Summary
هنا، نقدم بروتوكول لرسم الخرائط البصرية من النشاط الكهربائي من الأذين الأيمن الماوس وخصوصا العقدة الأذينية، في القرار المكانية والزمانية عالية.
Protocol
أجريت جميع التجارب وفقا لالمعاهد الوطنية للصحة الدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية (NIH حانة رقم 80-23). وقد تمت الموافقة على جميع الطرق والبروتوكولات المستخدمة في هذه الدراسات من قبل جامعة ويسكونسن جنة رعاية الحيوان واستخدام بروتوكول التالية المبادئ التوجيهية لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية التي نشرتها المعاهد الوطنية للصحة (منشورات رقم 85-23، منقحة 1996). وتلقى جميع الحيوانات المستخدمة في هذه الدراسة الرعاية الإنسانية وفقا لدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية.
1. إزالة القلب وLangendorff الإرواء
- قبل عزلة القلب، دافئ حل تايرود إلى 37 درجة مئوية باستخدام حمام مائي وسترة المياه.
- تخدير الفأر مع 5٪ الأيزوفلورين / 95٪ O 2.
- ضمان مستوى مناسب من التخدير عن طريق التحقق من فقدان المنعكس الألم.
- أداء بضع الصدر. فتح الصدر باستخدام المنحنية 5.5 "مقص مايو و 5.5" كيلي مرقئ لالفطر الابيض لجعل 1 سم قطع في الجزء الأمامي من الصدر.
- استخراج بسرعة القلب من الصدر (في غضون 30 ثانية). استخدام 4 "منحني ملقط ايريس للاستيلاء على أنسجة الرئة وقطع الرئة والغدة الصعترية والقلب معا مع التامور باستخدام 4.3" مقص ايريس. لا انتزاع القلب مباشرة.
- غسله في الاوكسيجين (95٪ O 2/5٪ CO 2)، ثابتة في درجة الحرارة (36.8 ± 0.4 درجة مئوية) تعديل حل تايرود. استخدام التشكيل التالي الحل (مم): 128.2 كلوريد الصوديوم، 4.7 بوكل، 1.19 ناه 2 ص 4، 1.05 MgCl 2، 1.3 CaCl 2، 20.0 NaHCO 3، و 11.1 الجلوكوز (الرقم الهيدروجيني 7.35 ± 0.05).
- في حين اغتسل في نفس الحل، وتحديد الرئة والغدة الصعترية، والأنسجة الدهنية. تشريح بعناية لهم من القلب. استخدام المنحني 3 "مقص Vannas-توبنجن و 4.3" # 5 ملقط.
- ثم التعرف على الشريان الأورطي ويقني؛ يدخل القنية فإنه على حسب الطلب 21 G قنية. استخدام اثنين من المنحنية 4.3 "قوة # 5Bملاحظة.
- بعد إقناء؛ إدخال القنية، يروي في وقت واحد (من خلال قنية بمعدل تدفق ~ 5 مل / دقيقة، ويجب أن تعدل هذا بناء على ضغط الأبهر، انظر أدناه) وsuperfuse (في الحمام بمعدل تدفق ~ 50 مل / دقيقة) القلب مع حل تايرود تحسنت وتمت تصفيتها في كافة مراحل التجربة برمتها. تمرير الحل نضح من خلال 11 ميكرون فلتر النايلون في خط لمنع انسداد في الدورة الدموية التاجية.
- باستخدام محول الضغط (أو مقياس الضغط) متصلة عبر 3-الطريقة محبس لور قفل إلى خط التروية، ومراقبة ضغط الشريان الأبهر والحفاظ عليه بين 60 و 80 مم زئبق. ضبط سرعة نضح إذا لزم الأمر للحفاظ على الضغط الأبهري ضمن هذا النطاق.
2. رسم الخرائط البصرية لسان من القلب الجامع perfused Langendorff
- الأجهزة
- وضع القلب أفقيا ويعلقون على قمة البطين إلى أسفل المغلفة السيليكون من الغرفة باستخدام 0.1 ملم دبابيس قطر إلى prevent تيار الناجم عن الحركة أثناء التجربة. 12
- اضافة الى وجود (0.012 "معرف س .005") أنبوب السيليكون الصغيرة في البطين الأيسر (LV) عن طريق الوريد الرئوي، الأذين الأيسر (LA) والصمام التاجي (MV). إصلاح أنبوب عن طريق خياطة الحرير (4-0) إلى النسيج الضام السبر.
- ضع القلب مع واجهاتها الخلفية مواجها لها (الشكل 1A، غادر لوحة).
- دبوس حافة أطرافهم RA (RAA) إلى أسفل السيليكون من الغرفة باستخدام 0.1 مم دبابيس minutien. ضبط مستوى له في أجل جعل السطح الخلفي للRA شقة والسماح لها أن تقع البؤري للكاميرا. وهذا سيمكن القياسات البصرية من المساحة القصوى من الأذين.
- متفوقة الخناق (SVC) وأدنى (IVC) الوريد الأجوف من قبل خياطة الحرير (4-0)، وتمتد ويعلقون على الطرف الآخر من الخيط إلى أسفل غرفة المغلفة السيليكون (انظر الشكل 3A). تأكد من الغرز لا تسدالحقل البصري للعرض.
- ضع سرعة الكهربائي حسب الطلب على حافة RAA. لجعل الأقطاب، واستخدام السيليكون المغلفة 0.25 ملم أسلاك قطرها الفضة، مع 0.5 ملم المسافة بين القطب وخالية من السيليكون لفترة من 1 ملم في نهاية سرعة. ثم وضع اثنين ECG 12 ملم إبرة (29 عيار) أقطاب أحادي بالقرب من قاعدة البطينين الأيمن والأيسر. وضع تخطيط القلب الكهربائي الأرضي بالقرب من قمة البطينين.
