Summary
여기에, 우리는 높은 공간 및 시간 해상도, 마우스 우심방 특히 중국 - 심방 노드에서 전기 활동의 광학 매핑을위한 프로토콜을 제시한다.
Protocol
모든 실험은 실험 동물의 관리 및 사용을위한 건강 가이드의 국립 연구소 (NIH 출판. 번호 80-23)에 따라 실시 하였다. 이 연구에 사용 된 모든 방법과 프로토콜 NIH에 의해 출판 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 지침은 다음 위스콘신 동물 관리 및 사용 프로토콜위원회의 대학에 의해 승인 된 (발행 번호 85-23를, 1996 년 개정). 본 연구에 사용 된 모든 동물 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드를 준수 인도적인 치료를 받았다.
1. 심장 제거 및 랑겐 돌프 관류
- 심장 차단, 수조와 물 재킷을 사용하여 37 ° C 따뜻한 타이로드 용액에 앞서.
- 5 % 이소 플루 란 / 95 % O 2 마우스를 마취.
- 고통 반사의 손실을 확인하여 마취의 적절한 수준을 확인합니다.
- 개흉술을 수행합니다. 곡선 5.5 "메이요 가위 5.5"켈리 지혈 용을 사용하여 가슴을 열고CEPS는 흉부의 전면에 잘라 1cm를 확인합니다.
- 신속하게 (30 초 이내) 가슴에서 심장의 압축을 풉니 다. "폐 조직을 잡아 4.3 사용하여 심낭과 함께 폐, 흉선, 심장을 잘라 곡선 아이리스 집게 '아이리스 가위 (4)를 사용합니다. 직접 마음을 잡아하지 마십시오.
- 산소 (95 % O 2 / 5 % CO 2)에 씻어, 일정한 온도 (36.8 ± 0.4 ° C)의 타이로드의 솔루션을 수정했습니다. (MM)에서 다음과 용액 조성물을 사용하여 128.2 염화나트륨 4.7의 KCl을 1.19의 NaH 2 PO 4, 1.05의 MgCl 2 1.3 CaCl2를 20.0의 NaHCO3 및 글루코오스 11.1 (pH를 7.35 ± 0.05).
- 동일한 솔루션에 목욕하는 동안, 폐, 흉선, 지방 조직을 식별합니다. 조심스럽게 마음을 해부하다. 3 "Vannas - 튀빙겐 가위 4.3"# 5 집게 곡선 사용합니다.
- 그런 다음 대동맥을 확인하고 주문 제작 21 G 정맥에 그것을 cannulate. 이 곡선 4.3 "#의 5B의 힘을 사용하여추신.
- 삽관 한 후 동시에 관류 (~ 50 ml / 분의 유속으로 목욕) (~ 5 ㎖ / 분의 유량에서의 캐뉼라를 통해가 대동맥 압력에 기초하여 조정되어야하며, 아래 참조) superfuse 전체 실험을 통해 예열 여과 타이로드 용액으로 마음입니다. 관상 동맥의 폐색을 방지하기 위해 인 - 라인 11 ㎛의 나일론 필터를 통해 관류 액이 통과한다.
- 관류 라인에 3 방향 스톱 콕 루어 잠금 장치를 통해 연결된 압력 변환기 (또는 압력 게이지)를 사용하여 동맥압을 모니터 (60) 및 80 mmHg의 사이에 유지한다. 이 범위 내에서 대동맥 압력을 유지하기 위해 필요한 경우 관류 속도를 조정합니다.
랑겐 돌프 - 관류 항목의 심장에서 SAN 2. 광학 매핑
- 수단
- 수평으로 중심을두고 P 0.1 mm 직경의 핀을 이용하여 상기 챔버의 실리콘 코팅 아래쪽 심실 에이펙스 핀하지 못하 스트림에 의한 실험 기간 동안 운동을. (12)
- 폐정맥을 통해 좌심실 (LV)에 작은 (0.012 "(내경) x 0.005") 실리콘 튜브를 삽입, 왼쪽 심방 (LA)과 승모판 막 (MV). 사운 딩 결합 조직에 실크 봉합사 (4-0)에 의해 튜브를 고정합니다.
- 그 후방 측 (그림 1A, 왼쪽 패널)를 향하도록 마음을 놓습니다.
- 0.1 mm 직경 minutien 핀을 이용하여 상기 챔버의 실리콘 바닥까지 RA 부속기 (RAA)의 가장자리에 핀. 적경 평면의 후방 표면을하고 카메라의 초점면에 위치 할 수 있도록하기 위해 자사의 레벨을 조정합니다. 이는 심방의 최대 표면적 광학 측정을 가능하게 할 것이다.
- 실크 봉합사 (4-0)에 의해 올가미 우수 (SVC) 및 하부 (IVC) 대정맥, 스트레칭과 실리콘 코팅 챔버 (그림 3A 참조)의 바닥에 봉합사의 다른 쪽 끝을 고정. 봉합사는 차단하지 않습니다 확인보기의 광학 분야.
- RAA의 가장자리에 맞춤 페이싱 전극을 배치합니다. 전극하려면 사용 실리콘 0.5 mm 전극 간 거리, 0.25 mm 직경은 와이어를 코팅하고 조율 끝에 1mm의 길이에 대한 실리콘의 결여. 그런 다음 두 개의 ECG 12mm 바늘 (29 게이지) 좌우 심실의 기지 근처 모노 폴라 전극을 배치합니다. 심실의 정점 근처의 땅 ECG 전극을 배치합니다.
