Summary
我们提出了一个协议，用于干涉式光活化的定位显微镜（iPALM），3维单分子定位超分辨率显微镜方法的应用，以便在贴壁哺乳动物细胞的肌动蛋白细胞骨架的成像。这种方法允许的纳米结构特征，否则将通过常规的衍射限制的光学显微镜仍未解决基于光的可视化。
Abstract
荧光显微镜使细胞内的特定生物分子的直接可视化。但是，对于以往的荧光显微镜，空间分辨率由衍射图像平面和> 500nm的沿着光轴内限制为〜200纳米。其结果是，荧光显微镜早已严重中的超微结构特征的细胞内观察的限制。最近的超分辨率显微镜方法发展克服了这一限制。特别是，光开关的荧光团的到来使基于与定位超分辨率显微镜，其提供接近分子长度尺度的分辨率。在这里，我们描述了基于单分子定位显微镜和多相干涉三维超高分辨率显微镜方法，称为干涉光敏定位显微镜（iPALM）的应用程序。这种方法提供了几乎各向同性分辨率为20nm顺序在所有三个维度。可视化丝状肌动蛋白骨架，其中包括iPALM仪器的样品制备和操作方案，如下所述。这些协议也容易适应，并启发对其他超微结构细胞研究。
Introduction
复杂的细胞结构的可视化一直是不可或缺的生物的见解和发现。虽然荧光显微镜可以形象细胞高分子特异性，其分辨能力被衍射限定在图像平面〜200纳米（X，Y，或横向尺寸）和> 500nm的沿着光轴（z或轴向尺寸） 1,2。因此，超微结构特征观察历来限于电子显微镜（EM）。幸运的是，最近的超分辨率显微镜的发展已经绕过这个限制，使得在10空间分辨率- 100纳米范围1-6。具体地，超分辨率方法的基础上的单分子的定位，由缩略词如PALM（光敏定位显微镜）4，FPALM（荧光光敏定位显微镜） 图5（d）风暴（直接随机光学重构显微术）6,7，涂料（已知宝成像纳米形貌）8 INT积累，GSDIM（基态耗尽显微术，随后由个别分子返程）9，或SMACM（单分子有源控制显微镜）10，以及它们的3维（3D）实现方式中，如干涉PALM（iPALM）11或3D风暴12日 ，在揭示新的见解无数的生物结构的纳米级组织，包括神经元轴突已经有价值和突触13，粘着斑14,15，细胞间的连接处16，核孔17和中心体18-20，仅举几例。
在这超分辨率显微镜是潜在有用的细胞超微结构的另一个特点是肌动蛋白骨架。丝状（F）肌动蛋白在细胞皮质复杂小梁在细胞形状和机械性能21的控制中起重要作用。该组织为OF F肌动蛋白积极并动态调节尽管这强烈地影响聚合，交联，周转率，稳定性，和网络拓扑22众多调节蛋白。然而，尽管F-肌动蛋白小梁结构的特征为机械见解重要成不同范围的细胞过程中，小尺寸（〜8纳米）的f微丝阻碍通过常规衍射限制光镜的观察;因此，肌动蛋白的精细结构的可视化迄今完全由EM执行。在这里，我们描述了可视化的贴壁哺乳动物细胞中的F-肌动蛋白细胞骨架，使用iPALM超分辨率显微镜技术，以利用其精度非常高的能力，在3D 11,23协议。虽然iPALM仪器高度专业化，对设立这样一台仪器指令已经描述了最近23，同时获得由何主办的iPALM显微镜病房休斯医学研究所也已提供给以最小的成本研究团体。此外，本文描述的样品制备方法是直接适用于替代三维超分辨率方法中，如根据点扩散函数（PSF）的象散散焦那些12或双平面检测24，这是更广泛地可用。
我们注意到，在一般的基于定位单分子超分辨率显微镜的必要成分是光开关荧光团25，其允许基于本地化单分子超分辨率显微镜三个重要的要求必须满足：ⅰ）高的单分子亮度和对比度相对于背景信号; II）在给定的图像帧单分子分布稀疏;和iii）高贴标足以捕获底层结构（也称为奈奎斯特沙的轮廓空间密度n非取样标准）26。因此，对于满意的结果，应强调同样在两个试样的适当准备放置优化荧光光控和维护底层超微结构，以及在实验的仪器和采集方面。
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Protocol
1.成像试样制备
- 因为背景的荧光信号与来自荧光团标签荧光干扰，通过在去离子水漂洗它们（DDH 2 O的），然后使用压缩空气空气干燥它们清洗盖玻片。接着，在等离子体清洁器执行等离子体蚀刻15秒，或更长的时间，如果必要的。
