Bu Western blot ile SCAP N -glycosylation ve toplam proteinin belirlenmesi için insan hücrelerinden membran fraksiyonu izolasyonu ve numune hazırlama yönelik değişik bir metot tarif etmektedir. Biz daha konfokal mikroskopi kullanılarak SCAP ticaretini izlemek için bir GFP-etiketleme yöntemi tanıtmak. Bu protokol, normal bir biyolojik laboratuvarlarda kullanılabilir.
Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of membrane-bound transcription factors controlling the expression of genes important for the synthesis of cholesterol, fatty acids and phospholipids, are frequently upregulated in these diseases. In the process of SREBP nuclear translocation, SREBP-cleavage activating protein (SCAP) plays a central role in the trafficking of SREBP from the endoplasmic reticulum (ER) to the Golgi and in subsequent proteolysis activation. Recently, we uncovered that glucose-mediated N-glycosylation of SCAP is a prerequisite condition for the exit of SCAP/SREBP from the ER and movement to the Golgi. N-glycosylation stabilizes SCAP and directs SCAP/SREBP trafficking. Here, we describe a protocol for the isolation of membrane fractions in human cells and for the preparation of the samples for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further provide a method to monitor SCAP trafficking by using confocal microscopy. This protocol is appropriate for the investigation of SCAP N-glycosylation and trafficking in mammalian cells.
Lipid metabolizması deregülasyon kanseri ve metabolizma hastalıkları 1-6 ortak bir özelliğidir. Bu işlemlerde, sterol düzenleyici elementi bağlayan proteinler (SREBPs), transkripsiyon faktörleri ailesidir, alım ve kolesterol, yağlı asitlerin sentezi ve fosfolipid 7-10 önemli genlerin ekspresyonunu kontrol etmede çok önemli bir rol oynar.
SREBP-1 a, SREBP-1 c ve SREBP-2 de dahil olmak üzere SREBPs, iki transmembran 7 sayesinde endoplazmik retikulum (ER) zarına bağlanan etkin olmayan öncüler olarak sentezlenir. SREBPs N-terminali, hedef genlerinin 11 transaktivasyonu için bir DNA-bağlama alanını içerir. SREBP öncülerinin C-terminali SREBP bölünmesi aktive edici protein (SCAP) 12,13, SREBP stabilitesi ve aktivasyon 14-16 düzenlenmesinde çok önemli bir rol oynayan bir politopik membran proteinine bağlanır.
implementranskripsiyonel fonksiyonunun yon iki proteazlar ardışık SREBP ayrılması ve daha sonra lipojenik genlerin 7 transaktivasyonu için çekirdeğin içine girer N-terminal fragmanı serbest Golgi, ER SCAP / SREBP kompleksinin, gerektirir. Bu işlemlerde, ER membran sterol seviyeleri ER 7,17 den SCAP / SREBP kompleksinin çıkış kontrol eder. Yüksek sterol koşullar altında, sterol Scap veya ER yerleşik bağlanan insülin ile uyarılan gen proteini-1 (INSIG-1) veya 2 (INSIG-2), içinde SCAP / SREBP kompleksi korumak Insigs ile Scap ilişkisini arttırıcı ER 18-20. sterol düzeyleri azalma olduğunda, SCAP Insigs ile ayrışmaktadır. Bu ortak kaplama proteinleri (COP) II kompleksi ile SCAP etkileşim sağlayan bir SCAP konformasyonel değişime yol açar. Karmaşık tomurcuklanma vezikülleri içine SCAP / SREBP kompleksi dahil edilmesine aracılık eder ve Golgi 21,22 ER; nakliye yönlendirir. TRANSLOC üzerineGolgi ation, SREBPs ardışık N-terminali 7,23-29 serbest kalmasına yol, alana, 1 ve-2 proteaz tarafından ayrılmaktadır.