- تلطيخ
- لأن كلا من الأصباغ الفلورية والميكانيكية والكهربائية uncoupler blebbistatin هي حساسة للضوء، تنفيذ كافة الإجراءات الموضحة أدناه في غرفة مظلمة. أولا إعداد الحساسة الجهد صبغ RH-237 أو دي-4-ANNEPS كحل الأسهم، 1.25 ملغ / مل في سلفوكسيد ثنائي ميثيل (2.5 ملم)، قسامة عليه (30 ميكرولتر لكل منهما) وتخزين aliquots في -20 درجة مئوية.
- تمييع 5-10 ميكرولتر من محلول المخزون صبغ في 1 مل من درجة حرارة (37 درجة مئوية) حل تايرود ومن ثم حقنه في خط التروية التاجيةعلى مدى فترة من 5-7 دقيقة باستخدام لور ميناء حقن في سطر.
- إعداد blebbistatin كحل الأسهم (2 ملغ / مل في سلفوكسيد ثنائي ميثيل، 6.8 ملم) في وقت مبكر وتخزينها في 4 درجات مئوية.
- بعد 20 دقيقة من الاستقرار، إضافة 0.5 مل من درجة حرارة (37 درجة مئوية) blebbistatin في الإرواء وتمييع 0.1 مل من blebbistatin في 1 مل من درجة حرارة (37 درجة مئوية) حل تايرود. ثم يحقن خط التروية التاجية على مدى فترة من 5-7 دقيقة باستخدام لور ميناء حقن في سطر.
3. رسم الخرائط البصرية لسان من إعداد الرجفان متفرقة
- الأجهزة
- لإعداد الأذيني معزولة، عزل ويقني؛ يدخل القنية القلب كما هو موضح أعلاه في خطوات 1،1-1،5 لإعداد كامل للقلب.
- تشريح البطينين بعيدا عن الجانب الأمامي. انظر الشكل 1A، اللوحة اليمنى، وقطع رقم 1 للاطلاع على التفاصيل.
- فتح RA من خلال قطع فا ثلاثي الشرفLVE (TV) على طول محور TV-SVC. انظر الشكل 1A، اللوحة اليمنى، وقطع رقم 2 لمزيد من التفاصيل.
- قطع أطرافهم وسطي من الانتهائي للعرف لفتح RAA. انظر الشكل 1A، اللوحة اليمنى، وقطع # 3.
- فتح الأمامي الجدار الحر الأذيني عن طريق إجراء قطع من خط الوسط من السابق قطع # 3 إلى حافة الزاوية السفلية اليمنى من RAA، تتسطح ويعلقون على جدار حر الأذيني إلى أسفل غرفة المغلفة السيليكون. رؤية الاتجاه الموضح بالسهم جوفاء في الشكل 1A، وقطع # 4. الحفاظ على حافة النسيج البطين لتعلق إعداد لمنع الأضرار التي لحقت الأذينين.
- وبالمثل، مفتوحة LA من خلال قطع MV على طول الزاوية MV-العليا من أطرافهم LA (LAA).
- لفتح LAA، وقطع من منتصف LAA فتح، من خلال الجدار الحر الأذيني الأمامي حتى قرب حافة الوسطى من LAA.
- فتح الأمامي الأذيني مجانا جدار الونانوغرام نفس الاتجاه، ثم تتسطح ويعلقون عليه في الجزء السفلي من غرفة Sylgard المغلفة.
- جزئيا إزالة الأنسجة الحاجز بين الأذينين. وهذا سوف يقلل تناثر إشارة ضوئية من الأنسجة غير موجود في التركيز. لذلك، فإن كلا من لوس انجليس والتهاب المفاصل الروماتويدي وكذلك SAN وتقاطع atrio البطين (AVJ) يمكن الوصول إليها في هذا الإعداد (الشكل 1B).
- ارفع الإعداد النهائي بنحو 0.5 ملم من الجزء السفلي من الغرفة المغلفة السيليكون من أجل السماح superfusion من كل السطوح النخابية وشغافية.
- Superfuse إعداد مع درجة حرارة (37 درجة مئوية) تايرود حل بمعدل ثابت من ~ 12 مل / دقيقة لتدفق تركيزا تقع بالقرب من SVC و ~ 30 مل / دقيقة لsuperfusion حمام.
- ضع سرعة حسب الطلب حج / أجكل 2 القطب (0.25 مم) على حافة RAA تشريح. ثم وضع اثنين ECG 12 ملم إبرة (29G) الأقطاب الكهربائية (أحادي) بالقرب من RAA وLAA، على التوالي. وضع الأرض ECG المنتخبركب بالقرب من AVJ.
- تلطيخ
- إجراء التطبيق المباشر للصبغة حساسة الجهد (RH-237 أو دي-4-ANNEPS). لهذا، وتمييع 1-2 ميكرولتر من محلول المخزون صبغ في 1 ملم من درجة حرارة (37 درجة مئوية) حل تايرود والافراج عن ببطء الصبغة المخفف على سطح إعداد باستخدام ماصة 1 مم.
- بدلا من ذلك، نفذ تلطيخ الأذيني مع الصبغة الحساسة الجهد من خلال نضح التاجي للقلب perfused Langendorff-مماثلة لتلك المذكورة أعلاه لإعداد كامل للقلب (خطوات 2.2.1-2.2.2).
- بعد تلطيخ التروية التاجية، عزل إعداد الأذيني كما هو موضح. أداء تلطيخ السطح إضافية عند الحاجة للوصول إلى مستوى مضان مرضية. العزلة الأذيني سريعة لا التبييض الصبغة ولا تؤثر على نوعية تلطيخ.
- شل إعداد مع الكهربائية والميكانيكية uncoupler، blebbistatin. تمييع 3-5 ميكرولتر بليbbistatin حل الأسهم في تحسنت (37 ° C) حل تايرود وببطء الافراج عن blebbistatin المخفف على السطح من إعداد وحل المحيطة بها. حيث تبين blebbistatin أن تكون خفيفة حساسة، 13،14 تجنب التعرض الطويل للضوء أثناء إعداد وتلطيخ.
