تحليل سكاب<em> N</em> -glycosylation والاتجار في الخلايا البشرية
Summary
نحن تصف طريقة تعديل لعزل غشاء جزء من الخلايا البشرية وإعداد العينات للكشف عن -glycosylation سكاب N والبروتين الكلي باستخدام طخة غربية. علينا مواصلة إدخال طريقة GFP وضع العلامات لمراقبة الاتجار سكاب باستخدام متحد البؤر المجهري. هذا البروتوكول يمكن استخدامها في مختبرات البيولوجيا العادية.
Abstract
Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of membrane-bound transcription factors controlling the expression of genes important for the synthesis of cholesterol, fatty acids and phospholipids, are frequently upregulated in these diseases. In the process of SREBP nuclear translocation, SREBP-cleavage activating protein (SCAP) plays a central role in the trafficking of SREBP from the endoplasmic reticulum (ER) to the Golgi and in subsequent proteolysis activation. Recently, we uncovered that glucose-mediated N-glycosylation of SCAP is a prerequisite condition for the exit of SCAP/SREBP from the ER and movement to the Golgi. N-glycosylation stabilizes SCAP and directs SCAP/SREBP trafficking. Here, we describe a protocol for the isolation of membrane fractions in human cells and for the preparation of the samples for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further provide a method to monitor SCAP trafficking by using confocal microscopy. This protocol is appropriate for the investigation of SCAP N-glycosylation and trafficking in mammalian cells.
Introduction
تحرير ايض الدهون هو سمة مشتركة من السرطان وأمراض التمثيل الغذائي 1-6. في هذه العمليات، ستيرول البروتينات التنظيمية ملزم عنصر (SREBPs)، وهي عائلة من عوامل النسخ، تلعب دورا حاسما في السيطرة على التعبير عن الجينات مهمة لامتصاص وتركيب الكولسترول والأحماض الدهنية، والدهون الفوسفاتية 7-10.
SREBPs، بما في ذلك SREBP-1A، SREBP-1C، وSREBP-2، ويتم تخليق كما السلائف الخاملة التي تربط لغشاء الشبكة الإندوبلازمية (أوروبا) بحكم اثنين من المجالات عبر الغشاء 7. وN-محطة من SREBPs تحتوي مجال الحمض النووي ملزم للtransactivation من الجينات المستهدفة 11. سي محطة السلائف SREBP بربط SREBP البروتين تفعيل الانقسام (سكاب) 12،13، وهو بروتين غشاء polytopic التي تلعب دورا محوريا في تنظيم الاستقرار SREBP وتفعيل 14-16.
وimplemenالكساء وظيفة النسخي يتطلب النبات من مجمع سكاب / SREBP من لائحة لجولجي، حيث اثنين من البروتياز بالتتابع يلتصق SREBP والافراج عن جزء-N محطة، والذي يدخل بعد ذلك في نواة لtransactivation الجينات اكتناز الشحم 7. في هذه العمليات، ومستويات الجامدة في الغشاء ER السيطرة على الخروج من المجمع سكاب / SREBP من لائحة 7،17. في ظل ظروف ستيرول عالية، ستيرول بربط سكاب أو-ER المقيمين الانسولين التي يسببها الجين البروتين 1 (Insig-1) أو -2 (Insig-2)، وتعزيز ارتباط SCAP مع Insigs التي تحتفظ مجمع سكاب / SREBP في ER 18-20. عندما تنخفض مستويات ستيرول، SCAP تنأى مع Insigs. وهذا يؤدي إلى تغيير متعلق بتكوين سكاب، والذي يسمح التفاعل SCAP مع بروتينات الغلاف المشتركة (COP) II معقدة. مجمع يتوسط تأسيس مجمع سكاب / SREBP إلى الحويصلات في مهدها ويوجه انتقاله من لائحة لجولجي 21،22. على translocأوجه لجولجي، والمشقوق SREBPs بالتسلسل الموقع 1 والموقع-2 البروتياز، مما أدى إلى الإفراج عن N-محطة 7،23-29.