SCAP proteini N asparajinde oligosakkaritler -bağlı üç taşır (N) N263, N590, N641 ve 15 konumlandırır. Biz son zamanlarda bu sitelerde SCAP glukoz aracılı N -glycosylation düşük sterol koşullarında 30-32 altında Golgi ER SCAP / SREBP kaçakçılığı için bir ön koşul olduğunu ortaya koymuştur. (NNN qqq için) glutamin için üç asparagin mutasyon yoluyla SCAP glikosilasyon kaybı SCAP protein ve SREBP aktivasyon 31 azaltılması istikrarsızlık SCAP / SREBP kompleksinin ve sonuçların ticaretini devre dışı bırakır. Bizim son veriler de bu SREBP-1 yüksek glioblastoma aktive ve SCAP N -glycosylation 4,31,33,34 tarafından düzenlenir göstermektedir. Hedefleme SCAP / SREBP-1 sinyal maligniteler ve metabolik s tedavisinde yeni bir strateji olarak ortaya çıkmaktadır1,3,35-38 yndromes. Bu nedenle, SCAP proteini ve N -glycosylation düzeylerini analiz etmek ve insan hücreleri ve hasta dokularda kaçakçılığı izlemek için etkin bir yöntem geliştirmektir önemlidir.
ER 'in içinde SCAP proteini (amino asitler 540-707) luminal bölgesi sağlam zarları tripsin 15 ile muamele edildiğinde proteoliz korunur iki N -glycosylation sitesi (N590 ve N641) içerir. Bu lümen parçası, sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) 15,31 ile Scap bireysel glikosile varyantlarının çözünürlüğünü sağlamak için yeterince küçüktür ~ 30 kDa'lık bir moleküler ağırlığa sahiptir. Burada, N Scap arasında -glycosylation ve insan toplam hücre proteini tespit etmek için bir yöntem sağlar. Bu protokol, Brown ve Goldstein, laboratuarda 15 ve son yayın 31 'den yayınlarda açıklanan yönteme elde edilir. Protokol t kullanılabilirO memeli hücrelerinden SCAP protein çalışma.
Bu çalışmada, insan hücrelerinde membran fraksiyonlarının izolasyonu için ve Western blot ile SCAP N -glycosylation ve toplam proteinin belirlenmesi için numune hazırlanması için bir protokol açıklar. Biz daha GFP-etiketleme ve konfokal mikroskopi kullanılarak SCAP kaçakçılığı izlemek için bir yöntem sağlar. Yöntem özellikle membran proteini analiz etmek için kullanılan ve SCAP N -glycosylation ve insan ticaretini soruşturma önemli bir araçtır.
<p class="jove_content"…The authors have nothing to disclose.
We are grateful to Drs. Mike S. Brown and Joseph L. Goldstein for their agreement to publish this method according to the methods described in their publications. We appreciate Dr. Peter Espenshade for sharing the GFP-SCAP plasmid. This work was supported by NIH grants NS072838 and NS079701 to D.G., American Cancer Society Research Scholar Grant RSG-14-228-01-CSM to D.G., and OSUCCC Pelotonia Postdoctoral Fellowship to C.C. We also appreciate the support from the Ohio State Neuroscience Core (P30 NS038526) and OSUCCC Translational Therapeutic Program seed grant and start-up funds to D.G.
X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent | Roche | 6366236001 | |
Opti-MEMI medium | Life Technologies | 31985-070 | |
trypsin | Sigma | T6567 | |
soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9777 | |
PNGase F | Sigma | P7367 | |
Anti-SCAP (9D5) antibody | Santa Cruz | sc-13553 | |
GFP antibody | Roche | 11814460001 | |
SREBP-1 antibody (IgG-2A4) | BD Pharmingen | 557036 | |
PDI Antibody (H-17) | Santa Cruz | sc-30932 | |
Lamin A Antibody (H-102) | Santa Cruz | sc-20680 | |
SCAP antibody (a.a 450-500) | Bethyl Laboratories, Inc. | A303-554A | |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) without glucose, pyruvate and glutamine | Cellgro | 17-207-CV | Add 1 Mm Pyravate and 4 mM Glutamine before use |
22G x 1 1/2 needle | BD | 305156 | |
pepstatin A | Sigma | P5318 | |
leupeptin | Sigma | L2884 | |
PMSF | Sigma | P7626 | |
DTT | Sigma | 43819 | |
ALLN | Sigma | A6185 | |
Nitrocellulose membrane | GE | RPN3032D | |
EDTA Solution 0.5 M PH8.5 100 ml | VWR | 82023-102 | |
EGTA 0.5 M sterile (PH 8.0) 50 ml | Fisher Scentific | 50255956 | |
HyClone FBS | Thermo scientific | SH3007103 | |
glycerol | Sigma | G5516 | |
β-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
bromophenol blue | Sigma | B8026 | |
prolong gold antifade reagent with dapi | life technologies | P36935 | |
L-glutamine (200 mM) | life technologies | 25030081 | |
sodium pyruvate | life technologies | 11360-070 |