- أداء تطبيق إضافية blebbistatin بقدر اللازمة لقمع الانكماش. عادة ما يصل إلى 3 تطبيقات إضافية (3-5 ميكرولتر لكل تطبيق) يمكن استخدامها لقمع قطعة أثرية الحركة بما فيه الكفاية من أجل إعادة بناء بدقة SAN وتفعيل الأذيني.
- إضافة 0.5 مل إضافية من blebbistatin تحسنت في الإرواء. خلال هذا الإجراء، وقفة superfusion لمدة 30 ثانية للسماح للصبغ / blebbistatin إلى وصمة عار على النسيج الأذيني.
4. رسم الخرائط البصرية محدد حتى
ملاحظة: يتم توفير وصف تفصيلي للنظام رسم الخرائط البصرية في أماكن أخرى 12
- استخدام الكاميرا مع تيمقرار مسامي من 2000 لقطة / ثانية أو أكثر، وسلسلة من العدسات المكثف للوصول إلى القرار المكانية من 100 ميكرون / بكسل أو أعلى. وهذا مطلوب لإعادة تفعيل SAN ونشر intranodal.
- للحد من القطع الأثرية الحركة من حل تهتز، إصلاح غطاء زجاجي صغير على السطح من الحل على القلب / إعداد الأذيني المعزول.
- استخدام ضوء الإثارة (520 ± 45 نانومتر الطول الموجي) التي يقدمها ثابت الجاري، وانخفاض الضوضاء مصابيح الهالوجين. توجيه شعاع ضوء تصفيتها على إعداد باستخدام مرونة دليل ضوء متشعبة.
- تصفية مضان المنبعثة من تمريرة طويلة مرشح (> 715 نانومتر). جمع ورقمنة وحفظ إشارة الفلورية حصلت على برامج الكمبيوتر باستخدام المقدمة من قبل الشركة المصنعة للكاميرا.
5. معالجة البيانات
ملاحظة: يتم جمع البيانات ورسم الخرائط الضوئية وتخزينها على شكل سلسلة من المصفوفات من شدة الفلورسنت في نقاط زمنية مختلفة. كل represe بكسلNTS مقياس كثافة الفلورسنت التي تم جمعها من موقع معين على إعداد الأنسجة عند نقطة زمنية محددة. تتم إزالة مضان الخلفية تلقائيا لكل بكسل للسماح لرؤية أفضل للتغيرات مضان أدى إلى حدوث تغييرات غشاء الجهد ومقلوب لتتوافق مع إمكانات العمل (الجزائرية) تقاس أنظمة مسرى مكروي. وترد تفاصيل الخطوات المختلفة في معالجة البيانات التصوير الضوئي، بما في ذلك تقسيم الصورة، تصفية المكانية، وتصفية الزمانية، وإزالة الانجراف خط الأساس، في استعراض تركيزا. 15
- يدويا أو باستخدام خوارزمية خاصة (على سبيل المثال، العتبة أو حافة كشف) 15 لتحديد حدود الأنسجة، وإنشاء قناع ثنائي 1 (بكسل مدرجة) و0 (بكسل مستبعد)، وتطبيق قناع على كل إطار في التسلسل. هذه العملية يخلق صورة ثنائية الذي يسلط الضوء على مجالات الاهتمام لمزيد من المعالجة.
- لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء من الأراضي الفلسطينية المحتلةالبيانات كال، تصفية الإشارات داخل مناطق مختارة من الفائدة. لهذا، استخدم المكاني (أي المتوسط من بكسل الفلورسنت المجاورة كما هو محدد من قبل بن التفاف المطلوبة أو النواة، على سبيل المثال 3 × 3 أو، للحصول على بيانات صاخبة، 5 × 5) و / أو تصفية الزمنية (على سبيل المثال، بتروورث، نوع تشيبيشيف 1، تشيبيشيف من النوع 2، الاهليلجيه الخ) (الشكل 2). مع الأخذ بعين الاعتبار إمكانية القطع الأثرية التي يسببها المصفاة عند تفسير البيانات. لمزيد من التفاصيل، انظر استعراض 15
- إزالة الانحراف من خط الأساس في التسجيلات البصرية عند الحاجة (باستخدام تمريرة عالية تصفية أو تركيب متعدد الحدود إلى الإشارة الأصلية) ثم تطبيع كل إشارة بكسل من 0 (الحد الأدنى مضان) إلى 1 (الحد الأقصى مضان).
- اختر نافذة الوقت الذي يشمل الأوقات تفعيل كل بكسل لنشر AP واحد. تعيين كل بكسل وقت تفعيله كما في المرة القصوى مشتق upstroke (DF / دينارا كحد أقصى، حيث F هي fluorescenكثافة م). باستخدام جميع الأوقات تفعيل بكسل، وإعادة بناء الخريطة تفعيل متساوي الزمن. وبالتالي فإن كل isochron تظهر بكسل تفعيلها في نفس الوقت.
- لإعادة بناء خريطة التوزيع AP مدة (الهادئ)، لكل بكسل حساب مدة بين وقت التنشيط والوقت عند مستوى معين من عودة الاستقطاب (على سبيل المثال، في 80٪ من عودة الاستقطاب، APD 80). باستخدام كل القيم الهادئ بكسل، إعادة بناء الهادئ توزيع خريطة متساوي الزمن. وبالتالي فإن كل isochron تظهر بكسل مع نفس الهادئ.
- لحساب سرعة التوصيل للAP نشر، تناسب سطح تمهيدا لالبيانات في الوقت تفعيل حساب في 5.4. لهذا، استخدام متعدد الحدود السطح المناسب أو المحلي تمهيد سطح نواة ثم حساب نواقل سرعة التوصيل المحلية من التدرج من سطح المجهزة.