- 为使漂移校正和iPALM校准，使用＃1.5圆（22毫米直径）嵌入荧光纳米粒子作为基准标记，供应可靠校准和漂移校正的高度光基准预清洁盖玻片。由于积累足够的荧光密度需要很长的采集时间（> 15 - 30分钟），样品漂移是不可避免的。
- 将每个fiducialed玻璃罩到6孔组织培养板。通过紫外线（UV）辐射在层流罩15分钟消毒他们。
- 在无菌层流罩，准备成纤维10微克/毫升 - 通过稀释在无菌的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（DPBS）1mg / ml的纤连蛋白储备溶液至最终浓度2玻璃罩涂层的Nectin溶液。冲洗每个用DPBS玻璃罩三次，并在4℃下与2ml纤连蛋白溶液孵育过夜。接着，吸出纤连蛋白溶液并用DPBS冲洗一次。
- 冲洗细胞简要DPBS。用1孵育 - 2 ml的胰蛋白酶的几分钟，在37℃，直到细胞分离并用约10毫升新鲜含血清细胞培养基的淬灭。例如，对于人脐静脉内皮细胞（HUVEC），用补充有大血管内皮因子和青霉素或链霉素大血管内皮培养基。
- Replate细胞到纤连蛋白包被的盖玻片（为稀疏密度，板<每玻璃罩50,000个细胞），并维持培养中设定为95％的湿度，5％CO 2的培养箱，和37＆＃176℃。
- 为F-肌动蛋白细胞骨架的精细结构的适当的保存，使用基于良好的缓冲试剂27缓冲溶液。
- 例如，制备PHEM缓冲液作为2×储液（120毫摩尔PIPES，50mM的HEPES，20mM的EGTA，4mM的MgCl 2的，pH为7.0，用KOH）溶解6.5克的HEPES，3.8克的EGTA，和190毫克的的MgCl 2〜300毫升DDH 2 O的，具有通过逐滴加入浓KOH溶液调节至7.0的pH值;然后，加入DDH 2 O的使体积为500毫升。使用0.22微米的过滤消毒的缓冲区，它保存在4℃，稀释1：使用前DDH 2 O的1。
- 用于与F-肌动蛋白的高密度标记最好的结果，使用鬼笔环肽缀合与有机荧光团，如的Alexa Fluor 647在细胞replating后所需的时间点，固定细胞如下：
- 吸从每个文化以及包含CE媒体LL标本。轻轻，但很快免除2ml含在PHEM缓冲0.25％戊二醛与0.25％的Triton X-100温水（37℃）提取固定剂。 2分钟 - 在室温下搅拌1孵育它。对于随后的步骤中，使用2毫升固定液或骤冷缓冲每玻璃罩，除非另有说明。
- 替换在PHEM缓冲2.5％戊二醛固定液中提取固定剂，让样品孵育10 - 12分钟。这和以下步骤在室温下都进行。
- 吸出固定液及轻轻地用PHEM缓冲替换它们。倾斜和旋转轻轻地，然后用PHEM洗一遍。重复两次。
- 以猝灭从戊二醛自发荧光，其可以压倒从所需荧光团信号，以在0.1％在PHEM质量含有浓度加入NaBH 4新鲜制备淬火缓冲器孵育标本。丰富的气泡会被观察到。偶尔抽头的样本盘轻轻DISLodge气泡。让它孵育5 - 10分钟。
- 吸出淬火缓冲区，并轻轻地用PHEM缓冲区替换它。冲洗几次，以清除气泡。吸移管在2ml PHEM缓冲液和让它在黑暗中孵育5分钟。重复两次，完成后让PHEM缓冲标本休息。
- 准备一个湿度室使用大塑料培养皿填充用一张纸巾用5蘸慷慨鬼笔环肽孵化- 10毫升的DDH 2 O的将一大张干净的封口膜对湿纸巾之上。
- 由于鬼笔标记的成本相对较高，使用小体积的每个标签。用于高密度标记，开始以0.3μM的浓度。每次准备在PHEM缓冲用鬼笔环肽的Alexa Fluor 647玻璃罩〜60微升。
- 移液器55 - 60微升的鬼笔解决方案到封口膜板在潮湿室。用细镊子，轻轻取出试样coverg姑娘。要小心，要注意正确的含有细胞的脸。
- 通过触摸与一张折叠微妙的吸水纸的玻璃罩的边缘快速轻轻拍打多余的缓冲，然后将面朝下到上的封口膜毒伞素溶液滴在盖玻片细胞的一面。确保没有被玻璃罩被困气泡。
- 放置在湿度室盖。包裹室铝箔保护它不受环境光，让样品在4℃孵育过夜。可将样品保持在该状态下数天。确保如果长期储存计划湿度室保持湿润。
- 成像之前，轻轻玻璃罩细胞面朝上放置到含2ml PHEM缓冲液每孔新的6孔板中。