- 더럽히는 것
- 형광 염료 및 전기 기계 uncoupler의 blebbistatin 모두 빛에 민감한 때문에, 어두운 방에서 아래에 설명 된 모든 절차를 수행합니다. 먼저 디메틸 설폭 시드 (2.5 mM)을 분액으로의 스톡 용액, 1.25 ㎎ / ㎖로 (30 μL를 각각) 전압 감응 염료 RH-237 또는 디 -4- ANNEPS을 준비하고 -20 ℃에서 분취 량을 저장한다.
- 가온 (37 ° C) 타이로드 용액 1 ml의 염료 원액 5-10 μL 희석하고 관상 동맥 관류 라인에 주입인라인 루어 주입 포트를 사용하여 5-7 분에 걸쳐.
- 사전에 원액 (디메틸 설폭 사이드 2 ㎎ / ㎖, 6.8 밀리미터)로 blebbistatin 준비하고 4 ℃에서 보관합니다.
- 안정화의 20 분 후, 관류 액의 가온 0.5 ㎖ (37 ° C)를 추가하고 blebbistatin 가온 (37 ° C) 타이로드 용액 1 ㎖에 blebbistatin 0.1 mL로 희석. 이어서 인라인 루어 주입 포트를 사용하여 5-7 분에 걸쳐 관상 동맥 관류 라인에 주입.
격리 된 심방 준비에서 SAN 3. 광학 매핑
- 수단
- 격리 된 심방 준비, 분리 및 전체 심장 준비 단계 1.1-1.5에서 상술 한 바와 같이 마음을 cannulate.
- 멀리 전방 측면에서 심실을 해부하다. 그림 1A, 오른쪽 패널을 참조, 자세한 내용은 # 1를 잘라.
- 삼첨판 버지니아 통해 절단하여 RA를 엽니 다TV를-SVC 축을 따라 LVE (TV). 그림 1A, 오른쪽 패널을 참조, 자세한 내용은 # 2를 잘라.
- RAA를 엽니 다 crista의 terminalis의 중간 다리를 잘라. 그림 1A, 오른쪽 패널을 참조하십시오, # 3를 잘라.
- 상기 RAA의 오른쪽 하단의 가장자리 위 컷 # 3의 중간 선에서 절단을 수행하여 전방 심방 자유 벽을 열고 평평 실리콘 피복 실의 바닥 심방 자유 벽에 핀. # 4 잘라도 1a에 중공의 화살표 방향 참조. 심방의 손상을 방지하기 위해 제조 피닝 심실 조직의 림 보존.
- 마찬가지로, LA의 부속물 (LAA)의 MV-상단 모서리를 따라 MV 통해 절단에 의해 열린 LA.
- LAA의 중간 림 근처까지 전방 심방 자유 벽을 통해 열린 LAA의 중간에서 잘라 LAA를, 엽니 다.
- 전방 심방 자유 벽 ALO를 엽니 다동일한 방향 겨 후 평탄화 및 실 가드 코팅 챔버의 바닥에 고정.
- 부분적으로 심방 중격 조직을 제거합니다. 이 초점에없는 조직에서 광 신호의 산란을 줄일 수 있습니다. 따라서, LA 및 RA뿐만 아니라 SAN 및 아트 리오 - 심실 접합 (AVJ)는 모두이 준비 (그림 1B)에 액세스 할 수 있습니다.
- 외막과 내막 양면에서 superfusion을 허용하기 위해, 실리콘 코팅 챔버의 바닥으로부터 약 0.5 mm로 최종 제제 올려.
- SVC를 근처에 집중 유량 12 ㎖ / 분 ~ 일정한 속도로 가온 함께 제제 (37 ° C) 타이로드 용액 및 Superfuse ~ 목욕 superfusion 30 ㎖ / 분.
- 해부 RAA의 가장자리에 맞춤 간격의 Ag / AgCl을 2 전극 (0.25 mm 직경)을 놓습니다. 그런 다음 각각 두 개의 ECG 12mm 바늘 (29G)를 RAA 및 LAA 근처 전극 (극성)을 배치합니다. 지상 ECG 차기를 배치AVJ 근처에 탔다.
- 더럽히는 것
- 전압에 민감한 염료 (RH-237 또는 디 - 4 ANNEPS)의 직접적인 응용 프로그램을 수행합니다. 이를 위해, 가온 (37 ° C) 타이로드 용액 1mm에서 염료 원액 1-2 μL 희석 천천히 1mm 피펫을 사용하여 제제의 표면에 희석 된 염료를 방출.
- 또는, 전체 심장 준비 (단계 2.2.1-2.2.2)에 대한 전술 한 것과 유사한 랑겐 돌프 - 관류 심장의 관상 동맥 재관류를 통해 전압에 민감한 염료와 심방 염색을 수행합니다.
- 한 바와 같이 관상 동맥 관류 염색 후에 심방 준비 격리. 양호한 형광 레벨에 도달하는 데 필요한 경우 추가적인면 염색을 수행한다. 빠른 심방 분리 염료 표백하지 않고 염색 품질에 영향을 미치지 않는다.