- لإنشاء خريطة عودة الاستقطاب، تعيين كل بكسل وقت عودة الاستقطاب لها، الذي يعرف بأنه الحد الأقصى للالمشتق الثاني (د 2 F / دينارا2) للإشارة الضوئية في نهاية OAP، أو الوقت من 90٪ عودة الاستقطاب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
رسم الخرائط البصرية للSAN سليمة من القلب-perfused Langendorff
ويرد مثال نموذجي لخريطة كنتورية تفعيل RA بناؤها لإيقاع الجيوب الأنفية عفوية في الشكل (3) لقلب فأر perfused Langendorff. يقع النقطة تفعيل المبكرة في المنطقة intercaval بالقرب من SVC حيث يتم تعريف SAN تشريحيا. وتظهر 3،16 اثنين RA خرائط تفعيل كفاف المكتسبة عند 1.0 و 0.5 مللي ثانية معدل أخذ العينات في الشكل 3B.
لتقييم سان سير، قمنا بقياس SAN وقت الاسترداد (SANRT). 9 بعد سرعة RAA لا يقل عن 1 دقيقة في 10-12 هرتز، تم إيقاف التحفيز الكهربائي وحسبت SANRT كما الفاصل الزمني بين وكالة اسوشييتد برس أسر الماضي و أول AP العفوي (الشكل 3C). تم تصحيح SANRT إلى معدل ضربات القلب (أي SANRT <فرعية> ج) عن طريق حساب الفرق بين SANRT وطول دورة الأساس. وبالإضافة إلى ذلك، تم تحديد موقع أول جهاز تنظيم ضربات القلب بعد سرعة. على سبيل المثال، كان SANRTc حوالي 49 مللي ثانية.
تفعيل أتريا وSAN معزولة
يظهر تفعيل إعداد الأذيني المعزول خلال الإيقاع العفوي في الشكل 4A. نشأ في تشريحيا تعريف SAN بالقرب من SVC مع موجة جبهة واسعة امتدت anisotropically في جميع أنحاء RA، مع اتجاهين التوصيل تفضيلية بالقرب من حواف SAN الأعلى والأدنى وكتلة الكامل لاتجاه الحاجز (ملحوظ في خرائط التنشيط في الشكل 4A) . خريطة تفعيل المكتسبة في 1 مللي ثانية معدل أخذ العينات تبين مساحة واسعة من تنشيط مبكر. زيادة في معدل أخذ العينات إلى 0.5 ميللي ثانية و 0.3 ميللي ثانية تتيح لنا التعرف على منطقة محددة من موقع جهاز تنظيم ضربات القلب الرائدة. Wلاحظ ه نموذجي،-فوز إلى فوز موقف أحادية البؤرة المستقر للجهاز تنظيم ضربات القلب الرائدة التي تتوافق مع مجال تنظيم ضربات القلب الابتدائية تتميز سابقا electrophysiologically التي كتبها الميكروية الزجاج 17 ورسم الخرائط البصرية 8-11،18،19 فضلا عن immunolabeling لconnexin45 وHCN4 . 6،16
كما هو موضح سابقا، SAN إمكانات العمل البصرية تتكون من إشارة على مرحلتين والذي يتضمن عنصرين متميزين: المكون SAN ارتفاع ببطء وupstroke الارتفاع السريع لعضلة القلب الأذيني (المكون الأذيني) (الشكل 4B) 20 بسبب تشتت الضوء. العمليات، يمثل OAP النشاط الكهربائي متوسط الناشئة من طبقات متعددة من الخلايا داخل الأنسجة. ويخضع عمق نثر وعرض بواسطة ثابت الفضاء، والتي يتم تحديدها من قبل خصائص نثر وامتصاص الضوء ويمكن أن تصل إلى 1.5-2 مم. بسبب condu SANction تأخير، وSAN AP تسبق دائما النشاط الأذيني خلال تفعيل الفسيولوجية (الشكل 4B). لحساب الانتقال من SAN إلى الأذين (أي SAN وقت التوصيل، SANCT)، استخدمنا إما نقطة زمنية حيث تصل الإشارة SAN المزدوج المكون من 50٪ من السعة عنصر SAN، أو الذروة الأولى للقمة اثنين المشتقة الأولى OAP (DF / دينارا). كان SANCT من منطقة أقرب تفعيل SAN إلى RA ~ 5 ميللي ثانية، مماثلة لتلك التي تقاس الميكروية الزجاج.
SAN وقت الاسترداد
وبالمثل، تم قياس SANRT في إعداد الأذيني معزولة (الشكل 4D). لهذا، تم تيرة الاستعدادات الأذيني في 12 هرتز من خلال القطب سرعة يقع في زاوية من RAA لا يقل عن 1 دقيقة. 9 على سبيل المثال، كان SANRTc حوالي 34 ميللي ثانية، وهو مماثل للأن يقاس في Langendorff-perfused القلب (الشكل 3C). وبالإضافة إلى ذلك، تم تحديد موقع أول جهاز تنظيم ضربات القلب بعد سرعة.
إيقاع القلب ونيون الإشارة الاستقرار على مر الزمن
إذا تم اتباع الإجراءات تحميل الجراحة وصبغ مناسب، لا ينبغي أن يكون هناك أي تغيير كبير في الخصائص الفسيولوجية للالأذين. في الشكل 5، نقدم إيقاع ضربات القلب وقياس قبل وبعد إجراء العزل الأذيني وخلال نضح 3 ساعة. لم يلاحظ أي تغييرات كبيرة في معدل ضربات القلب سواء أثناء العزلة الأذين أو بعد صبغ التحميل.
على الرغم من تلطيخ الشرياني قد تتطلب قدرا أكبر من الصبغة، واستقرار إشارة الفلورسنت في الأنسجة منطقة سان يبدو أن أفضل باستخدام هذه الطريقة التحميل. في الشكل (6)، نقدم إشارة شدة الاضمحلال مع مرور الوقت لكلا تلطيخ التاجي والسطحية. في تي انه SAN الأنسجة، IC 50 (الذي يشير إلى الفترة التي كثافة إشارة والمتوفى إلى 50٪) حوالي 107 دقيقة بعد تلطيخ التاجي، تقريبا مرتين طالما أن من تلطيخ السطح.
