Descreve-se um método modificado para o isolamento de fracção de membrana a partir de células humanas e de preparação da amostra para a detecção de -glycosylation SCAP N e proteína total, utilizando Western blot. Nós introduzimos ainda um método de rotulagem GFP para monitorar o tráfico SCAP usando microscopia confocal. Este protocolo pode ser utilizado em laboratórios de biologia regulares.
Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of membrane-bound transcription factors controlling the expression of genes important for the synthesis of cholesterol, fatty acids and phospholipids, are frequently upregulated in these diseases. In the process of SREBP nuclear translocation, SREBP-cleavage activating protein (SCAP) plays a central role in the trafficking of SREBP from the endoplasmic reticulum (ER) to the Golgi and in subsequent proteolysis activation. Recently, we uncovered that glucose-mediated N-glycosylation of SCAP is a prerequisite condition for the exit of SCAP/SREBP from the ER and movement to the Golgi. N-glycosylation stabilizes SCAP and directs SCAP/SREBP trafficking. Here, we describe a protocol for the isolation of membrane fractions in human cells and for the preparation of the samples for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further provide a method to monitor SCAP trafficking by using confocal microscopy. This protocol is appropriate for the investigation of SCAP N-glycosylation and trafficking in mammalian cells.
A desregulamentação do metabolismo lipídico é uma característica comum de câncer e doenças metabólicas 1-6. Nestes processos, esterol de proteínas reguladoras de ligação ao elemento (SREBPs), uma família de factores de transcrição, desempenham um papel crítico no controle da expressão de genes importantes para a absorção e síntese de colesterol, ácidos gordos, fosfolípidos e 7-10.
SREBPs, incluindo SREBP-1a, SREBP-1c, e de SREBP-2, são sintetizadas como precursores inactivos que se ligam à membrana do retículo endoplasmático (ER), em virtude de dois domínios transmembranares 7. O N-terminal da SREBPs contém um domínio de ligação de ADN para a transactivação de genes alvo 11. O C-terminal dos precursores SREBP liga-se ao de SREBP proteína de activação de clivagem (SCAP) 12,13, uma proteína de membrana politópica que desempenha um papel fundamental na regulação da estabilidade e SREBP activação 14-16.
a implemenção da função da transcrição requer a translocação do complexo SCAP / SREBP do RE para o Golgi, onde duas proteases clivam sequencialmente SREBP e libertar o seu fragmento N-terminal, o qual então entra para dentro do núcleo para a transactivação de genes lipogênicas 7. Nestes processos, os níveis de esteróis na membrana do RE controlar a saída do complexo SCAP / SREBP do ER 7,17. Sob condições de elevada esterol, esterol SCAP se liga a ou ER-residente induzida por insulina do gene da proteína-1 (Insig-1) ou -2 (Insig-2), aumentando a associação de SCAP com Insigs que retêm o complexo SCAP / SREBP na ER 18-20. Quando os níveis de esteróis diminuir, SCAP dissocia com Insigs. Isto leva a uma alteração conformacional SCAP, que permite a interacção com proteínas de revestimento SCAP comuns complexo (COP) II. O complexo medeia a incorporação do complexo SCAP / SREBP para as vesículas do brotamento e dirige o seu transporte do RE para o Golgi 21,22. Após a translocção para o Golgi, SREBPs são sequencialmente clivada por Site-1 e Site-2 proteases, levando à libertação de N-terminal 7,23-29.
Proteína SCAP carrega três N -ligada oligossacarídeos na asparagina (N) posiciona N263, N590 e N641 15. Recentemente, revelou que mediada por glicose N -glycosylation de SCAP nestes locais é uma condição prévia para o tráfico SCAP / SREBP do RE para o Golgi sob baixas condições de esterol 30-32. Perda de glicosilação através de mutação de SCAP todos os três asparagina a glutamina (NNN para qqq) desactiva o tráfico do complexo SCAP / SREBP e resulta na instabilidade de proteínas SCAP e redução da activação SREBP 31. Nossos dados recentes também demonstram que SREBP-1 é altamente ativada no glioblastoma e regulamentada pela SCAP N -glycosylation 4,31,33,34. Segmentação / sinalização SCAP SREBP-1 está a emergir como uma nova estratégia para o tratamento de doenças malignas e s metabólicosyndromes 1,3,35-38. Portanto, é importante desenvolver um método eficaz para analisar os níveis de proteína SCAP e N -glycosylation e monitorar o seu tráfico de células humanas e tecidos de pacientes.
