kan undersökas rollen av sortiment (rumslig segregation) i evolutionära scenarier med enkla mikrobiella system i laboratoriet som tillåter kontrollerad justering av rumsliga fördelning. Genom att modifiera grundare celldensitet, kan olika sortiment nivåer visualiseras med hjälp av fluorescerande bakteriestammar i kolonin biofilmer av Bacillus subtilis.
Microbes provide an intriguing system to study social interaction among individuals within a population. The short generation times and relatively simple genetic modification procedures of microbes facilitate the development of the sociomicrobiology field. To assess the fitness of certain microbial species, selected strains or their genetically modified derivatives within one population, can be fluorescently labelled and tracked using microscopy adapted with appropriate fluorescence filters. Expanding colonies of diverse microbial species on agar media can be used to monitor the spatial distribution of cells producing distinctive fluorescent proteins.
Here, we present a detailed protocol for the use of green- and red-fluorescent protein producing bacterial strains to follow spatial arrangement during surface colonization, including flagellum-driven community movement (swarming), exopolysaccharide- and hydrophobin-dependent growth mediated spreading (sliding), and complex colony biofilm formation. Non-domesticated isolates of the Gram-positive bacterium, Bacillus subtilis can be utilized to scrutinize certain surface spreading traits and their effect on two-dimensional distribution on the agar-solidified medium. By altering the number of cells used to initiate colony biofilms, the assortment levels can be varied on a continuous scale. Time-lapse fluorescent microscopy can be used to witness the interaction between different phenotypes and genotypes at a certain assortment level and to determine the relative success of either.
Under de senaste decennierna har mikrober erkänts som sociala samhällen som är förknippade med olika ekosystem på jorden 1,2. I motsats till plankton kulturer används i allmänhet laboratoriesed, mikrober i miljön visar ett varierat utbud av rumsliga samhällsstrukturer beroende på den ekologiska inställningen. Enkla mikrobiella system kan användas för att förstå konsekvensen av rumsliga strukturer på utvecklingen av sociala interaktioner 3,4. Publikationer under de senaste 2-3 åren med hjälp av både eukaryota och prokaryota modellsystem betonade effekterna av rumsliga strukturer på stabiliteten av samarbetet inom mikrobiella populationer 5-8. Dessutom förpliktar interaktioner mellan mikrober, t.ex. metabolisk tvärmatning kan också ändra den geografiska fördelningen av samverkande partner 9-11. Inverkan av rumslig struktur i dessa studier är oftast undersöktes med användning av ytan fäst fastsittande celler som lever i såsom brukar kallas biofilmer eller i kolonier som växer på ytan av ett agarsubstrat. Genetisk drift resulterar i hög rumslig sortiment kan observeras i mikrobiella kolonier där närings utarmning vid kanten av en celldelning medieexpansionsresulterar i serie av genetiska flaskhalsar som orsakar hög lokal fixering sannolikheten för vissa klonala linages 12. Genetisk drift kan därför användas för att undersöka betydelsen av rumslig segregation i mikrobiella kolonier.
I miljön, biofilmer är flerarts samhällen omgivna av egenproducerade polymermatris 13. Biofilm struktur, funktion och stabilitet är beroende av ett komplext nätverk av sociala interaktioner där bakterier utbyta signaler, matriskomponenter och resurser, eller tävla om utrymmet och näringsämnen med hjälp av gifter och antibiotika. Bacillus subtilis är en jordlevande och rot-koloniserande bakterie som utvecklar mycket organiserade biofilm samhällen 14. I analogi med socialinsekter, B. subtilis-celler använder en arbetsfördelning strategi, utveckling av subpopulationer av extracellulära matrix producenter och kannibaler, rörliga celler, vilande sporer och andra celltyper 15,16. Differentieringsprocessen är dynamisk och kan förändras genom miljöförhållanden 17,18.
Strategier för ytan kolonisering av bakterier lätt kan manipuleras under laboratorieförhållanden genom att ändra agar koncentrationen i tillväxtmediet. Vid låga agar nivåer (0,2-0,3%), bakterier som härbärgerar aktiv flag kan simma, medan halvfast agar (0,7-1% agar) underlättar flagellum driven samhälle sprider sig, kallas vimlar 19-21. I avsaknad av flagellum, vissa bakteriestammar kan röra sig över halvfast medium via skjutdörrar, dvs tillväxt beroende befolknings expansionen underlättas av exopolysackarid matris och andra utsöndrade hydrofobin föreningar 22-24. Slutligen bakterier som är capable av biofilm utveckling bildar arkitektoniskt komplexa kolonier på hårt agarmedium (1,2-2%) 14,17,25. Medan dessa egenskaper undersöks i laboratoriet genom att finjustera villkoren i naturliga livsmiljöer dessa utanpå sprida strategier kanske transitering gradvis från en till en annan beroende på miljöförhållanden 26. Även enstaka cellbaserad motilitet är kritisk under initiering av biofilm utveckling vid luft-vätske-gränssnitt i både grampositiva och -negativa bakterier 27 komplexa koloni biofilmer B. subtilis påverkas inte av strykningen av flagellar rörlighet 28. Men fysisk planering under utvecklingen av B. subtilis koloni biofilmer beror på tätheten av bakterie inokulum användes för att initiera biofilm 8.