البروتين سكاب يحمل ثلاثة N -linked يغوساكاريدس في الهليونين (N) مواقف N263، N590، N641 و15. نحن كشفت مؤخرا أن بوساطة الجلوكوز N -glycosylation من سكاب في هذه المواقع هو شرط مسبق لتهريب سكاب / SREBP من لائحة لجولجي في ظل ظروف ستيرول منخفضة 30-32. فقدان بالغليكوزيل سكاب عبر تحور كل الهليونين ثلاثة إلى الجلوتامين (NNN إلى QQQ) تعطيل الاتجار من سكاب / مجمع SREBP والنتائج في عدم الاستقرار من البروتين سكاب والحد من تفعيل SREBP 31. أيضا تظهر لدينا بيانات حديثة أن SREBP-1 تفعيلها بشكل كبير في الإصابة بالورم الأرومي الدبقي وينظمها سكاب N -glycosylation 4،31،33،34. استهداف سكاب / SREBP-1 الإشارات يبرز بوصفه استراتيجية جديدة لعلاج الأورام الخبيثة والصورة الأيضyndromes 1،3،35-38. وبالتالي، فمن المهم تطوير وسيلة فعالة لتحليل مستويات البروتين سكاب وN -glycosylation ومراقبة الاتجار في خلايا وأنسجة جسم الإنسان المريض.
المنطقة اللمعية من البروتين سكاب (الأحماض الأمينية 540-707) في لائحة تحتوي على موقعين -glycosylation N (N590 وN641) التي يتم حمايتها من التحلل البروتيني عندما يتم التعامل مع الأغشية سليمة مع التربسين 15. هذا جزء اللمعية لها وزنها الجزيئي ~ 30 كيلو دالتون التي هي صغيرة بما يكفي للسماح للقرار من المتغيرات الغليكوزيلاتي الفردية سكاب من الصوديوم دوديسيل هلام كبريتات بولي أكريلاميد الكهربائي (SDS-PAGE) 15،31. هنا، ونحن نقدم وسيلة للكشف عن N -glycosylation من سكاب والبروتين الكلي في الخلايا البشرية. ويستمد هذا البروتوكول من الطريقة الموصوفة في المنشورات من براون وغولدشتاين المختبر 15 و لدينا نشر مؤخرا 31. بروتوكول يمكن استخدامها في تيانه دراسة من البروتين سكاب من خلايا الثدييات.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه الدراسة، ونحن تصف بروتوكول لعزل أجزاء الغشاء في الخلايا البشرية ولإعداد العينات للكشف عن -glycosylation سكاب N والبروتين الكلي باستخدام طخة غربية. علينا مواصلة توفير طريقة لمراقبة الاتجار سكاب باستخدام GFP وضع العلامات والفحص المجهري متحد البؤر. يتم استخدام الأ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to Drs. Mike S. Brown and Joseph L. Goldstein for their agreement to publish this method according to the methods described in their publications. We appreciate Dr. Peter Espenshade for sharing the GFP-SCAP plasmid. This work was supported by NIH grants NS072838 and NS079701 to D.G., American Cancer Society Research Scholar Grant RSG-14-228-01-CSM to D.G., and OSUCCC Pelotonia Postdoctoral Fellowship to C.C. We also appreciate the support from the Ohio State Neuroscience Core (P30 NS038526) and OSUCCC Translational Therapeutic Program seed grant and start-up funds to D.G.
Materials
| X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent | Roche | 6366236001 | |
| Opti-MEMI medium | Life Technologies | 31985-070 | |
| trypsin | Sigma | T6567 | |
| soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9777 | |
| PNGase F | Sigma | P7367 | |
| Anti-SCAP (9D5) antibody | Santa Cruz | sc-13553 | |
| GFP antibody | Roche | 11814460001 | |
| SREBP-1 antibody (IgG-2A4) | BD Pharmingen | 557036 | |
| PDI Antibody (H-17) | Santa Cruz | sc-30932 | |
| Lamin A Antibody (H-102) | Santa Cruz | sc-20680 | |
| SCAP antibody (a.a 450-500) | Bethyl Laboratories, Inc. | A303-554A | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) without glucose, pyruvate and glutamine | Cellgro | 17-207-CV | Add 1 Mm Pyravate and 4 mM Glutamine before use |
| 22G x 1 1/2 needle | BD | 305156 | |
| pepstatin A | Sigma | P5318 | |
| leupeptin | Sigma | L2884 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| DTT | Sigma | 43819 | |
| ALLN | Sigma | A6185 | |
| Nitrocellulose membrane | GE | RPN3032D | |
| EDTA Solution 0.5 M PH8.5 100 ml | VWR | 82023-102 | |
| EGTA 0.5 M sterile (PH 8.0) 50 ml | Fisher Scentific | 50255956 | |
| HyClone FBS | Thermo scientific | SH3007103 | |
| glycerol | Sigma | G5516 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| bromophenol blue | Sigma | B8026 | |
| prolong gold antifade reagent with dapi | life technologies | P36935 | |
| L-glutamine (200 mM) | life technologies | 25030081 | |
| sodium pyruvate | life technologies | 11360-070 |
References
- Ru, P., Williams, T. M., Chakravarti, A., Guo, D. Tumor metabolism of malignant gliomas. Cancers (Basel). 5, 1469-1484 (2013).