A região da proteína luminal SCAP (aminoácidos 540-707) no ER contém dois locais -glycosylation N (N590 e N641) que estão protegidos contra a proteólise quando as membranas intactas são tratadas com tripsina 15. Este fragmento luminal tem um peso molecular de ~ 30 kDa, que é suficientemente pequeno para permitir a resolução de variantes glicosiladas de SCAP individuais por electroforese em gel de sulfato de poliacrilamida dodecil de sódio (SDS-PAGE) 15,31. Aqui, nós fornecemos um método para detectar N -glycosylation do SCAP e a proteína total em células humanas. Este protocolo é derivado a partir do método descrito nas publicações de laboratório Brown e Goldstein 15 e nossa publicação recente 31. O protocolo pode ser utilizado em tele estudo de proteínas a partir de células de mamífero SCAP.
Neste estudo, descrevemos um protocolo para o isolamento de fracções de membrana de células de origem humana e para a preparação das amostras para a detecção de -glycosylation SCAP N e proteína total, utilizando Western blot. Nós fornecemos também um método para monitorar o tráfico SCAP usando GFP-rotulagem e microscopia confocal. O método é utilizado especificamente para analisar proteína de membrana e é uma ferramenta importante para investigar SCAP N -glycosylation e tráfico.
<p…The authors have nothing to disclose.
We are grateful to Drs. Mike S. Brown and Joseph L. Goldstein for their agreement to publish this method according to the methods described in their publications. We appreciate Dr. Peter Espenshade for sharing the GFP-SCAP plasmid. This work was supported by NIH grants NS072838 and NS079701 to D.G., American Cancer Society Research Scholar Grant RSG-14-228-01-CSM to D.G., and OSUCCC Pelotonia Postdoctoral Fellowship to C.C. We also appreciate the support from the Ohio State Neuroscience Core (P30 NS038526) and OSUCCC Translational Therapeutic Program seed grant and start-up funds to D.G.
X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent | Roche | 6366236001 | |
Opti-MEMI medium | Life Technologies | 31985-070 | |
trypsin | Sigma | T6567 | |
soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9777 | |
PNGase F | Sigma | P7367 | |
Anti-SCAP (9D5) antibody | Santa Cruz | sc-13553 | |
GFP antibody | Roche | 11814460001 | |
SREBP-1 antibody (IgG-2A4) | BD Pharmingen | 557036 | |
PDI Antibody (H-17) | Santa Cruz | sc-30932 | |
Lamin A Antibody (H-102) | Santa Cruz | sc-20680 | |
SCAP antibody (a.a 450-500) | Bethyl Laboratories, Inc. | A303-554A | |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) without glucose, pyruvate and glutamine | Cellgro | 17-207-CV | Add 1 Mm Pyravate and 4 mM Glutamine before use |
22G x 1 1/2 needle | BD | 305156 | |
pepstatin A | Sigma | P5318 | |
leupeptin | Sigma | L2884 | |
PMSF | Sigma | P7626 | |
DTT | Sigma | 43819 | |
ALLN | Sigma | A6185 | |
Nitrocellulose membrane | GE | RPN3032D | |
EDTA Solution 0.5 M PH8.5 100 ml | VWR | 82023-102 | |
EGTA 0.5 M sterile (PH 8.0) 50 ml | Fisher Scentific | 50255956 | |
HyClone FBS | Thermo scientific | SH3007103 | |
glycerol | Sigma | G5516 | |
β-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
bromophenol blue | Sigma | B8026 | |
prolong gold antifade reagent with dapi | life technologies | P36935 | |
L-glutamine (200 mM) | life technologies | 25030081 | |
sodium pyruvate | life technologies | 11360-070 |