- 使用下列储备溶液制备氧清除的基于硫醇成像缓冲器：1M的葡萄糖，1M半胱胺，以及100×葡萄糖氧化酶/过氧化氢酶mixtURE（4毫克过氧化氢酶，并在100μlPHEM缓冲液中，通过涡旋充分混合10毫克葡萄糖氧化酶）28。成像前右，混合75微升1M的葡萄糖溶液，1M的半胱胺溶液30微升，和3微升100倍的股票酶混合物中。将音量调节到300微升与PHEM缓冲液和混合装入样品后，立即使用。
- 为iPALM，用预清洁＃1.5玻璃罩（直径22毫米）制备成像样品。
- 另外，使用玻璃载片（3“×1”）的双面粘合间隔件在组装以有助于如果基于散光-3D-STORM 12将被替代。
- 组装成像样品，用细镊子轻轻取出从缓冲区标本玻璃罩好。然后，很快，轻轻触摸折叠吸水纸玻璃罩的边缘挖掘多余的缓冲区。
- 放在一块干净的镜头纸朝上玻璃罩细胞的一面。冲洗样品通过将30 - 50微升成像缓冲器的样品上，并通过倾斜，并与折叠的吸收纸轻敲除去过量的缓冲液。
- 重复该漂洗步骤几次，然后将30 - 50微升成像缓冲器的样品上。印迹干燥玻璃罩的边缘，并放置快速固化的环氧树脂的多个非常小的点到干燥区。
- 慢慢放下另一预清洗＃1.5玻璃罩（平原，圆形玻璃罩，18毫米直径）到含有细胞的22毫米玻璃罩的中心。让成像缓冲器通过毛细作用润湿两个盖玻片。快速固化环氧树脂的小点要坚持两个盖玻片。
- 轻轻按压在使用折吸水纸均匀地分散压力组装的样本。使用足够的压力以使样品细胞薄而均匀（<15微米），但没有那么多，以粉碎细胞。通过观察牛顿环图案衡量适当的厚度。此外，确保执行此STEP轻轻地减少气泡。如果需要，实行空盖玻片几次事前。
- 融化的凡士林，羊毛脂，石蜡密封样品（VALAP，从100备现货G各自凡士林，羊毛脂，石蜡的，熔化在一起）29，冲洗与DDH 2 O的密封的样品，并吹干用压缩空气。样品现在准备安装到显微镜成像。
2.样品放置和iPALM对齐
- 向上移动至弹簧加载顶物镜，以允许用于去除样品架的。在步骤1.10中制备的密封样品放置到样本保持器，并与几个小稀土类磁铁固定。在成像样品的两侧施加浸油。将样品架回光路，轻轻地降低顶物镜。
- 打开激发激光器。打开电子倍增电荷耦合器件（EMCCD）相机帧传输模式。
- 旋转在适当的发射滤光片。激活机械快门来阻断顶部光束路径（ 图1A），并打开底部光束路径。通过翻译使用压电致动器小增量带来底部物镜成为关注的焦点。
- 一旦该基准是在焦点，打开顶部光束路径而阻断底部束路径而带来的顶部物镜聚焦以类似的方式。监视计算机显示为最佳聚焦于基准的宽度。
- 为适当的中心定位，开放的顶部和底部光束路径。手动调整顶部物镜而底部目标是使用一对微细螺钉保持恒定，直到基准图像被尽可能重叠，理想中的一个像素。
- 接着，进行精细的调整，使在步骤基准图像2.3的EMCCD像素的十分之一内重叠。调整前通过控制软件2轴压电式后视镜，而同时持有物镜和底部反射镜不变。经由计算机显示屏比较的顶部的基准点和底客观的观点的中心引导过程。
3. iPALM设置校准
注意：由于荧光发射是不连贯的，用于向在iPALM被观测到的干扰，路径长度通过在顶部和底部的目标必须是相互靠近，在几微米之内。这可以实现如下：
- 与上，摄像机连续流，并且两个顶部和底部光束路径开放的激光器，使用由控制软件用于连续z轴振荡产生的正弦电压波形超过400纳米的数量级振荡样品架z-压电。
- 服用的事实，即，出于最佳比对时，基准强度变化不大用叔他振荡，手动由于所需的单光子干涉效应向上或向下，直到基准振荡的强度翻译机动束器组件。这表示的光路长度的紧密匹配。 > 10的峰-谷比可以在最佳的情况下（ 图1D）来实现。
- 确保两个在每个表面上的幅度和相位是尽可能均匀穿过田野，调整光束分离器组件的底部反射镜中的小步骤进行微调的间隙和倾斜角度。超过800纳米转换8纳米Z-步骤样品进行分束器精细对准。
- 监视中的相机＃1的基准强度 - 3.调整高度，位置，和倾斜的底部反射镜的小步分光镜组件内，以使得相机＃的振荡相位1相对于摄像机＃2被最大化，理想地在120℃（ 图1B-D）。
