Vi beskriver en modificeret fremgangsmåde til membranfraktion isoleret fra humane celler og prøveforberedelse til påvisning af SCAP N -glycosylation og totalt protein ved hjælp af Western blot. Vi yderligere indføre en metode GFP-mærkning for at overvåge SCAP menneskehandel hjælp konfokal mikroskopi. Denne protokol kan bruges i almindelige biologiske laboratorier.
Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of membrane-bound transcription factors controlling the expression of genes important for the synthesis of cholesterol, fatty acids and phospholipids, are frequently upregulated in these diseases. In the process of SREBP nuclear translocation, SREBP-cleavage activating protein (SCAP) plays a central role in the trafficking of SREBP from the endoplasmic reticulum (ER) to the Golgi and in subsequent proteolysis activation. Recently, we uncovered that glucose-mediated N-glycosylation of SCAP is a prerequisite condition for the exit of SCAP/SREBP from the ER and movement to the Golgi. N-glycosylation stabilizes SCAP and directs SCAP/SREBP trafficking. Here, we describe a protocol for the isolation of membrane fractions in human cells and for the preparation of the samples for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further provide a method to monitor SCAP trafficking by using confocal microscopy. This protocol is appropriate for the investigation of SCAP N-glycosylation and trafficking in mammalian cells.
Deregulering af lipid metabolisme er et fælles kendetegn for kræft og metaboliske sygdomme 1-6. I disse processer sterol regulatorisk element-bindende proteiner (SREBPs), en familie af transkriptionsfaktorer, spiller en kritisk rolle i at kontrollere ekspressionen af gener vigtige for indførelsen og syntesen af cholesterol, fedtsyrer og phospholipider 7-10.
SREBPs, herunder SREBP-1a, SREBP-1c, og SREBP-2, syntetiseres som inaktive forstadier, der binder til det endoplasmatiske reticulum (ER) membran i kraft af to transmembrandomæner 7. N-terminalen af SREBPs indeholder et DNA-bindende domæne for transaktivering af målgener 11. Den C-terminale ende af SREBP forstadier bindes til SREBP spaltning-aktiverende protein (SCAP) 12,13, en polytopic membran protein, der spiller en central rolle i reguleringen af SREBP stabilitet og aktivering 14-16.
Den gennemførelførelsen af transkriptionel funktion kræver translokation af SCAP / SREBP kompleks fra ER til Golgi, hvor to proteaser sekventielt spalte SREBP og frigive dets N-terminalt fragment, som derefter træder ind i kernen for transaktivering af lipogene gener 7. I disse processer niveauerne af steroler i ER-membranen styre afgangen fra SCAP / SREBP kompleks fra ER 7,17. Under høje sterol betingelser, sterol binder til SCAP eller ER-resident insulin-induceret gen-protein-1 (INSIG-1) eller -2 (INSIG-2), øge associeringen af SCAP med Insigs der bevarer SCAP / SREBP kompleks i ER 18-20. Når sterol niveauet falder, SCAP dissocieres med Insigs. Dette fører til en SCAP konformationel ændring, som tillader SCAP interaktion med fælles kappeproteiner (COP) II-komplekset. Komplekset medierer inkorporeringen af SCAP / SREBP kompleks i den spirende vesikler og dirigerer sin transport fra ER til Golgi 21,22. Ved translocation til Golgi, er SREBPs sekventielt spaltes af anlægsområde 1 og site-2 proteaser, hvilket fører til frigivelse af N-terminalen 7,23-29.
SCAP protein bærer tre N-forbundet oligosaccharider på asparagin (N) positioner N263, N590, og N641 15. Vi viste for nylig, at glucose-medieret N -glycosylation af SCAP i disse steder er en forudsætning for SCAP / SREBP handel fra ER til Golgi under lave sterol betingelser 30-32. Tab af SCAP glykosylering via mutation af alle tre asparagin til glutamin (NNN til QQQ) deaktiverer handelen med det SCAP / SREBP kompleks og resulterer i ustabilitet SCAP protein og reduktion af SREBP aktivering 31. Vores seneste data viser også, at SREBP-1 er stærkt aktiveret i glioblastom og reguleret af SCAP N -glycosylation 4,31,33,34. Målretning SCAP / SREBP-1 signalering fremstår som en ny strategi til at behandle maligniteter og metaboliske syndromes 1,3,35-38. Derfor er det vigtigt at udvikle en effektiv metode til at analysere SCAP protein og N -glycosylation niveauer, og overvåge dens handel med humane celler og patientens væv.