الشكل 1: عزل إعداد الرجفان ماوس (أ) العمليات الجراحية أداء لعزل الماوس إعداد الأذيني. يظهر عرض الخلفي للقلب. وتظهر جميع التخفيضات التي كتبها الخطوط الحمراء المنقطة وصفت من قبل أرقام في النظام القيام بها. انظر التفاصيل في النص. (ب) ملخص تخطيطي للمعزولة الماوس إعداد الأذيني تبين الخصائص التشريحية الرئيسية، بما في ذلك هيكل التربيقي من اليسار واليمين الزوائد الأذيني وكذلك موقع العقدة الأذينية (SAN، وصفت من قبل البيضاوي الرمادي). حيث أن جميع الاختصارات في الشكل.tp_upload / 54773 / 54773fig1large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
يتم جمع إشارات الخام والمصنعة المسجلة عند 0.3، 0.5 و 1 مللي / إطار الخام إشارات من بكسل واحد: الرقم 2. بعد 3 × 3 binning، يتم تصفية الإشارات باستخدام المنخفضة تمرير بتروورث الخوارزمية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: رسم الخرائط البصرية الجامعة، قلب SAN (A) اليسار، صورة لإعداد نموذجي يستخدم لرسم الخرائط لسان من القلب سليمة. يظهر مربع أزرق مجال البصريعرض (6 ملم بنسبة 6 ملم). الحق، الحقل البصري للعرض من خلال القبض على الكاميرا وفرضه مع معالم التشريحية. SVC وIVC: متفوقة والوريد الأجوف السفلي. RAA: أطرافهم الأذيني الأيمن. RV وLV: البطينين الأيمن والأيسر. المحاضر الحرفية: الأوردة الرئوية. خرائط (ب) اللون كفاف تفعيل حصلت مع 1.0 مللي ثانية (يسار) و 0.5 مللي ثانية (يمين) معدل أخذ العينات. على حق كل خريطة، المقابلة النطاق الزمني اللون يشير إلى وقت تفعيل الأذيني (من أقرب نقطة تفعيل أظهرت باللون الأزرق، إلى آخر نقطة التنشيط الذي يظهر باللون الأحمر) يظهر. وصفت أقرب موقع تفعيل الأذيني بعلامة النجمة. (C) SAN وقت الاسترداد (SANRT) يقاس في إعداد كامل للقلب. وتظهر الأمثلة النموذجية على الخرائط الكنتورية تفعيل الأذيني بناؤها لتحفيز سرعة الأخيرة (S1) ولأول فوز الأذيني سرعة بعد (A1) للفوز اختيارهم على أثر OAP التمثيلي على القمة.وصفت مواقع أقرب تفعيل الأذيني بعلامة النجمة. بي سي إل: طول دورة الأساسي الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: عالية الدقة ورسم الخرائط البصرية للماوس عقدة الأذينية (SAN) من سطح الشغاف من الأذين المعزولة (A) صورة لإعداد SAN الماوس نموذجي (6 مم × 6 مم) وخرائط لها كفاف المقابلة التنشيط. حصلت على 1.0 ميللي ثانية، 0.5 ميللي ثانية، و 0.3 معدلات أخذ العينات ميللي ثانية. وترد SAN ومنطقة كتلة جار من السهام. جداول زمنية اللون تشير إلى وقت تفعيل الأذيني. النجمة تشير إلى موقع جهاز تنظيم ضربات القلب الرائدة. RAA: أطرافهم الأذيني الأيسر، SVC وINC: متفوقة والوريد الأجوف السفلي، RV: الحق البطين، AVJ: atrio-ventricul ع تقاطع، CT: عرف انتهائي، IAS: الحاجز بين الأذيني. (B) آلية مكونات المزدوجة للتسجيل OAP من الماوس منطقة SAN. انظر التفاصيل في النص. . (C) OAPs سجلت من وسط منطقة SAN (الأزرق)، أقرب الأذيني الموقع الإثارة (الأخضر) وموقع آخر تفعيل RA (الحمراء) الأشكال: الانتقال من العقدي لالموجي الأذيني مع مجموع وقت التوصيل يساوي 5 ميللي ثانية. قارن ذلك مع تأخير الوقت لمجموع تفعيل RA يساوي 11 ميللي ثانية. (D) SAN وقت الاسترداد (SANRT) يقاس في إعداد الأذيني المعزول. وتظهر الأمثلة النموذجية على الخرائط الكنتورية تفعيل الأذيني بناؤها لتحفيز سرعة الأخيرة (S1) ولأول فوز الأذيني سرعة بعد (A1). هو المسمى موقع من أقرب تفعيل الأذيني بعلامة النجمة. بي سي إل - طول دورة الأساسي.ك "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5: قلب إيقاع تقاس قبل وبعد إجراء عزل الأذيني (A) وخلال الإرواء 3 ساعات (B). ويرد (A) معدل ضربات القلب الضرب العفوي قبل وبعد العزلة الأذيني لنوعين من تلطيخ الأذيني: تلطيخ السطح بعد العزلة (أي تلطيخ التاجي مسبق) وتلطيخ التاجي قبل العزلة الأذينية. ويرد (B) العفوي القلب النابض الاستقرار الإيقاع على مدى نضح 3 ساعات للتحضير غير الملطخة الأذيني ولصبغة الفلورسنت وblebbistatin الاستعدادات الأذيني الملون. وتظهر البيانات كمتوسط ± SEM. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تم قياس وتآمر على مدى الزمن؛ الإشارة كثافة تسوس على مر الزمن وشدة الإشارات من كلتا الطريقتين تحميل (وأشار تحميل سطح باللون الأزرق أشار تحميل التاجي باللون الأحمر): الشكل (6). وبلغ متوسط كثافة إشارة من منطقة 7 من 7 بكسل في أربعة مواقع نموذجية في الأذين الأيمن: التربيق (TRAB)، العقدة الجيب (SAN)، الأذين الأيمن أطرافهم (RAA) والجيب التاجي (CS). ثم تم احتساب IC 50 قيم وصفت في جميع منحنيات الاضمحلال. كان تسوس إشارة كثافة من كلتا الطريقتين تحميل مماثل في TRAB وRAA. وIC 50 التحميل الشرايين في CS كان حوالي 20 دقيقة لفترة أطول. في SAN، وكانت هذه القيمة لتحميل الشرايين ما يقرب من أضعاف أكبر مقارنة مع تحميل السطح، مما يدل على أن أساليب الشرايين تحميل أدت إلى استقرار أفضل للصبغة في TISS SANرق مع مرور الوقت. وتظهر البيانات كمتوسط ± SEM. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا، قدمنا نوعين من الاستعدادات الماوس SAN: 1) سان حالها في القلب كله perfused Langendorff، و 2) SAN في عزلة، افتتح إعداد الأذيني. هذين النوعين من إعداد تخدم أغراض تجريبية مختلفة. في إعداد كله القلب perfused Langendorff، والحفاظ على هيكل الأذيني سليمة مما يجعل من الممكن لدراسة عدم انتظام ضربات القلب الأذيني معقدة مثل الرجفان الأذيني وكذلك التفاعلات بين SAN والأذين خلال tachyarrhythmias عودة الدخول. 6 في المقابل، في إعداد الأذيني المعزول ، يتم فتح الأذين وسويت بالارض في هيكل الأبعاد الزائفة اثنين حيث نشعر بالانزعاج حزم تشريحية ثلاثية الأبعاد. وهذا قد يؤثر على تشريح مسارات عودة الدخول مما يجعل إعداد الأذيني المعزول يست مثالية لدراسة arrhythmogenesis الأذيني. ومع ذلك، باستخدام هذا النوع من التحضير، وموقع جهاز تنظيم ضربات القلب الرائد (ق) مواقع، التوصيل intranodal، وAP نشر صattern يمكن تصور بدقة والتحقيق في التفاصيل. وبالإضافة إلى ذلك، تظهر الأذينين سليمة لتكون محدودة من وجهة نظر الخلفي بينما في إعداد معزولة، والسطح الأذيني كامل متاح لرسم الخرائط الضوئية.
وعلاوة على ذلك، وإعداد الأذيني المعزول يمكن رسم الخرائط الهيكلية وظيفية من الأذين بحل المجهرية المعقدة للشبكة تربيقية كما رأينا في الشكل (4). ولهذا، مكانية عالية (100 ميكرون / بكسل أو أعلى) والزمانية (2000 إطارا في الثانية أو أعلى) قرارات وينبغي أن تستخدم لأنه أمر بالغ الأهمية لامتاز كل من أنماط تنشيط الأذيني وSAN، والتي يمكن زيادة تتداخل مع الهياكل المماثلة. بينما 1000 إطارا في الثانية القرار الزماني قد يكون الحد الأدنى لإعادة تنشيط الأذيني (والذي يستمر لمدة 10-20 مللي ثانية)، وينبغي النظر في 2000 إطارا في الثانية كحد أدنى القرار الزماني لتوصيل intranodal (الذي يستمر ل~ 5 مللي ثانية، وبالتالي يمكن أن تضيع في أقل قرارات) والعمل SANقياسات ivation كما يتضح من الشكل (4). وهذا قد يسمح للتوطين "النقاط الساخنة" محدث اضطراب النظم (مثل بؤر خارج الرحم أو العائدة الراسية) أثناء الرجفان الأذيني / الرفرفة التي يمكن أن تنشأ من تراكب مناطق إعادة عرض وظيفي كبير مع تلك التليف مرتفعة و / أو خفض خلية الى خلية اقتران. 21،22 وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام الأسلوب المذكور لدراسة آليات الكهربية من تشوهات SAN، بما في ذلك الكتل SAN الخروج، توقف، عدم انتظام ضربات القلب، عدم انتظام دقات القلب بطء القلب، متلازمة العقدة الجيبية المريضة وما إلى ذلك.
عن طريق إدخال الثاني (أو حتى الثالث) التحقيق الفلورسنت، سيكون من الممكن لأداء رسم الخرائط الضوئية متعددة حدودي من النشاط الكهربائي بالتعاون مع التعامل مع الكالسيوم وكذلك التمثيل الغذائي وغيرها من التغييرات. ويمكن استخدام مجموعات مختلفة من الأصباغ لالمتزامن الجهد الكالسيوم، ratiometric الجهد / الكالسيوم، أو التصوير المحتملين الميتوكوندريا.
لارتفاع الزمني قرار رسم الخرائط البصرية، ويرجع ذلك إلى فترة أقصر جمع fluorophore، قد يكون موضع تقدير إشارات لأضعف نسبة الإشارة إلى الضوضاء. لذلك، يتم تطبيق إجراءات معالجة المتوسط إلى إشارات إيقاع الجيوب الأنفية القلب أو إشارات سلسلة سرعة حسب الحاجة. يتم الكشف عن DF / دينارا كحد أقصى لكل إشارة في تسجيل فترة طويلة. ثم تتماشى هذه النقاط وقت التنشيط. يتم قطع فترة الإعداد لتسجيل تركزت في هذه النقاط مرة وبلغ متوسط من كل أو اختيار الجزائرية، حسب الحاجة.