- 一旦初始调整完成后，翻译样本扫描包含两个邻近的细胞图像和多基准点的视场适宜。将机箱系统周围阻止杂散光和环境扰动。一旦成像区域被发现，进行中的过程步骤3.4再次，并使用命令“获取校准扫描VS样本压电位置”在主界面记录用于后续z坐标提取使用校准曲线。
4.数据采集
- 一旦所希望的区域被发现，并且获得校正曲线，输入相应的文件名转换成该软件。开的顶部和底部光束路径。增加642-nm激光最大的激励力量。对的Alexa Fluor 647，可能需要荧光团的关闭的初始阶段（ 图2A）。
- 具有恒定642-nm激发5分钟，或者如果需要的话更长暴露，直到SIngle分子闪烁被观察到（ 图2B）。该软件允许在收购过程中的405纳米的光激活一个自动增加。采集帧大批通常都需要对丝状功能清晰可见（> 50000帧）。准备就绪后，在主界面中使用命令“开始iPALM收购”开始采集原始图像集。
- 在采集，调通过调整405-nm激光的强度的光活化水平根据需要（参见图2B中的实施例），以保持适当的闪烁密度。
注意：一旦收购完成后，软件会自动将图像文件转换成适当的二进制格式。在计算服务器中的数据存储库被安装作为网络驱动器，允许数据被直接复制有用于进一步处理。
5.数据处理与分析
- 使用定制开发的软件中提取最佳拟合参数为所有单分子以及用于基准11,15,23进行局部化分析。这产生不仅在x，y坐标，同时也被用于校准曲线分析的强度。
- 导入使用命令在步骤3.5获得的原始校准数据“提取高峰多个标签”中的“文件”菜单下进行单分子定位。在初始定位分析，坐标从摄像机＃得到的1 - 3存在于红色，绿色和蓝色通道，分别与可使用的指挥下保存用于进一步分析“（的.sav）除耗时为IDL”该“文件“菜单。
- 若要从相机＃1把数据- 3到使用嵌入在盖玻片荧光基准注册，选择几个明亮基准为中央图像覆盖（ 例如，图1B）使用命令“锚点基准点”的“图像转换”菜单下。使用三重套定位从摄像机＃1坐标 - 在步骤5.1从明亮基准得到3来计算旋转和缩放矩阵，将带相机＃1和＃3到寄存器与照相机＃2。具有足够大的数目的基准点，可更好地适合来执行高阶多项式翘曲。
- 一旦变换矩阵计算，变换的相机＃1的原始数据 - 3一起，以获得求和的原始数据。执行另一轮定位分析的，以产生一个更精确的x，y坐标，并确定每个摄像机信道向求和原始数据的相对贡献;使用“将原始，保存和另存总和（.DAT）”的指挥下，“图像转换”菜单。此强度比包含z坐标信息。
- 选择一个明亮基准，进行Z-校准使用在弹出的对话框功能“测试风穴3D”通过点击“Z坐标操作”的“特殊功能”菜单下的拟合。这将适合3-正弦函数到3相机通道的强度，以确定校准曲线。然后校准文件被保存用于在主数据集进一步使用。
- 为了测试校准曲线的质量，执行z坐标提取，如前面23所描述。一种用于在井校准系统乖基准，z坐标应线性扩展，因为校准数据集采取在z轴位置的线性扫描。此外，所有的基准点的z位置应与类似的斜率比例。
- 一旦获得满意的校正，对于在步骤4以下步骤5.1-5.3中概述相同的方法获得的原始图像数据集执行定位和变换分析。完成后，加载步骤5中的校准文件。4，进行使用功能“匹克WND文件”和“提取Z坐标”通过点击“Z坐标操作”的“特殊功能”菜单下，在弹出的对话框z坐标提取。
注：由于采集时间> 15分钟，机械漂移是可以预料的。 - 要执行以x漂移校正，Y，请从定位坐标的明亮基准。这个基准应存在于所有的帧。然后，使用X，Y坐标基准漂移在同一框架内对齐所有其他坐标回登记（ 图3A-B）使用功能“测试/写指南之星”的“图像转换”菜单下。 Z坐标登记由同样通过点击“Z坐标操作”的“特殊功能”菜单下访问“测试指南之星”和“写入指南之星”，在弹出的对话框功能来执行。
- 作为样品可以表现出轻微的倾斜，通过点击提供的x，y，3参考点z坐标使用功能在弹出对话框“删除XYZ倾斜”定义应设置电平的平面进行倾斜校正“ Z坐标操作特殊功能“菜单中的”下“。
- 继漂移和倾斜校正，节省定位坐标。通过主界面上的“渲染”命令重建作进一步的分析（ 图4A-D）的超级分辨率的图像。颜色可以用来指示z坐标。可替代地，所选择的区域的侧视图也可以呈现。本地化坐标可以导出为文本文件，进一步量化，或者重建图像可以保存为.tif文件。