- Moon, Y. A., et al. The Scap/SREBP pathway is essential for developing diabetic fatty liver and carbohydrate-induced hypertriglyceridemia in animals. Cell metabolism. 15, 240-246 (2012).
- Guo, D., Bell, E. H., Chakravarti, A. Lipid metabolism emerges as a promising target for malignant glioma therapy. CNS Oncology. 2, 289-299 (2013).
- Guo, D., et al. The AMPK agonist AICAR inhibits the growth of EGFRvIII-expressing glioblastomas by inhibiting lipogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 12932-12937 (2009).
- Menendez, J. A., Lupu, R. Fatty acid synthase and the lipogenic phenotype in cancer pathogenesis. Nat Rev Cancer. 7, 763-777 (2007).
- Guo, D., Cloughesy, T. F., Radu, C. G., Mischel, P. S. AMPK: A metabolic checkpoint that regulates the growth of EGFR activated glioblastomas. Cell Cycle. 9, 211-212 (2010).
- Goldstein, J. L., DeBose-Boyd, R. A., Brown, M. S. Protein sensors for membrane sterols. Cell. 124, 35-46 (2006).
- Shao, W., Espenshade, P. J. Expanding Roles for SREBP in Metabolism. Cell metabolism. 16, 414-419 (2012).
- Nohturfft, A., Zhang, S. C. Coordination of lipid metabolism in membrane biogenesis. Annual review of cell and developmental biology. 25, 539-566 (2009).
- Jeon, T. I., Osborne, T. F. SREBPs: metabolic integrators in physiology and metabolism. Trends in endocrinology and metabolism: TEM. 23, 65-72 (2012).
- Sato, R., et al. Assignment of the membrane attachment, DNA binding, and transcriptional activation domains of sterol regulatory element-binding protein-1 (SREBP-1). The Journal of biological chemistry. 269, 17267-17273 (1994).
- Sakai, J., Nohturfft, A., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Cleavage of sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs) at site-1 requires interaction with SREBP cleavage-activating protein. Evidence from in vivo competition studies. The Journal of biological chemistry. 273, 5785-5793 (1998).
- Sakai, J., et al. Identification of complexes between the COOH-terminal domains of sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs) and SREBP cleavage-activating protein. The Journal of biological chemistry. 272, 20213-20221 (1997).
- Hua, X., Nohturfft, A., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Sterol resistance in CHO cells traced to point mutation in SREBP cleavage-activating protein. Cell. 87, 415-426 (1996).
- Nohturfft, A., Brown, M. S., Goldstein, J. L. Topology of SREBP cleavage-activating protein, a polytopic membrane protein with a sterol-sensing domain. The Journal of biological chemistry. 273, 17243-17250 (1998).
- Nohturfft, A., Hua, X., Brown, M. S., Goldstein, J. L. Recurrent G-to-A substitution in a single codon of SREBP cleavage-activating protein causes sterol resistance in three mutant Chinese hamster ovary cell lines. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 13709-13714 (1996).
- Espenshade, P. J., Hughes, A. L. Regulation of sterol synthesis in eukaryotes. Annu Rev Genet. 41, 401-427 (2007).
- Yang, T., et al. Crucial step in cholesterol homeostasis: sterols promote binding of SCAP to INSIG-1, a membrane protein that facilitates retention of SREBPs in ER. Cell. 110, 489-500 (2002).
- Yabe, D., Brown, M. S., Goldstein, J. L. Insig-2, a second endoplasmic reticulum protein that binds SCAP and blocks export of sterol regulatory element-binding proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 12753-12758 (2002).