- 전기 기계 uncoupler, blebbistatin으로 제조 고정시킨다. 상상력 3-5 μl를 희석가온 (37 ° C) 타이로드 용액 원액 bbistatin 천천히하면 준비의 표면 및 주변 솔루션을 희석 blebbistatin를 놓습니다. blebbistatin는 준비와 염색 동안 빛에 빛에 민감, 13, 14 피할 긴 노출로 표시되어 있기 때문에.
- 수축을 억제하는 데 필요한만큼 추가 blebbistatin 응용 프로그램을 수행합니다. 일반적으로 3 추가 애플리케이션 (각 어플리케이션마다 3-5 μL)까지 정확하게 SAN 심방 활성화를 재구성하기 위해 충분히 동 잡음을 억제 할 수있다.
- 관류에 따뜻하게 blebbistatin의 추가 0.5 ML을 추가합니다. 이 절차를 수행하는 동안, 염료 / blebbistatin는 심방 조직을 염색 할 수 있도록 30 초 동안 superfusion을 일시 중지합니다.
4. 광학 매핑 설정
주 :. 광학적 맵핑 시스템의 상세한 설명은 다른 곳에서 제공된다 (12)
- 투과 전자 현미경과 카메라를 사용하여2000 프레임 / 초 이상, 집광 렌즈의 시리즈의 poral 해상도는 100 μm의 / 화소 이상의 공간 해상도를 달성한다. 이는 SAN 활성화 및 intranodal 전파를 재구성 할 필요가있다.
- 진동 용액으로부터 동 잡음을 감소시키기 위해, 심장 / 절연 심방 제조 위에 상기 용액의 표면에있는 작은 커버 글라스를 고정한다.
- 정전류, 저잡음 할로겐 램프에 의해 제공되는 여기 광 (520 ± 45 nm 파장)를 사용합니다. 가요 갈래 광 가이드를 사용하여 제조 상 여과 광속을 지시.
- 긴 패스 필터 (> 715 ㎚)에 의해 방출 된 형광 필터. 수집, 디지털화 및 카메라 제조업체에서 제공하는 컴퓨터 사용하여 소프트웨어를 획득 한 형광 신호를 저장합니다.
5. 데이터 처리
주 : 광 맵핑 데이터 수집 및 상이한 시점에서의 형광 강도의 행렬로 저장됩니다. 화소 represe특정 시점에서, 티슈 제조의 특정 위치에서 수집 된 형광 강도의 측정치를 NTS. 배경 형광이 자동으로 막 전압 변화에 의해 생성 및 미세 전극 시스템에 의해 측정 된 활동 전위 (APS)에 해당하는 반전 형광 변화를보다 효율적으로 시각화 할 수 있도록 픽셀 당을 제거한다. 영상 분할, 공간 필터링, 시간적 필터링하고, 기준 편차 제거를 포함한 광학 영상 데이터를 처리에서 여러 단계의 상세 포커스 리뷰가 제공된다. (15)
- 수동 또는 조직의 경계를 결정하기 위해 특정 알고리즘 (예를 들어, 임계 또는 에지 검출) (15)를 이용하여 1 (포함 화소) 0 (제외 픽셀)의 바이너리 마스크를 생성하고 시퀀스의 각 프레임에 마스크를 적용한다. 이 과정은 추가 처리를 위해 관심 영역을 강조 바이너리 이미지를 만듭니다.
- 선택 해제의 신호 대 잡음비를 향상시키기iCal의 데이터는, 상기 선택된 관심 영역 내에서 신호를 필터링. 이를 위해, 예를 들어, 버터 워스, 체비 셰프 유형 및 / 또는 시간 필터링 ((잡음 데이터, × 5 5 예 3 × 3, 원하는 회선 빈 또는 커널에 의해 정의 된 이웃 형광 픽셀, 즉 평균 이상) 공간을 사용 1, 체비 세프 2 형, 타원 등) (그림 2). 데이터를 해석 할 때 염두에 여과에 의한 유물의 가능성을 유지합니다. 자세한 내용은 리뷰를 참조하십시오. (15)
- 필요한 경우 (원래의 신호에 하이 패스 필터링 또는 다항식 피팅을 사용하여) 광 기록에서 기준선의 드리프트를 제거하고 0 (최소 형광) (1) (형광 극대)로부터 화소 신호를 정규화.
- 단일 AP의 전파에 대한 모든 픽셀의 활성화 시간을 포함 시간 윈도우를 선택한다. F는 fluorescen입니다 최대 상향 행정 유도체의 시간 (DF / DT 최대, 각 픽셀에게 그것의 활성화 시간을 할당가전 강도). 모든 화소의 활성화 시간을 사용하여, 활성화 등시 맵을 재구성. 각 아이소 크론 따라서 동시에 활성화 픽셀을 표시합니다.
- 각 픽셀 (재분극, APD (80)의 80 %, 예를 들면) 재분극 특정 레벨에서 동작 시간과 시간 사이의 기간을 계산 들면 AP 기간 (APD) 분산 맵을 재구성한다. 모든 화소 APD 값을 사용하여, APD 분포 등시 맵을 재구성. 각 아이소 크론 따라서 같은 APD와 픽셀을 표시합니다.
- AP의 전파에 대한 전도 속도를 계산하는 5.4에서 계산 된 활성화 시간 데이터에 제제의 표면에 장착한다. 이를 위해, 다항식 피팅 표면 또는 로컬 커널 표면 평활화를 사용하고 장착 표면의 기울기로부터 로컬 전도 속도 벡터를 구한다.