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Representative Results
对于iPALM关键要求是对准，配准，并且光学系统的校准。这些是必要的，以确保3路分束器位于必要的适当的干扰为z坐标萃取。要启用连续监测，荧光不断的点源是必要的。这可以通过使用荧光Au或双金属纳米粒子23的光致发光从局域型表面等离子体共振（LSPR）出现而实现。它们作为在照明用的稳定的单偶极子和通常可以用5本地化 - 10纳米的精度。这些可商购的纳米颗粒发射大多数单分子荧光团，使得两个荧光团和基准点可以与在EMCCD相机类似激发强度和增益设置被成像的范围内的亮度的水平，而不饱和度（ 图1B）。此外，这些基准也大大FACilitate聚焦，由此基准的表观宽度可以在聚焦调整过程中被监测。另外，玻璃罩表面的严格的清洗，例如通过食人鱼蚀刻或等离子体清洗，也是必需的，因为未清洗或清洁不良盖玻片的杂散背景荧光可以很容易地压倒单分子的信号，如前面所述。
iPALM依靠多相干涉，使高精度与Palm（为X，Y）同时z坐标的测量。在iPALM仪器中，每个发射的荧光光子可以被认为是通过两个光路，在定制制造的三路分束器，然后自干扰传播。因此z坐标被编码在被干扰光子的相位。 〜120从三路分束器结果中的单分子图像的3 CAMER之间的强度变化的输出光束°的相互的相位差如，允许ž -从标准曲线的坐标提取。在此基础上，在iPALM样品保持器组件是一个重要的组成部分，因为它配备有一对压电致动器，使向z纳米精密翻译可用于对准和校准。
在适当的聚焦和对准，沿z轴的样品的翻译将产生的干涉效应。这表现为三个摄像机通道（ 图1C-D）之间的基准强度的振荡。这些振荡还表明，这两个顶部和底部光束路径被几乎匹配，允许单光子干扰。通常，当打开仪器中，每个照相机的初始阶段将不会是最佳的和的z轴位置扫描所需的校准和对准的诊断工具。以在最佳相位到达，分束器的底部反射镜（ 图1A）也可以使用压电尖端倾斜阶段进行调整。 20纳米的调整 - 的z位置校准扫描每个小10后拍摄。每个通道中的基准的强度，然后由定位分析测定（ 即，与2D高斯函数拟合）。通过总强度归一化的强度可通过正弦波形近似，从而可以计算出的相位项;由此，对应于每个摄像机的相位可以被确定，如在图1C所示。我们注意到，在iPALM使用的单光子干涉原理也可以使用一个更简单的2路分束器来证明。然而，一个2路分束器是不切实际的三维超分辨率显微镜自处或附近破坏性干扰的限制，在一个信道的信号是最小的，从而导致强度和定位坐标的噪声的估计，这有效地限制的z坐标决心在穰e其中两款相机都具有相当的强度（<100纳米）。克服这种效果所需信道的最小数目为三个，和3-和4路投影系统已在文献11,30已经描述。
在最佳条件下，对一个3路分束器，该3台摄像机之间的相位差应为约120°。对于iPALM 3路分束器包含3个反射界面，如图解图1A。分束器被定位在平面介质镜上面，用薄间隙填充有折射率匹配油，以允许路径的精细调节分束器内长度和，以达到最佳的相位差。如在图1C-D中所示，在用于iPALM的适当对准，照相机是接近120°相互相位差。在实践中，相位差大于105°被普遍接受。这种校准两个INDicates该系统是完全一致，并且它将被用于后续的z坐标萃取。这也有利于评价使用不同的基准产生的校准曲线。大多数基准中度亮度通常发射作为一个单一的偶极子，产生乖巧校准曲线。然而，基准偶尔聚集体（往往是那些极端的亮度）的行为可能出现异常的方式，产生不可靠的校正曲线。它也建议选择附近的摄像视场的中心，并且邻近生物兴趣的区域（ 图1B），特别是因为在iPALM设置中使用的高NA目标透镜是没有校正的平场基准。有效场的视图仅限于中央区域，朝向场边缘越大基准宽度显而易见。