Den luminale region SCAP protein (aminosyrer 540-707) i ER indeholder to N -glycosylation steder (N590 og N641), der er beskyttet mod proteolyse når intakte membraner behandles med trypsin 15. Denne luminale fragmentet har en molekylvægt på ~ 30 kDa, der er lille nok til at tillade opløsningen af individuelle glycosylerede varianter af SCAP ved natriumdodecylsulfat polyacrylamid gel elektroforese (SDS-PAGE) 15,31. Her giver vi en metode til at påvise N -glycosylation af SCAP og det totale protein i humane celler. Denne protokol er afledt af den beskrevet i publikationer fra Brown og Goldstein laboratorium 15 og vores nylige publikation 31-metoden. Protokollen kan bruges i than studerer af SCAP protein fra pattedyrceller.
I denne undersøgelse beskriver vi en protokol til isolering af membran fraktioner i humane celler og til udarbejdelse af prøverne til påvisning af SCAP N -glycosylation og total protein ved hjælp af Western blot. Vi tilbyder endvidere en metode til at overvåge SCAP handel ved hjælp af GFP-mærkning og konfokal mikroskopi. Den metode anvendes til at analysere membranprotein og er et vigtigt redskab til at undersøge SCAP N -glycosylation og menneskehandel.
Sammenlignet…
The authors have nothing to disclose.
We are grateful to Drs. Mike S. Brown and Joseph L. Goldstein for their agreement to publish this method according to the methods described in their publications. We appreciate Dr. Peter Espenshade for sharing the GFP-SCAP plasmid. This work was supported by NIH grants NS072838 and NS079701 to D.G., American Cancer Society Research Scholar Grant RSG-14-228-01-CSM to D.G., and OSUCCC Pelotonia Postdoctoral Fellowship to C.C. We also appreciate the support from the Ohio State Neuroscience Core (P30 NS038526) and OSUCCC Translational Therapeutic Program seed grant and start-up funds to D.G.
X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent | Roche | 6366236001 | |
Opti-MEMI medium | Life Technologies | 31985-070 | |
trypsin | Sigma | T6567 | |
soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9777 | |
PNGase F | Sigma | P7367 | |
Anti-SCAP (9D5) antibody | Santa Cruz | sc-13553 | |
GFP antibody | Roche | 11814460001 | |
SREBP-1 antibody (IgG-2A4) | BD Pharmingen | 557036 | |
PDI Antibody (H-17) | Santa Cruz | sc-30932 | |
Lamin A Antibody (H-102) | Santa Cruz | sc-20680 | |
SCAP antibody (a.a 450-500) | Bethyl Laboratories, Inc. | A303-554A | |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) without glucose, pyruvate and glutamine | Cellgro | 17-207-CV | Add 1 Mm Pyravate and 4 mM Glutamine before use |
22G x 1 1/2 needle | BD | 305156 | |
pepstatin A | Sigma | P5318 | |
leupeptin | Sigma | L2884 | |
PMSF | Sigma | P7626 | |
DTT | Sigma | 43819 | |
ALLN | Sigma | A6185 | |
Nitrocellulose membrane | GE | RPN3032D | |
EDTA Solution 0.5 M PH8.5 100 ml | VWR | 82023-102 | |
EGTA 0.5 M sterile (PH 8.0) 50 ml | Fisher Scentific | 50255956 | |
HyClone FBS | Thermo scientific | SH3007103 | |
glycerol | Sigma | G5516 | |
β-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
bromophenol blue | Sigma | B8026 | |
prolong gold antifade reagent with dapi | life technologies | P36935 | |
L-glutamine (200 mM) | life technologies | 25030081 | |
sodium pyruvate | life technologies | 11360-070 |