- 재분극 맵을 만들려면 각 픽셀에게 그것의 재분극 시간을 할당, 최대 초 미분으로 정의 (D 2 F / DT2) OAP 또는 90 % 재분극시의 끝에서 광 신호.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
랑겐 돌프 - 관류 심장에서 그대로 SAN의 광학 매핑
자연 동 율동에 대한 재구성 RA 활성화 등고선의 전형적인 예는 랑겐 돌프 - 관류 마우스 심장 그림 3에 표시됩니다. 초기 활성 점은 SAN 해부학 정의 SVC 근처 intercaval 영역 내에 위치한다. 1.0 및 0.5 msec의 샘플링 레이트에서 취득 3,16 개의 RA 활성화 등고선지도는도 3b에 도시된다.
SAN의 기능을 평가하기 위해, 우리는 10 ~ 12 Hz에서 적어도 1 분 동안 RAA 페이싱 후 SAN 회복 시간 (SANRT). (9) 측정, 전기 자극을 중단하고 SANRT이 이전 촬영 AP와 사이의 시간 간격으로서 계산 하였다 먼저 자연 AP (그림 3C). SANRT는 심장 박동 (즉 SANRT <으로 수정되었습니다SANRT 상기 기준주기 길이 사이의 차이를 계산하여 서브> c). 또한, 제 포스트 페이싱 조정기의 위치를 확인 하였다. 이 예를 들어, SANRTc은 약 49 밀리 초였다.
격리 된 심방 및 SAN 활성화
자발 동 리듬 중 절연 심방 제제의 활성화는도 4a에 도시된다. 그것은 중격 방향에 우수하고 열등한 SAN의 가장자리와 완전한 블록에 가까운이 우선 전도 방향과 함께 RA를 통해 이방성 확산 넓은 파면과 SVC 근처에 SAN을 정의 해부학에서 유래 (그림 4A의 활성화지도에 표시) . 1 밀리 샘플링 레이트에서 취득한 기동지도 초기 활성의 광범위한 영역을 나타낸다. 0.5 밀리 0.3 밀리의 샘플링 속도의 증가는 우리가 선두 조정기 위치의 정확한 위치를 확인 할 수있다. W전자 관찰 전형적인 이길 - 투 - 이길 이전에 유리 미소 전극 (17) 및 광학 매핑 8-11,18,19에 의해뿐만 아니라 connexin45 및 HCN4에 대한 immunolabeling에 의해 electrophysiologically 특징 차 페이스 메이커 영역에 해당 선도적 인 심장 박동기의 안정된 단 초점 위치를 . -6,16-
서서히 상승 SAN 성분 및 심방의 급상승 상향 행정 (심방 성분) (도 4b) (20) 때문에 광산란 :. 이전에 입증 된 바와 같이, SAN 광학적 작용 전위는 두 가지 성분을 포함하는 2 상 신호 이루어져 프로세스, OAP는 조직 내에서 세포의 여러 계층에서 발생하는 평균화 전기 활동을 나타냅니다. 산란 깊이와 폭은 빛의 산란 및 흡수 특성에 의해 결정되며 1.5 mm까지 도달 할 수있는 공간 상수의 적용을받습니다. 때문에 SAN의 행위와의ction 지연은 SAN AP는 항상 생리 활성 (그림 4B) 동안 심방 활동을 선행한다. 심방의 SAN으로의 전환을 계산하기 위해 (즉, SAN 도통 시간은 SANCT)는, 우리는 두 성분 SAN 신호 50 SAN 성분 진폭 %, 또는 이들 피크의 제 1 피크에 도달하는 시점를 사용 OAP 1 차 미분 (DF / DT). 적경에 이른 SAN 활성화의 영역으로부터 SANCT 유리 미소 전극에 의해 측정 된 것과 유사한 ~ 5 밀리 초이었다.
SAN 복구 시간
마찬가지로 SANRT은 절연 심방 제제 (도 4D)로 측정 하였다. 이를 위해, 심방 준비는 적어도 1 분 동안 RAA의 코너에 위치한 페이싱 전극을 통해 12 Hz에서 진행되었다. (9)이 예를 들어, SANRTc은 랑겐 돌프 - 관류 측정 그와 비슷한 약 34 밀리 초였다 마음 (그림 3C). 또한, 제 포스트 페이싱 조정기의 위치를 확인 하였다.
심장 리듬과 형광 신호 안정성 시간별
수술 및 염료 로딩 절차가 적절하게 준수하는 경우, 아트리움의 생리적 특성에 상당한 변화가 안된다. 그림 5에서, 우리는 이전과 심방 격리 절차 후 3 시간 재관류 동안 측정 된 심장 리듬을 제시한다. 심박수의 유의 한 변화는 심방 격리 중 또는 염료 로딩 이후에 관찰되지 않았다.
동맥 염색 염료의 많은 양이 필요할 수 있지만, SAN 영역 조직의 형광 신호의 안정성이 로딩 방법을 사용하여 더 좋을 것 같습니다. 도 6에서, 우리는 모두 관상 표면 얼룩에 대한 시간에 따른 신호 강도의 감쇠를 제시한다. t에서 그 조직은 SAN (신호 강도가 50 %로 사망 한주기를 나타냄) IC (50)는 거의 2 배만큼 표면 염색과 관상 염색 후 약 107 분이다.