继初始对准，含有理想的MO细胞领域的视图rphology和多个基准，以确保良好的校准被选择进行成像。这可以通过慢慢平移使用2轴伺服马达的驱动器的样本保持器来实现。样品的平移将导致一些散焦，由于样本不是总是完全平坦。因此，重点必须不断在翻译过程中进行调整。一旦成像领域已被选定，另一轮校准以优化校正曲线，然后进行了微调系统对准并获得实际校正曲线。重要的是，核或邻近区域异构折射率（ 例如，气泡）的地区，应避免在一般情况下，因为这些会引起相对路径的显著改变长度，扭曲的z坐标。
高密度的标签，从有机荧光如的Alexa Fluor 647荧光信号可以是非常光明的。如图所示我Q 图2A，用含巯基（-SH）基团31的高浓度的适当的缓冲液制剂中，荧光团应迅速下高激发光照关闭。这导致从大多数分子的荧光信号的抑制。在给定的实例，荧光团的极少数随机返回到“开”的状态。这些预期将稀疏分布，因此可以被可视化为单个分子的一个或切换前几帧“关”。该光控动力学强烈依赖于激发强度和-SH的浓度，并且因此，对于给定的系统中，必须小心，以优化正确标签密度，特别是由于相对高的激发强度（640 - 647纳米）的关掉大部分的Alexa Fluor 647分子的需要。如果激励不够强，亚历氟647意愿显著分数留在“开”的状态，从而导致高背景，在观察单分子荧光，以及最终质量差单分子定位结果的困难。下一个适当的平衡条件下，单分子的原始数据应包含足够大量的每帧（ 图2B）的分子（数百），而每个分子是足够稀疏，以便不含糊检测和定位的分析。这也是值得注意的是，对于iPALM，光控的原则是相同的手掌或强攻，因此，对于iPALM适当的准备样品可以直接在简单的3D-PALM或3D风暴系统。为了获得分子的足够高的密度以满足Nyquist采样，通常为原始数据的5万以上的帧需要（ 即，15总帧数为3台摄像机）。随着收购的进行，荧光的增加部分可以通过破坏性的光漂白被耗尽，导致晶石SER单分子密度。为了弥补这一点，405nm的蓝色光（405纳米）短脉冲可以在时间间隔被照射到样品上，以促进荧光团活化。
由于需要长的采集时间，为iPALM最佳结果（或在一般的单分子定位显微镜）需要低样品漂移和/或良好的漂移校正。例如，使用在帧传输模式（20赫兹帧速率）50毫秒的曝光时间，总的采集时间50,000帧是42分钟。在此期间，经几十纳米的机械漂移的预期。事实上，除了在高定位精度和高标记密度，分辨率也取决于漂移校正质量。有多个起源于这些漂移与热起伏是一个重要原因。由于这样的考虑，在可能的情况，iPALM份使用殷钢，低热膨胀合金，或不锈钢定制加工，两者都具有比黄铜或铝的热膨胀特性要低得多。不幸的是，这还造成附加相对于铝的成本，这是一对光学机械组件更常用的金属，是便宜得多和更容易加工。漂移的其他来源可以是来自外围设备，环境的环境中，或气流机械振动。这些应该通过将系统在合适的外壳和通过重定向在显微镜方面的空气流动方向被最小化。这些设置必须建立在研究级光学平台，如果可能，包含风扇组件应放在离光学平台。然而，尽管所有的预防措施，漂移一定量仍将保持。关键的是，这些漂移必须被最小化，使得图像在整个采集时间保持聚焦。在我们的系统中，这些被动的方法足以减小漂移到可接受的水平。然而，应该有可能实现活性漂移玉米补偿的方式，让长期和高精密显像32。
每个数据集千万单分子峰 - 以下的原始数据的处理中，立体定位的坐标可以与通常5来获得。 如图3所示，漂移作为时间的函数可以从基准点的定位坐标来可视化。多个基准点可以被用来计算平均漂移校正轨迹（ 图3A-B）。此外，习惯上过滤掉定位分析期间适应不良的二维高斯函数的峰值。这可能是由于寄生噪声或部分重叠的单分子的峰，并且可以通过在装配处理计算出的大残差平方误差来区分。低亮度（由光子计数所指示的），因此，较高的不确定性的峰（ 即，大于约25毫微米大）也被滤出，一个这帮从非特异性背景荧光可能出现。同样，对于从该3相机通道的强度很差适合校准曲线的峰也被拒绝，因为得到的z坐标是不可靠的。应当指出的是iPALM（和一般定位显微镜）的全部信息内容是块状的，因为分析结果不仅在荧光团的坐标，也可在几个附加参数，如强度，宽度，亮度等 。然而，在实践中，由于相对较少的计算工具是目前可用于在坐标空间中分析，本地化坐标典型地渲染或重建成供进一步分析基于像素的图像。