Här använder vi B. subtilis för att visa att rumslig segregation under ytan kolonisering beror på mekanismen för befolkningsnivå motility (dvs. svärma eller glidande), och koloni biofilm utveckling är beroende av grundaren celltätheten. Vi presenterar ett fluorescerande mikroskopi verktyg som kan användas för att kontinuerligt övervaka mikrobiell biofilm tillväxt, yta kolonisering och sortiment på makroskala. Vidare är en kvantifiering metod som presenteras för att bestämma den relativa påfrestningen överflöd i befolkningen.
Tillgängligheten av en fluorescerande verktygslåda för bakterier underlättar inte bara studiet av heterogena genuttryck 30,31 och proteinlokalisering 32, utan även den analys av rumsliga fördelningen av stammar inom en population 8. Fluorescerande markörer med tillräckligt olika excitations- och emissionsvåglängder gör det möjligt att tydligt lokalisera två stammar som annars inte kan skiljas från varandra när de blandas. Det beskrivna protokollet kan användas för att observera populationsdynamik i blandade kulturer, t.ex. konkurrensexperiment eller synergism mellan stammar eller arter. Förmågan att bestämma de relativa förekomsten av fluorescerande stammar i en blandad population är inte begränsad till ytan fäst myllrande, glidande, eller biofilm kolonier, men kan också användas för andra flercelliga biofilmsystem, inklusive nedsänkt, flödescell eller luftmedel gränssnitt Biofilms 27,33-35.
_content "> Medan den presenterade tekniken är ett kraftfullt verktyg för att upptäcka geografiska fördelningen av stammar och utformning konkurrensexperiment, gör det också följande genuttryck heterogenitet i expanderande kolonier. De odlingsbetingelser som beskrivs här gäller för B. subtilis och de exakta parametrar för expansion på agar media kan kräva optimering för andra arter eller stammar 20. Placera proverna i en inkubation kammare medan avbildning tillåter försöksledaren att följa populationsdynamik i tid, även om uppmärksamhet bör ägnas åt fuktnivån i kammaren under inkubation.De tekniker som beskrivs här kräver också genetisk modifiering av de undersökta bakteriestammarna så att stammarna uttrycker fluorescerande markörer som kan särskiljas från varandra. Dessutom, förutom att ha distinkt excitation och emissionsspektra, rekommenderas att de två valda fluorescerande markörer har liknande quantum avkastning (dvs. förhållandet mellan absorberade fotoner som avges) och uttrycks i en jämförbar nivå. Dessutom kan de relativa intensitetsförändringar i tiden mätas och normaliseras till en tidig tid-punkten för ett experiment. Den relativa ökningen eller minskningen kan sedan jämföras mellan olika fluoroforer med olika kvantverkningsgrader. För den presenterade experimentella system har olika grön- och röd-fluorescerande proteiner testas tidigare 36,37 för att välja de mest optimala fluorescerande par som kan detekteras i B. subtilis. Den optimala exponeringstiden bör bestämmas för varje fluorescerande protein och prov. Vissa densiteter cell eller flera lager av celler kan krävas för att detektera signalen effektivt inom befolkningen. Vissa fluorescerande proteiner kan ha låga intensiteter i bakteriecellerna på grund av ineffektiv uttryck och / eller translation av proteinet och därmed låg kvantutbyte. Sådana ineffektiva fluorescerande markörer kunde rHÄRLEDA känsligheten av systemet och förlänga den tid som krävs för att detektera bakteriestammarna eventuellt resulterar i cytotoxicitet av excitationsljuset. De fluorescerande intensiteter kan följaktligen modifieras genom att förändra promotorn används för att uttrycka fluorescerande reporter kodningsgenen. En uttrycksnivå som är för hög kan resultera i onödig överproduktion av det fluorescerande proteinet som leder till skadliga fitness kostnader för bakterien. När man utför konkurrensexperiment, bör en överväga kostnaden av en särskild fluorescerande proteinproduktionen i cellerna. Kontrollexperiment, där de fluorescerande markörerna swappas mellan tävlade stammar eller där två isogena stammar skiljer sig endast i deras fluorescerande markörer tävlade mot varandra, är alltid skyldiga att fastställa någon bias mot en markör. Livslängder av fluorescerande proteiner i cellerna kan också påverka den uppmätta intensitet. Dessutom autofluorescens av vissa bakterie arters kan kräva användningen av olika andra än vad som beskrivs här fluorescerande markörer.