عن طريق استخدام دقيق من الأجهزة وإجراء تلطيخ الصحيح، المعلمات الكهربية الأذيني بما في ذلك سرعة التوصيل (مقارنة أرقام 3C و 4D لS1 تفعيل خرائط)، عفوية إيقاع SAN وطول العمر من إعداد SAN (الشكل 5) لا تتأثر، التي تبقى مستقرة ل 3 ساعات أو أكثر. الأهم من ذلك، MONIT المستمريجب أن يتم تنفيذ أورينج من ECG خلال الإجراء تلطيخ بالكامل لضمان وظيفة الكهربائية العادية للقلب. تطبيق blebbistatin قد تحفز على عابر تباطؤ معدل ضربات القلب، ولكن بخلاف ذلك، فإنه لا يسبب أي تغيرات في قيادة مواقع تنظيم ضربات القلب أو تغيرات في ا ف ب التشكل كما وصفت أيضا في وقت سابق. 13
تلطيخ السطح من إعداد الأذيني المعزول هو خطوة حاسمة. لهذا، وتطبيق سريع للصبغ المخفف على سطح النسيج وينبغي تجنب. بدلا من الصبغة يجب أن تقع على إعداد بحرية نظرا لكثافة أعلى من DMSO، والتي تستخدم في كل من الصبغة والتخفيفات blebbistatin. المبلغ الإجمالي تحميل المناسب والسرعة يجب أن تعدل حتى لا تحدث تغييرات جذرية معدل ضربات القلب. الإجراء تلطيخ يمكن تطبيق عدة مرات حتى تصل إشارة مستوى معقول. وتجدر الإشارة إلى أن التطبيق المباشر لصبغ قد يؤدي إلى تلف الأنسجة SAN وتؤثر على إحلال السلام فيتخاذ. لذلك، يجب تخفيف الصبغة وكمية تطبيقها يجب السيطرة بعناية. يجب تلطيخ السطح المناسب لا يضر إعداد أو SAN 23 الذي يقيمه معدل ضربات القلب مقارنة وسرعة التوصيل.
وينبغي النظر أيضا بروتوكولات تلطيخ بديلة. ويمكن أن تشمل هذه إما superfusion 10-15 دقيقة من SAN / إعداد الأذيني مع الصبغة الحساسة الجهد (RH-237 أو دي-4-ANEPPS) في 35 ± 1 درجة مئوية 10،19 أو الحضانة 30 دقيقة من إعداد في درجة حرارة الغرفة (20-22 درجة مئوية) في حل تايرود التي تحتوي على مؤشر حساس الجهد. 11
لرسم الخرائط البصرية للSAN من القلب كله perfused Langendorff، وتشمل الخطوات الأجهزة الهامة إدخال أنبوب صغير في LV وإغلاق SVC وIVC. السابق يمنع زيادة الضغط من الازدحام حل خلال تجارب طويلة الأمد وكذلك انا لاحقتطوير schemia بعد قمع انقباضات البطين من قبل blebbistatin وتحمض من الحل نضح. هذا الأخير تمكن الاتحاد الإقليمي للحفاظ على مستوى معين من الضغط داخل الأذيني مما يسد الأذين مع حل نضح وتسطيح المنطقة intercaval من أجل الكشف عن منطقة سان كامل لرسم الخرائط الضوئية.
وأخيرا، وتلطيخ التاجي، بالإضافة إلى السطح صبغ التحميل، ويمكن أن تحسن بشكل كبير من شدة OAPs SAN التي قد تستمر لفترة أطول بالمقارنة مع تلطيخ السطح النقي المستخدمة في الدراسات السابقة. 8،9
استخدام blebbistatin له مزايا متعددة مقارنة uncouplers الكهروميكانيكية الأخرى بما في ذلك سمية منخفضة، والآثار الجانبية أقل وضوحا، ومقاومه فشل عندما يتم استخدامها بحذر. يترسب Blebbistatin عندما يذوب في درجة حرارة أقل من 37 درجة مئوية. 14 بلورات Blebbistatin قد يقطع تدفق الأوعية الدموية العادية، وبالتالي تحفز المحليةنقص التروية وإثارة أحداث اضطراب النظم. 24 وبالإضافة إلى ذلك، في الدراسات التي تستخدم GFP أو غيرها / الأصباغ الصفراء الخضراء، يمكن أن هطول الأمطار blebbistatin يكون مخطئا لخلايا المسمى التي ينبغي أن تؤخذ بعين الاعتبار. منع blebbistatin هطول الأمطار واضح ومباشر، أي واحد لديه حل blebbistatin في قبل حرارة (37 ° C وسائل الاعلام أعلى) وأثار بقوة.
لتحليل الهادئ، على نسبة عالية من blebbistatin (ما يصل إلى 10 ميكرومتر) يمكن استخدامها. 13،14،25. وبالمثل، إذا تستخدم أي دواء يزيد الانكماش، فمن المستحسن تطبيق إضافية من blebbistatin.
كتقنية بديلة لدراسة الماوس SAN النشاط الكهربائي، وانخفاض قرار متعدد القطب مجموعة (64 الأقطاب منفصلة في ساحة 8 × 8، التكوين مع المسافة بين القطب من 0.55 ملم) 26 ومتتالية التسجيلات الزجاج مسرى مكروي قدم على مسافة قصيرة بين التطويق
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| water jacket | Radnoti | 1660 Series Tissue Bath for Large Organ or Single Cell Isolation Procedures | |
| water bath / circulator | Fisher Scientific | 1016S | |
| pressure amplifier | AD Instruments | MLT0670 | |
| EMD Millipore Nylon Net Filters | Fisher Scientific | NY1102500 | |
| Pressure transducer | AD Instruments | MLT0670 | |
| Stainless Steel Minutien Pins - 0.1 mm Diameter | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Perfusion pump | World Precision Instruments | PERIPRO-4LS | |
| Superfusion pump | World Precision Instruments | PERIPRO-4HS | |
| Vannas Tubingen scissors | World Precision Instruments | 503379 | |
| Dumont forceps | World Precision Instruments | 501201, 500085 | |
| Mayo scissors | World Precision Instruments | 501750 | |
| Kelly hemostatic forceps | World Precision Instruments | 501241 | |
| Iris forceps | World Precision Instruments | 15917 | |
| Iris scissors | World Precision Instruments | 501263 | |
| ECG 12 mm needle (29-gauge) electrodes (monopolar) | AD Instruments | MLA1203 | |
| in-line Luer injection port | Ibidi | 10820 | |
| Ultima-L CMOS camera | SciMedia | MiCAM-05 | |
| halogen lamp | Moritex USA Inc | MHAB-150W | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-1 | |
| CaCl2 (2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| KCl | Fisher Scientific | S217-500 | |
| MgCl2 (6H2O) | Fisher Scientific | M33-500 | |
| NaH2PO4 (H2O) | Fisher Scientific | S369-500 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | S233-3 | |
| D-Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Blebbistatin | Tocris Bioscience | 1760 | |
| RH237 | ThermoFisher Scientific | S1109 | |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 |
References
- Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. Optical imaging of the heart. Circ Res. 95 (1), 21-33 (2004).
- Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells & tissues. Circ Res. 110 (4), 609-623 (2012).
- Fedorov, V. V., Glukhov, A. V., Chang, R. Conduction barriers and pathways of the sino-atrial pacemaker complex: their role in normal rhythm and atrial arrhythmias. Am J Physiol Heart Circ Physiol. , (2012).
- Boyett, M. R., Honjo, H., Kodama, I. The sinoatrial node, a heterogeneous pacemaker structure. Cardiovasc Res. 47 (4), 658-687 (2000).
- Glukhov, A. V., et al. Sinoatrial Node Reentry in a Canine Chronic Left Ventricular Infarct Model: The Role of Intranodal Fibrosis and Heterogeneity of Refractoriness. Circ Arrhythm Electrophysiol. , (2013).
- Glukhov, A. V., et al. Calsequestrin 2 deletion causes sinoatrial node dysfunction and atrial arrhythmias associated with altered sarcoplasmic reticulum calcium cycling and degenerative fibrosis within the mouse atrial pacemaker complex. Eur Heart J. 36 (11), 686-697 (2015).
- John, R. M., Kumar, S. Sinus Node and Atrial Arrhythmias. Circulation. 133 (19), 1892-1900 (2016).
- Swaminathan, P. D., et al. Oxidized CaMKII causes cardiac sinus node dysfunction in mice. J Clin Invest. 121 (8), 3277-3288 (2011).
- Glukhov, A. V., Fedorov, V. V., Anderson, M. E., Mohler, P. J., Efimov, I. R. Functional anatomy of the murine sinus node: high-resolution optical mapping of ankyrin-B heterozygous mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 299 (2), H482-H491 (2010).
- Egom, E. E., et al. Impaired sinoatrial node function and increased susceptibility to atrial fibrillation in mice lacking natriuretic peptide receptor C. J Physiol. 593 (5), 1127-1146 (2015).
- Torrente, A. G., et al. Burst pacemaker activity of the sinoatrial node in sodium-calcium exchanger knockout mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (31), 9769-9774 (2015).
- Lang, D., Sulkin, M., Lou, Q., Efimov, I. R. Optical mapping of action potentials and calcium transients in the mouse heart. J Vis Exp. (55), e3275 (2011).
- Fedorov, V. V., et al. Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts. Heart Rhythm. 4 (5), 619-626 (2007).
- Swift, L. M., et al. Properties of blebbistatin for cardiac optical mapping and other imaging applications. Pflugers Arch. 464 (5), 503-512 (2012).
- Laughner, J. I., Ng, F. S., Sulkin, M. S., Arthur, R. M., Efimov, I. R. Processing and analysis of cardiac optical mapping data obtained with potentiometric dyes. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 303 (7), H753-H765 (2012).
- Liu, J., Dobrzynski, H., Yanni, J., Boyett, M. R., Lei, M. Organisation of the mouse sinoatrial node: structure and expression of HCN channels. Cardiovasc Res. 73 (4), 729-738 (2007).
- Verheijck, E. E., et al. Electrophysiological features of the mouse sinoatrial node in relation to connexin distribution. Cardiovasc Res. 52 (1), 40-50 (2001).
- Krishnaswamy, P. S., et al. Altered parasympathetic nervous system regulation of the sinoatrial node in Akita diabetic mice. J Mol Cell Cardiol. 82, 125-135 (2015).
- Nygren, A., Lomax, A. E., Giles, W. R. Heterogeneity of action potential durations in isolated mouse left and right atria recorded using voltage-sensitive dye mapping. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287 (6), H2634-H2643 (2004).
- Efimov, I. R., Fedorov, V. V., Joung, B., Lin, S. F. Mapping cardiac pacemaker circuits: methodological puzzles of the sinoatrial node optical mapping. Circ Res. 106 (2), 255-271 (2010).
- Aschar-Sobbi, R., et al. Increased atrial arrhythmia susceptibility induced by intense endurance exercise in mice requires TNFalpha. Nat Commun. 6, 6018 (2015).
- Hansen, B. J., et al. Atrial fibrillation driven by micro-anatomic intramural re-entry revealed by simultaneous sub-epicardial and sub-endocardial optical mapping in explanted human hearts. Eur Heart J. 36 (35), 2390-2401 (2015).
- Lang, D., Petrov, V., Lou, Q., Osipov, G., Efimov, I. R. Spatiotemporal control of heart rate in a rabbit heart. J Electrocardiol. 44 (6), 626-634 (2011).
- Kanlop, N., Sakai, T. Optical mapping study of blebbistatin-induced chaotic electrical activities in isolated rat atrium preparations. J Physiol Sci. 60 (2), 109-117 (2010).
- Glukhov, A. V., Flagg, T. P., Fedorov, V. V., Efimov, I. R., Nichols, C. G. Differential K(ATP) channel pharmacology in intact mouse heart. J Mol Cell Cardiol. 48 (1), 152-160 (2010).
- Wu, J., et al. Altered sinoatrial node function and intra-atrial conduction in murine gain-of-function Scn5a+/DeltaKPQ hearts suggest an overlap syndrome. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302 (7), H1510-H1523 (2012).