그림 1 :. 마우스 심방 준비의 분리는 (A) 수술 절차는 마우스 심방 준비를 분리하기 위해 수행. 마음의 후방보기가 표시됩니다. 모든 상처는 점선 붉은 선으로 표시하고 수행 순서대로 숫자로 표시되어 있습니다. 텍스트의 내용을 참조하십시오. (; 회색 타원형으로 표시 SAN) (B)의 좌우 심방 부속기의 소주 구조뿐만 아니라 중국 - 심방 노드의 위치를 포함한 주요 해부학 적 특징을 보여주는 고립 된 마우스 심방 준비의 개략적 인 윤곽. 모든 약어는 그림에 설명되어 있습니다.tp_upload / 54773 / 54773fig1large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 :. 0.3, 0.5 및 1 밀리 초 / 프레임에서 녹화 된 원료와 가공 신호 원시 신호는 하나의 픽셀에서 수집된다. 3 × 3 비닝 후, 신호는 저역 통과 버터 워스 (Butterworth) 알고리즘을 사용하여 필터링됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 :.은 SAN (A) 왼쪽의 전체 - 심장 광 매핑, 그대로 마음에서 SAN의 매핑에 사용되는 일반적인 준비의 사진입니다. 파란색 사각형의 광학 필드를 보여줍니다보기 (6mm로 6mm). 오른쪽,보기의 광학 필드는 카메라를 통해 촬영 및 해부학 적 중첩. SVC 및 IVC : 우수하고 하대 정맥; RAA : 우심방 부속; RV 및 LV : 좌우 심실; PV를 : 폐정맥. (B) 컬러 컨투어 활성화 맵 (왼쪽) 1.0 msec의 0.5 밀리 초 (오른쪽) 샘플링 레이트로 획득. 각 맵의 우측 심방 활성화 시간을 나타내는 대응 컬러의 시간 척도 나타낸다 (초기 활성 점으로부터 적색으로 표시된 최근 활성화 점에 청색으로 표시). 최초의 심방 활성화 사이트는 별표로 표시됩니다. (C) SAN 복구 시간 (SANRT) 전체 - 마음의 준비를 측정 하였다. 마지막 페이싱 자극 (S1)과 첫 번째 게시물 - 페이싱 심방 비트 (A1)에 대한 복원 심방 활성화 등고선지도의 대표적인 예는 상단에 대표 OAP 추적에서 선택한 비트에 대해 표시됩니다.최초의 심방 활성화의 사이트는 별표로 표시되어 있습니다. BCL :. 기본 사이클 길이 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 격리 된 심방의 심 내막 표면에서 마우스 중국 - 심방 노드 (SAN)의 고해상도 광학 매핑 일반적인 마우스 SAN 준비 (6mm X 6mm)의 (A) 사진 및 대응 활성화 등고선지도. 1.0 밀리 초, 0.5 밀리 초, 0.3 밀리 초 샘플링 속도에서 얻을. SAN과 이웃 블록 영역은 화살표로 도시된다. 색상 시간 규모는 심방 활성화 시간을 나타냅니다. 별표는 선두 조정기의 위치를 나타낸다. RAA : 우심방 부속, SVC 및 INC : 우수하고 하대 정맥, RV : 우심실, AVJ : 아트 리오 - ventricul 아칸소 접합, CT : crista terminalis의, IAS : 간 심방 중격. (B) 마우스 SAN 영역으로부터 OAP 기록의 두 성분의기구. 텍스트의 내용을 참조하십시오. . (C) OAPs은 SAN 영역 (청색), 초기 심방 여진 위치 (녹색) 및 최신 RA 활성 사이트 (적색)의 중심으로부터 기록 인 세트 5와 동일한 총 도통 시간 심방 파형 노드에서 전환 밀리 초. 11 밀리 초와 동일한 RA 전체 활성화에 대한 시간 지연을 비교한다. (D) SAN 회복 시간 (SANRT) 격리 심방 제조 측정. 마지막 페이싱 자극 (S1)과 첫 번째 게시물 - 페이싱 심방 비트 (A1)에 대한 복원 심방 활성화 등고선지도의 대표적인 예는 표시됩니다. 최초의 심방 활성화의 위치는 별표로 표시됩니다. BCL - 기본 사이클 길이.K ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 심장 리듬이 이전과 심방 격리 절차 (A) 후와 3 시간의 관류 (B) 동안 측정. (A) 자발적인 박동 심장 박동이 이전과 심방 염색의 두 가지 유형에 대한 심방 차단 후 표시됩니다 : 심방 분리 전에 표면의 얼룩 분리 후 (아무 이전에 관상 동맥 염색) 및 관상 동맥 염색. 3 시간 관류 이상 (B) 자발적인 박동 심장 박동의 안정성은 비 염색 심방 준비를위한 형광 염료에 대해 도시 및 스테인드 심방 준비를 blebbistatin된다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 :. 신호 강도 디케이 이상 시간을 모두 로딩 방식의 신호의 세기는 (관상 동맥 로딩이 빨간색으로 표시하고, 표면 부하가 파란색으로 표시)를 측정하고, 시간이 지남에 그려졌다. trabecula (TRAB), 동방 결절 (SAN), 우심방의 부속물 (RAA) 및 관상 동 (CS) : 신호 강도는 우심방에서 네 개의 일반적인 위치에서 7 7 화소 영역에서 평균되었다. IC 50 값을 계산 한 다음 모든 감쇠 곡선에 표지 하였다. 모두 적재 수단으로부터의 신호 강도가 감쇠 TRAB RAA와 유사 하였다. CS에서 동맥로드의 IC (50)는 약 20 분 이상이었다. SAN의, 동맥 로딩이 값은 동맥로드 방법은 SAN의 담배 마는에서 염료의 더 나은 안정성 결과를 나타냅니다 표면로드에 비해 거의 2 배 크다시간이 지남에 따라 UE. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