- Yabe, D., Xia, Z. P., Adams, C. M., Rawson, R. B. Three mutations in sterol-sensing domain of SCAP block interaction with insig and render SREBP cleavage insensitive to sterols. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 16672-16677 (2002).
- Espenshade, P. J., Li, W. P., Yabe, D. Sterols block binding of COPII proteins to SCAP, thereby controlling SCAP sorting in ER. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11694-11699 (2002).
- Nohturfft, A., Yabe, D., Goldstein, J. L., Brown, M. S., Espenshade, P. J. Regulated step in cholesterol feedback localized to budding of SCAP from ER membranes. Cell. 102, 315-323 (2000).
- Sakai, J., et al. Sterol-regulated release of SREBP-2 from cell membranes requires two sequential cleavages, one within a transmembrane segment. Cell. 85, 1037-1046 (1996).
- Wang, X., Sato, R., Brown, M. S., Hua, X., Goldstein, J. L. SREBP-1, a membrane-bound transcription factor released by sterol-regulated proteolysis. Cell. 77, 53-62 (1994).
- Brown, M. S., Goldstein, J. L. A proteolytic pathway that controls the cholesterol content of membranes, cells, and blood. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 11041-11048 (1999).
- Rawson, R. B., DeBose-Boyd, R., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Failure to cleave sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs) causes cholesterol auxotrophy in Chinese hamster ovary cells with genetic absence of SREBP cleavage-activating protein. J Biol Chem. 274, 28549-28556 (1999).
- Zelenski, N. G., Rawson, R. B., Brown, M. S., Goldstein, J. L. Membrane topology of S2P, a protein required for intramembranous cleavage of sterol regulatory element-binding proteins. J Biol Chem. 274, 21973-21980 (1999).
- Goldstein, J. L., Brown, M. S. A Century of Cholesterol and Coronaries: From Plaques to Genes to Statins. Cell. 161, 161-172 (2015).
- Espenshade, P. J., Cheng, D., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Autocatalytic processing of site-1 protease removes propeptide and permits cleavage of sterol regulatory element-binding proteins. The Journal of biological chemistry. 274, 22795-22804 (1999).
- Guo, D. SCAP links glucose to lipid metabolism in cancer cells. Mol Cell Oncol. 3, (2016).
- Cheng, C., et al. Glucose-Mediated N-glycosylation of SCAP Is Essential for SREBP-1 Activation and Tumor Growth. Cancer Cell. 28, 569-581 (2015).
- Shao, W., Espenshade, P. J. Sugar Makes Fat by Talking to SCAP. Cancer Cell. 28, 548-549 (2015).
- Guo, D., et al. EGFR signaling through an Akt-SREBP-1-dependent, rapamycin-resistant pathway sensitizes glioblastomas to antilipogenic therapy. Sci Signal. 2, 82 (2009).
- Guo, D., et al. An LXR agonist promotes GBM cell death through inhibition of an EGFR/AKT/SREBP-1/LDLR-dependent pathway. Cancer Discov. 1, 442-456 (2011).
- Guo, D., Bell, E. H., Mischel, P., Chakravarti, A. Targeting SREBP-1-driven lipid metabolism to treat cancer. Curr Pharm Des. 20, 2619-2626 (2014).
- Bell, E. H., Guo, D. Biomarkers for malignant gliomas. Malignant Gliomas, Radiation Medicine Rounds. 3, 339-357 (2012).
- Geng, F., et al. Inhibition of SOAT1 suppresses glioblastoma growth via blocking SREBP-1-mediated lipogenesis. Clin Cancer Res. , (2016).
- Ru, P., et al. Feedback Loop Regulation of SCAP/SREBP-1 by miR-29 Modulates EGFR Signaling-Driven Glioblastoma Growth. Cell Rep. , (2016).
- Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition). , (2012).
- Uehara, T., et al. S-nitrosylated protein-disulphide isomerase links protein misfolding to neurodegeneration. Nature. 441, 513-517 (2006).
- Miyashita, T. Confocal microscopy for intracellular co-localization of proteins. Methods Mol Biol. 1278, 515-526 (2015).
- Cao, J., Guo, S., Arai, K., Lo, E. H., Ning, M. Studying extracellular signaling utilizing a glycoproteomic approach: lectin blot surveys, a first and important step. Methods Mol Biol. 1013, 227-233 (2013).