对于iPALM图像重建常用的方法是表示与归一化二维高斯函数每个本地化协调，与设置为高铭本地化的不确定性ssian宽度33。因此，高精度坐标（通常单分子峰与抗低背景的高亮度）显示为尖锐和窄峰，而低精度坐标（通常低亮度或高背景单分子峰）显示为调光器和更广泛峰。以这种方式，每个分子有助于图像相同数量的强度。对于3D数据集，z坐标可以使用颜色，通常基于色调标度（ 图4C-D）来表示。或者，该图像可以被显示为一个侧视图（X，Z或y，z）的突起或卷。一些可公开获得的软件可以被用于可视化，例如数据34。
如图4-6所示，iPALM图像收率超过衍射限制荧光显微镜一个显著改善。在HUVEC细胞的f-肌动蛋白结构可以用许多增强空间RESO被可视化（分辨率）。在皮层的区域，不同长丝网络可以看出，而在应力纤维，束，和伪足，密密麻麻f-肌动蛋白网络观察到具有丝状纹理，虽然单独的长丝没有区别。这可能是由于在荧光团的两个亮度和定位精度的限制。不同皮质长丝的存在表明，F-肌动蛋白网络的超微结构足够保存良好;因而，iPALM可以用于表征皮质结构的有用工具。在图5中 ，HUVEC细胞的一个子区域中显示与定量的肌动蛋白丝的轮廓。可以看出，一个灯丝的z直方图的宽度约为15纳米，相对较小的相比，在横向（X，Y）视图〜45纳米，表示iPALM产生在相对z分辨率显著分辨率改善在x，y平面，如预期。然而，由于ACTUF-肌动蛋白的人直径为〜8nm的，目前还不清楚所观察到的长丝是单丝或几个长丝的束。相关成像使用iPALM和EM可能是f-肌动蛋白结构的进一步表征一个有用的策略，但这种方法还没有被应用于研究f-肌动蛋白还23。
图1：iPALM 3-D超高分辨率显微镜的示意图。 iPALM光学A）示意图。双物镜（尼康，NA 1.49 60X）允许每个发射的荧光光子，通过在顶部和底部光光束路径都传播，并且它们被重定向由一对在22.5°取向的镜子在分束器干涉。自干扰的光子的相位成正比δZ，从而将编码荧光团的z坐标，并且可以测量我们ING用的三个输出光束之间〜120°相互相位差的3路分束器。它们是由管透镜（L1〜L3中，f = 400nm）的聚焦和由发射过滤器（F1 - F3）。因此，每个单分子出现带有照相机（EMCCD1-3）之间，但在类似的x，y坐标不同的强度。（A）的再现和从参考修改。标示F-肌动蛋白带的Alexa Fluor 647.亮点HUVEC细胞11（B）衍射极限的形象表示金纳米颗粒的基准点。用于照相机＃1的相位角 - 3由红，绿，和蓝线，分别表示，集中于每个基准，带照相机＃1之间的相位差 - 3表示。比例尺：5微米（C）基准点的图像显示效果干涉。的Au纳米颗粒的基准为每一个摄像机（CCD1-3）或总（总和），取为z位置（单位为nm，在底行）的图像进行扫描以校准。 EA内的强度沟道照相机可以看出用一个相位关系振荡，如图（B）中（D）iPALM校准曲线。样品被沿z轴平移。的Au纳米颗粒的基准为EMCCD1-3的强度是显示红，绿和蓝线，分别为（顶部）。然后这些归一化并且适合于确定的相位差（底部）。期间对准，该系统被调整，以达到所有三个摄像机之间的最大相位差。校准曲线被采取在每个成像网站的提取使用z坐标每个单分子。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2： 铝光控的单分子成像EXA氟647鬼笔为肌动蛋白标签。 （一）初始步光控。在固定细胞F-肌动蛋白是由鬼笔环肽缀合的Alexa Fluor 647高强度的照明，在大多数荧光团的快速关断的含硫醇的图像缓冲区的结果标记以高密度（B）的原料的单分子的代表性帧帧。在稳定状态下闪烁，活化的Alexa Fluor 647应足够稀疏，个别单分子显示为PSF尺寸斑点。 （A）中所示的相同的细胞，具有逆对比显示图像。在扩展酒吧和B：5微米请点击此处查看该图的放大版本。
