transcriptional activation domains of sterol regulatory element-binding protein-1 (SREBP-1). The Journal of biological chemistry. 269, 17267-17273 (1994).
- Sakai, J., Nohturfft, A., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Cleavage of sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs) at site-1 requires interaction with SREBP cleavage-activating protein. Evidence from in vivo competition studies. The Journal of biological chemistry. 273, 5785-5793 (1998).
- Sakai, J., et al. Identification of complexes between the COOH-terminal domains of sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs) and SREBP cleavage-activating protein. The Journal of biological chemistry. 272, 20213-20221 (1997).
- Hua, X., Nohturfft, A., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Sterol resistance in CHO cells traced to point mutation in SREBP cleavage-activating protein. Cell. 87, 415-426 (1996).
- Nohturfft, A., Brown, M. S., Goldstein, J. L. Topology of SREBP cleavage-activating protein, a polytopic membrane protein with a sterol-sensing domain. The Journal of biological chemistry. 273, 17243-17250 (1998).
- Nohturfft, A., Hua, X., Brown, M. S., Goldstein, J. L. Recurrent G-to-A substitution in a single codon of SREBP cleavage-activating protein causes sterol resistance in three mutant Chinese hamster ovary cell lines. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 13709-13714 (1996).
- Espenshade, P. J., Hughes, A. L. Regulation of sterol synthesis in eukaryotes. Annu Rev Genet. 41, 401-427 (2007).
- Yang, T., et al. Crucial step in cholesterol homeostasis: sterols promote binding of SCAP to INSIG-1, a membrane protein that facilitates retention of SREBPs in ER. Cell. 110, 489-500 (2002).
- Yabe, D., Brown, M. S., Goldstein, J. L. Insig-2, a second endoplasmic reticulum protein that binds SCAP and blocks export of sterol regulatory element-binding proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 12753-12758 (2002).
- Yabe, D., Xia, Z. P., Adams, C. M., Rawson, R. B. Three mutations in sterol-sensing domain of SCAP block interaction with insig and render SREBP cleavage insensitive to sterols. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 16672-16677 (2002).
- Espenshade, P. J., Li, W. P., Yabe, D. Sterols block binding of COPII proteins to SCAP, thereby controlling SCAP sorting in ER. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11694-11699 (2002).
- Nohturfft, A., Yabe, D., Goldstein, J. L., Brown, M. S., Espenshade, P. J. Regulated step in cholesterol feedback localized to budding of SCAP from ER membranes. Cell. 102, 315-323 (2000).
- Sakai, J., et al. Sterol-regulated release of SREBP-2 from cell membranes requires two sequential cleavages, one within a transmembrane segment. Cell. 85, 1037-1046 (1996).
- Wang, X., Sato, R., Brown, M. S., Hua, X., Goldstein, J. L. SREBP-1, a membrane-bound transcription factor released by sterol-regulated proteolysis. Cell. 77, 53-62 (1994).
- Brown, M. S., Goldstein, J. L. A proteolytic pathway that controls the cholesterol content of membranes, cells, and blood. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 11041-11048 (1999).
- Rawson, R. B., DeBose-Boyd, R., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Failure to cleave sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs) causes cholesterol auxotrophy in Chinese hamster ovary cells with genetic absence of SREBP cleavage-activating protein. J Biol Chem. 274, 28549-28556 (1999).
- Zelenski, N. G., Rawson, R. B., Brown, M. S., Goldstein, J. L. Membrane topology of S2P, a protein required for intramembranous cleavage of sterol regulatory element-binding proteins. J Biol Chem. 274, 21973-21980 (1999).
- Goldstein, J. L., Brown, M. S. A Century of Cholesterol and Coronaries: From Plaques to Genes to Statins. Cell. 161, 161-172 (2015).
- Espenshade, P. J., Cheng, D., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Autocatalytic processing of site-1 protease removes propeptide and permits cleavage of sterol regulatory element-binding proteins. The Journal of biological chemistry. 274, 22795-22804 (1999).
- Guo, D. SCAP links glucose to lipid metabolism in cancer cells. Mol Cell Oncol. 3, (2016).
- Cheng, C., et al. Glucose-Mediated N-glycosylation of SCAP Is Essential for SREBP-1 Activation and Tumor Growth. Cancer Cell. 28, 569-581 (2015).
- Shao, W., Espenshade, P. J. Sugar Makes Fat by Talking to SCAP. Cancer Cell. 28, 548-549 (2015).
- Guo, D., et al. EGFR signaling through an Akt-SREBP-1-dependent, rapamycin-resistant pathway sensitizes glioblastomas to antilipogenic therapy. Sci Signal. 2, 82 (2009).
- Guo, D., et al. An LXR agonist promotes GBM cell death through inhibition of an EGFR/AKT/SREBP-1/LDLR-dependent pathway. Cancer Discov. 1, 442-456 (2011).
- Guo, D., Bell, E. H., Mischel, P., Chakravarti, A. Targeting SREBP-1-driven lipid metabolism to treat cancer. Curr Pharm Des. 20, 2619-2626 (2014).
- Bell, E. H., Guo, D. Biomarkers for malignant gliomas. Malignant Gliomas, Radiation Medicine Rounds. 3, 339-357 (2012).
- Geng, F., et al. Inhibition of SOAT1 suppresses glioblastoma growth via blocking SREBP-1-mediated lipogenesis. Clin Cancer Res. , (2016).
- Ru, P., et al. Feedback Loop Regulation of SCAP/SREBP-1 by miR-29 Modulates EGFR Signaling-Driven Glioblastoma Growth. Cell Rep. , (2016).
- Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition). , (2012).
- Uehara, T., et al. S-nitrosylated protein-disulphide isomerase links protein misfolding to neurodegeneration. Nature. 441, 513-517 (2006).
- Miyashita, T. Confocal microscopy for intracellular co-localization of proteins. Methods Mol Biol. 1278, 515-526 (2015).
- Cao, J., Guo, S., Arai, K., Lo, E. H., Ning, M. Studying extracellular signaling utilizing a glycoproteomic approach: lectin blot surveys, a first and important step. Methods Mol Biol. 1013, 227-233 (2013).