랑겐 돌프 - 관류 온 마음 1) 그대로 SAN, 2) SAN은 고립에, 심방 준비를 개설 : 여기, 우리는 마우스 SAN 준비의 두 가지 유형을 제시했다. 준비의이 두 종류의 서로 다른 실험 목적을 제공합니다. 랑겐 돌프 - 관류 온 마음 준비에서 그대로 심방 구조는 가능한 재진입 빈맥 성 부정맥 동안 SAN과 심방 사이의 복잡한 심방의 이러한 심방 세동과 같은 부정맥뿐만 아니라 상호 작용을 연구 할 수있는 보존됩니다. 6 대조적으로, 고립 된 심방 준비 아트리움은 세 가지 차원 해부학 번들을 방해하는 의사 두 차원 구조로 열어 평평하게됩니다. 이 심방 arrhythmogenesis 공부에 적합하지 격리 된 심방 준비를하게 재진입 경로의 해부학에 영향을 미칠 수 있습니다. 그러나,이 제제의 종류, 선도적 인 페이스 메이커 (들) 사이트, intranodal 전도의 위치 및 AP 전파 페이지를 사용하여attern 정확하게 시각 상세하게 조사 될 수있다. 분리 된 제제에서, 전체 심방 표면 광 맵핑 할 수있을뿐만 아니라, 본래는 심방 후방 뷰에 의해 한정되는 것으로 보인다.
또한, 절연 심방 제조도 4에 도시 된 바와 같이 해면골 네트워크의 복잡한 미세 해결하여 심방의 구조 - 기능 매핑 할 수있다.이를 위해, 높은 공간 (100 μm의 / 화소 이상) 및 시간 (2000 FPS 이상) 해상도 이 또한 해당 구조와 중첩 될 수 모두 심방 및 SAN 활성화 패턴을 특수화하는 것이 중요하기 때문에 사용되어야한다. 1000 fps의 시간 해상도 (10 지속 - 20 밀리 초) 심방 활성화를 재구성 최소가 될 수도 있지만, 2000 FPS는 ~ 5 ms 동안 지속 따라서 이하에서 누락 될 수 intranodal 전도 (의 최소 시간 해상도로 고려되어야한다 해상도) 및 SAN 행위그림 4에서 볼 수 있듯이 ivation 측정.이 상승 섬유증의 사람들과 중요한 기능 리모델링 지역의 중첩에서 나타날 수있는 심방 세동 / 조동 동안 부정맥 "핫스팟"(예 : 자궁외 초점 또는 고정 된 재입국 등)의 국산화를 허용 할 수있다 및 / 또는 감소 세포 간 결합. 또한 21, 22는 설명 접근 방식은 SAN 출구 블록, 일시 정지, 빈맥 - 서맥 부정맥, 아픈 부비동 증후군 등을 포함한 SAN 이상의 전기 생리 메커니즘을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
두번째 (또는 세번째) 형광 프로브를 도입함으로써, 칼슘 처리뿐만 아니라, 대사 및 기타 변경에 대응하여 전기 활동의 다중 파라미터 광 맵핑을 수행하는 것이 가능할 것이다. 염료의 상이한 조합 동시 전압 칼슘 비율 적 전압 / 칼슘 또는 미토콘드리아 전위 묘화하는데 사용될 수있다.
짧은 형광 수집주기 때문에 높은 시간 해상도 광 매핑 들어, 약한 신호 - 대 - 잡음비 신호가 인식 될 수있다. 필요에 따라서, 평균화 처리 절차는 동 심장 박동 신호 또는 간격 시리즈 신호에 적용된다. 은 df / DT 최대가 장시간 기록의 각 신호에 대해 검출된다. 이러한 활성화 시점은 다음 정렬된다. 필요에 따라이 시점에서 중심 기록의 설정 기간은 AP를 잘라 평균 모든 또는 선택된다.
기기의 정확한 사용과 올바른 염색 방법으로, 전도 속도 (도 3C와 4D S1 활성화지도를 비교), 자연 SAN 리듬과 SAN 준비 (그림 5)의 장수를 포함하여 심방 전기 생리 매개 변수에 대한 안정적으로 유지하는 영향을받지 않습니다 3 시간 이상. 중요한 것은, 연속 MONITECG의 오링은 심장의 정상적인 전기 기능을 보장하기 위해 전체 염색 과정을 통해 수행해야합니다. blebbistatin의 응용 프로그램은 일시적인 심장 박동 둔화를 유도 할 수 있지만 그 이외의, 그것은 이전에 한 바와 같이 AP 형태에 페이스 메이커 사이트 또는 변화를 선도하는 변화를 유발하지 않습니다. (13)
격리 된 심방 준비 표면의 얼룩은 중요한 단계입니다. 이 경우, 조직의 표면에 희석 된 염료의 신속한 애플리케이션은 피해야한다; 대신 염료에 의한 염색 및 blebbistatin 희석 모두에 사용 DMSO의 높은 밀도로 자유롭게 준비에 가을해야합니다. 극적인 심박수 변화를 유발하지 않도록 적절한 총 담지량과 속도를 조정하여야한다. 상기 신호가 적절한 레벨에 도달 할 때까지 염색 과정을 여러 번 적용될 수있다. 이는 염료의 직접 적용은 SAN 조직 손상 및 pacem 영향을 미칠 수 있음을 유의해야한다aking. 따라서, 염료 희석되어야하고 도포 양은 신중하게 제어되어야한다. 적절한 표면 염색 비교 심박수 전도 속도에 의해 평가되는 제제 또는 SAN (23)에 손상을주지해야한다.