För att exakt bestämma den rumsliga fördelningar och bestånd av de distinkta bakteriestammar bör bakgrundssignalen som härrör från den första fluorescerande proteinet när du använder fluorescensfilter för andra fluorescerande markör och vice versa individuellt testas på monokultur prover (innehållande bakterier som producerar endast en markör ). Detta medger att subtraktion av överlappande fluorescerande signalintensiteterna. Viktigare, eftersom stereomikroskopet registrerar fluorescenssignalen från ovan den expanderande koloni, är den presenterade protokollet bekvämt att bestämma det rumsliga arrangemanget i två dimensioner. Arkitekturen hos den expanderande bakteriepopulation skulle kunna resultera i varierande fluorescensnivåer (dvs. rynkor liknande strukturer kan innehålla fler celler som uppvisar högre lokala fluorescensintensiteter). Därför är den beskrivna analysen av bilderna determines den rumsliga fördelningen, men inte det överflöd av stammarna inom en viss plats. Föregående protokollen beskrev provberedning för svärma 20 eller fluorescens avbildning av populationsdynamik i bakteriekolonier 38, men våra protokoll kombinerar dessa tekniker. Andra mikroskopi tekniker som möjliggör observation av tredimensionella upplösning av befolkningsstrukturen (t.ex. konfokala laserskanning mikroskopi 39,40 eller strukturerad belysning mikroskopi 41) kan användas för prover med högre strukturella komplexitet. Dessa ytterligare tekniker stöder också enstaka cellbaserad detektering av stammar 31 som inte är tillgänglig med hjälp av stereomikroskop.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete har finansierats av bidrag KO4741 / 3-1 från Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Vidare var laboratorium Á.TK stöds av ett Marie Skłodowska Curie karriär integrationsbidrag (PheHetBacBiofilm) och ge KO4741 / 2-1 från DFG. TH, AD, RG-M., Och EM stöddes av International Max Planck Research School, Alexander von Humboldt-stiftelsen, Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología-tyska tjänsten för akademiskt utbyte (CONACYT-DAAD), och JSMC stipendier, respektive.
Lennox Broth (LB) | Carl Roth GmbH | X964 | |
Agar-agar, Kobe I | Carl Roth GmbH | 5210 | |
Petri dish (90 mm diameter) | any | NA | Use Petri dishes without ventillation cams |
Petri dish (35 mm diameter) | any | NA | Use Petri dishes without ventillation cams |
Difco Nutrient Broth | BD Europe | 234000 | |
KCl | any | NA | |
MgSO4 7H2O | any | NA | |
Ca(NO3)2 4H2O | any | NA | |
MnCl24H2O | any | NA | |
FeSO4 | any | NA | |
D-Glucose | any | NA | |
Fluorescence AxioZoom V16 time-lapse microscope | Carl Zeiss Microscopy GmbH | see bellow detailed description | |
AxioZoom V16 Microscope body | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435080 9030 000 | |
Phototube Z 100:0 for Axio Zoom V16 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435180 9020 000 | without eyepieces |
Fluar Illuminator Z mot Fluorescence intermediate tube for Axio Zoom.V16 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435180 9060 000 | |
Controller EMS 3 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435610 9010 000 | |
System Control Panel SYCOP 3 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435611 9010 000 | |
Reflector module Z | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435180 9160 000 | For Fluar Illuminator Z mot on Axio Zoom.V16 and SYCOP 3 |
Filter set 38 HE eGFP shift free (E) | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 489038 9901 000 | EX BP 470/40, BS FT 495, EM BP 525/50 |
Filter set 63 HE mRFP shift free (E) | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 489063 0000 000 | EX BP 572/25, BS FT 590, EM BP 629/62 |
Mount S | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435402 0000 000 | |
Objektive PlanApo Z 0,5x/0,125 FWD 114mm | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435280 9050 000 | 164mm parfocal length; M62x0.75 thread at front |
Coarse/fine drive with profile column | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435400 0000 000 | 490 mm, 10kg load capacity, compatible with stand bases 300/450 |
Stand base 450 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435430 9902 000 | |
Cold-light source Zeiss CL 9000 LED CAN | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435700 9000 000 | |
CAN-bus cable | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 457411 9011 000 | 2.5 m length |
Slit-ring illuminator | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 417075 9010 000 | d=66 mm |
Flexible light guide 1500 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 417063 9901 000 | 8/1000 mm |
Illumination Adapter for light guide | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 000000 1370 927 | |
Lightguide HXP with liquid fill | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 000000 0482 760 | ø3mm x 2000mm |
Camera Adapter 60N-C | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 426113 0000 000 | 2/3" 0.63x |
High Resolution Microscopy Camera AxioCam MRm Rev. 3 FireWire | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 426509 9901 000 | |
AxioCam FireWire Trigger Cable Set | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 426506 0002 000 | for direct shutter synchronization |
ZEN pro 2012 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 410135 1002 120 | Blue edition, requires min. Windows 7 64-bit |
ZEN Module Time Lapse | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 410136 1031 110 | |
Standard Heating Stage Top Incubator | Tokai Hit | INUL-MS1-F1 | |
Zeiss Stereo Microscope Base Adapter | Tokai Hit | MS-V12 | |
Softwares | |||
Image J | National Institute of Health, Bethesda, MD, USA | v 1.49m | |
BioVoxxel plugin | BioVoxxel | http://www.biovoxxel.de/development/ |