대안 염색 프로토콜이 또한 고려되어야한다. 다음은 35 ± 1 ° C 10,19에서의 전압에 민감한 염료 (RH-237 또는 디 - 4 - ANEPPS)와 SAN / 심방 준비하는 10 ~ 15 분 superfusion 또는 준비의 30 분 배양를 포함 할 수있다 전압 감지 표시 함유 타이로드 용액을 실온 (20 ~ 22 °의 C)에서. 11
랑겐 돌프 - 관류 온 마음에서 SAN의 광 매핑, 중요한 계측 단계는 LV에 작은 튜브의 삽입 및 SVC 및 IVC의 폐쇄를 포함한다. 전자는 후속 I뿐만 아니라 장기 실험 동안 용액 혼잡으로부터 압력 증가를 방지관류 액의 blebbistatin 및 산성화에 의한 심실 수축의 억제 후 schemia 개발. 후자 따라서 관류 용액으로 중앙 홀을 채우는 광학적 맵핑 전체 SAN 영역을 밝히기 위해 intercaval 영역을 평탄화 인트라 심방 압력 일정 수준을 유지하기 위해 RA 수있다.
마지막으로, 관상 동맥 염색, 염료로드 표면 할뿐만 아니라, 훨씬 이전의 연구에서 사용 된 순수한 표면의 얼룩에 비해 더 오래 지속될 수있는 SAN OAPs의 강도를 향상시킬 수 있습니다. 8,9
blebbistatin의 사용이 신중하게 사용되는 낮은 독성, 덜 뚜렷한 부작용 및 세척 저항을 포함한 다른 전기 uncouplers에 비해 여러 장점이있다. 이 온도에서 용해보다 37 ° C. 14 Blebbistatin 결정이 지역 유도하여 정상 혈관의 흐름을 방해하고 있습니다 경우 Blebbistatin은 침전허혈 유발 부정맥 이벤트. 또한 24, GFP 또는 다른 녹색 / 황색 염료를 사용하는 연구는 blebbistatin 강수량은 고려되어야 표지 세포로 오인 될 수 있습니다. 침전을 blebbistatin 방지하는 즉, 간단, 하나는 37 (사전 예열에 blebbistatin를 해산한다 ° C 이상)과 격렬하게 교반 미디어.
APD (최대 10 μM까지) blebbistatin의 높은 농도로 사용될 수있다. 13,14,25를 분석합니다. 수축을 증가시키는 약물을 사용하는 경우 마찬가지로, blebbistatin의 추가 응용 프로그램을 권장합니다.
마우스 SAN 전기적 활성도, 낮은 해상도 멀티 - 전극 어레이 (정사각형 8 × 8 64 개별 전극, 0.55 mm의 전극 간 거리를 갖는 구성) (26) 사이의 짧은 거리에서 이루어지는 연속 유리 미세 기록을 연구하는 다른 기술로서 신체 관통 형
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| water jacket | Radnoti | 1660 Series Tissue Bath for Large Organ or Single Cell Isolation Procedures | |
| water bath / circulator | Fisher Scientific | 1016S | |
| pressure amplifier | AD Instruments | MLT0670 | |
| EMD Millipore Nylon Net Filters | Fisher Scientific | NY1102500 | |
| Pressure transducer | AD Instruments | MLT0670 | |
| Stainless Steel Minutien Pins - 0.1 mm Diameter | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Perfusion pump | World Precision Instruments | PERIPRO-4LS | |
| Superfusion pump | World Precision Instruments | PERIPRO-4HS | |
| Vannas Tubingen scissors | World Precision Instruments | 503379 | |
| Dumont forceps | World Precision Instruments | 501201, 500085 | |
| Mayo scissors | World Precision Instruments | 501750 | |
| Kelly hemostatic forceps | World Precision Instruments | 501241 | |
| Iris forceps | World Precision Instruments | 15917 | |
| Iris scissors | World Precision Instruments | 501263 | |
| ECG 12 mm needle (29-gauge) electrodes (monopolar) | AD Instruments | MLA1203 | |
| in-line Luer injection port | Ibidi | 10820 | |
| Ultima-L CMOS camera | SciMedia | MiCAM-05 | |
| halogen lamp | Moritex USA Inc | MHAB-150W | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-1 | |
| CaCl2 (2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| KCl | Fisher Scientific | S217-500 | |
| MgCl2 (6H2O) | Fisher Scientific | M33-500 | |
| NaH2PO4 (H2O) | Fisher Scientific | S369-500 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | S233-3 | |
| D-Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Blebbistatin | Tocris Bioscience | 1760 | |
| RH237 | ThermoFisher Scientific | S1109 | |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 |
References
- Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. Optical imaging of the heart. Circ Res. 95 (1), 21-33 (2004).
- Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells & tissues. Circ Res. 110 (4), 609-623 (2012).
- Fedorov, V. V., Glukhov, A. V., Chang, R. Conduction barriers and pathways of the sino-atrial pacemaker complex: their role in normal rhythm and atrial arrhythmias. Am J Physiol Heart Circ Physiol. , (2012).
- Boyett, M. R., Honjo, H., Kodama, I. The sinoatrial node, a heterogeneous pacemaker structure. Cardiovasc Res. 47 (4), 658-687 (2000).
- Glukhov, A. V., et al. Sinoatrial Node Reentry in a Canine Chronic Left Ventricular Infarct Model: The Role of Intranodal Fibrosis and Heterogeneity of Refractoriness. Circ Arrhythm Electrophysiol. , (2013).
- Glukhov, A. V., et al. Calsequestrin 2 deletion causes sinoatrial node dysfunction and atrial arrhythmias associated with altered sarcoplasmic reticulum calcium cycling and degenerative fibrosis within the mouse atrial pacemaker complex. Eur Heart J. 36 (11), 686-697 (2015).
- John, R. M., Kumar, S. Sinus Node and Atrial Arrhythmias. Circulation. 133 (19), 1892-1900 (2016).
- Swaminathan, P. D., et al. Oxidized CaMKII causes cardiac sinus node dysfunction in mice. J Clin Invest. 121 (8), 3277-3288 (2011).
- Glukhov, A. V., Fedorov, V. V., Anderson, M. E., Mohler, P. J., Efimov, I. R. Functional anatomy of the murine sinus node: high-resolution optical mapping of ankyrin-B heterozygous mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 299 (2), H482-H491 (2010).
- Egom, E. E., et al. Impaired sinoatrial node function and increased susceptibility to atrial fibrillation in mice lacking natriuretic peptide receptor C. J Physiol. 593 (5), 1127-1146 (2015).
- Torrente, A. G., et al. Burst pacemaker activity of the sinoatrial node in sodium-calcium exchanger knockout mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (31), 9769-9774 (2015).
- Lang, D., Sulkin, M., Lou, Q., Efimov, I. R. Optical mapping of action potentials and calcium transients in the mouse heart. J Vis Exp. (55), e3275 (2011).
- Fedorov, V. V., et al. Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts. Heart Rhythm. 4 (5), 619-626 (2007).
- Swift, L. M., et al. Properties of blebbistatin for cardiac optical mapping and other imaging applications. Pflugers Arch. 464 (5), 503-512 (2012).
- Laughner, J. I., Ng, F. S., Sulkin, M. S., Arthur, R. M., Efimov, I. R. Processing and analysis of cardiac optical mapping data obtained with potentiometric dyes. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 303 (7), H753-H765 (2012).
- Liu, J., Dobrzynski, H., Yanni, J., Boyett, M. R., Lei, M. Organisation of the mouse sinoatrial node: structure and expression of HCN channels. Cardiovasc Res. 73 (4), 729-738 (2007).
- Verheijck, E. E., et al. Electrophysiological features of the mouse sinoatrial node in relation to connexin distribution. Cardiovasc Res. 52 (1), 40-50 (2001).
- Krishnaswamy, P. S., et al. Altered parasympathetic nervous system regulation of the sinoatrial node in Akita diabetic mice. J Mol Cell Cardiol. 82, 125-135 (2015).
- Nygren, A., Lomax, A. E., Giles, W. R. Heterogeneity of action potential durations in isolated mouse left and right atria recorded using voltage-sensitive dye mapping. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287 (6), H2634-H2643 (2004).
- Efimov, I. R., Fedorov, V. V., Joung, B., Lin, S. F. Mapping cardiac pacemaker circuits: methodological puzzles of the sinoatrial node optical mapping. Circ Res. 106 (2), 255-271 (2010).
- Aschar-Sobbi, R., et al. Increased atrial arrhythmia susceptibility induced by intense endurance exercise in mice requires TNFalpha. Nat Commun. 6, 6018 (2015).
- Hansen, B. J., et al. Atrial fibrillation driven by micro-anatomic intramural re-entry revealed by simultaneous sub-epicardial and sub-endocardial optical mapping in explanted human hearts. Eur Heart J. 36 (35), 2390-2401 (2015).
- Lang, D., Petrov, V., Lou, Q., Osipov, G., Efimov, I. R. Spatiotemporal control of heart rate in a rabbit heart. J Electrocardiol. 44 (6), 626-634 (2011).
- Kanlop, N., Sakai, T. Optical mapping study of blebbistatin-induced chaotic electrical activities in isolated rat atrium preparations. J Physiol Sci. 60 (2), 109-117 (2010).
- Glukhov, A. V., Flagg, T. P., Fedorov, V. V., Efimov, I. R., Nichols, C. G. Differential K(ATP) channel pharmacology in intact mouse heart. J Mol Cell Cardiol. 48 (1), 152-160 (2010).
- Wu, J., et al. Altered sinoatrial node function and intra-atrial conduction in murine gain-of-function Scn5a+/DeltaKPQ hearts suggest an overlap syndrome. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302 (7), H1510-H1523 (2012).