图3： 使用MULTIP漂移校正。勒基准点四个基准定位坐标（A，x坐标; B，Y坐标）来计算使用多项式件漂移（5 阶 ，在右上角拟合参数）。平均漂移轨迹允许与子5纳米的精度漂移校正（X：3.085纳米，Y：3.606纳米）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4：iPALM 3-D F-肌动蛋白结构的可视化。 （A）的 HUVEC细胞与F-肌动蛋白通过的Alexa Fluor 647鬼笔环肽标记的衍射限制图像（相应于小区的子区域中的图2）。亮点是由于Au纳米颗粒的基准点。
图5：iPALM 可视化的F-肌动蛋白的纳米尺寸。 （A）重建iPALM图像HUVEC细胞F-肌动蛋白标记为B Ÿ的Alexa Fluor 647鬼笔。颜色表示根据彩条的z坐标。比例尺：1微米（B）横向x的横截面直方图，Y定位沿方框区域的长轴（A）坐标。以获得直方图中，坐标被投影到框的长轴并用5纳米仓尺寸分级。灰度曲线表示高斯最佳拟合到直方图，具有半值的43.88毫微米（FWHM）全宽。本地化的z位置（C）的直方图中方框区域的坐标（A）中。的z位置是分档为1纳米的块大小。灰色曲线表示高斯最适合直方图，用17.50的FWHM。 请点击此处查看该图的放大版本。
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图6： 使用不同的标记试剂F-肌动蛋白的iPALM成像比较标记F-肌动蛋白的重建iPALM图像使用的Alexa Fluor 647共轭毒伞素（A）的Alexa Fluor 568共轭毒伞素（B），或通过与肌动蛋白的转染-mEos2融合蛋白表达载体（C）。比例尺（AC）：1微米请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
iPALM的光学系统是基于一个4π双相对目标设计， 如图1A所示 。设置同时使用定制加工和商业光学机械部件构成，如表 1中所述前面23和列出。除了我们的设置中，霍华德休斯医学研究所（HHMI）举办一个系统，是在高级影像中心，科学界在珍利亚农场研究园区访问。对于整个机械图纸，控制原理图和软件，我们鼓励读者在HHMI与哈拉尔赫斯询问进一步的信息。使用iPALM以及其它单分子定位显微镜方法进行可视化f-肌动蛋白的主要优点是相对容易相比EM技术，这通常需要苛刻样本处理，费力的准备，和高度熟练的从业者3,23样品制备的。 AdditionallY，荧光自然是适合于多通道成像，这仍然难以EM。然而，如下面进一步描述，存在用于该方法的几个目前的限制，无论是在样品制备和成像过程而言。首先，作为为EM样品制备的情况下，必须小心，以确保试样35的良好超微结构保存，因为足够分辨率的衍射极限的水平能引起在纳米级严重扰动的协议。肌动蛋白显像，该细胞的适当的固定是影响试样质量的重要因素。戊二醛是优选的固定剂，因为它保留了细胞骨架和膜非常好，虽然在共染色用抗体的情况下，表位位点可能会受到影响。在这样的情况下，多聚甲醛可以提供可接受的折中，因为它往往会更好地保持抗体表位位点。重要的是单分子定位显微镜，这些固定剂趋向产生背景自体荧光;因而，通过硼氢化定影后淬火是必要的，尤其是在戊二醛的情况下。
此外，荧光团和标记策略的适当选择是用于实验成功的最重要因素之一。由于F-肌动蛋白的纳米级尺寸，需要标签的高密度捕捉底层丝状网络，由奈奎斯特采样定理36所规定。肌动蛋白，鬼笔环肽允许非常高密度标记，具有广泛的可得自许多制造商的有机荧光团。然而，由于鬼笔环肽是有毒的，细胞固定和透化是必需的。活细胞肌动蛋白兼容标签替代战略包括使用荧光蛋白（FP）融合，无论是与肌动蛋白单体或小的肌动蛋白结合的多肽。然而，我们发现，这些往往产生较低标签密度相比鬼笔环肽（
）39。这同样适用于iPALM的优点和局限性。相比于其他的3维超分辨率显微镜技术，iPALM一直保持到最新的分辨最高光的办法，特别是沿z轴，与z分辨率比的x，y分辨率11近2倍更好。然而，iPALM对干涉的依赖要高的z分辨率还对成像深度的限制，因为校准曲线是周期性的。换句话说，z坐标重复每250纳米左右（的Alexa Fluor 647的为〜700nm的发射波长）。在实践中，这可以通过使用TIRF照明，这限制了激发区的渐逝场深度内处理<从玻璃罩200纳米。因此，入试样不兴奋，并保持隐形荧光团更深。然而，这也限制了可成像以那些在靠近玻璃罩，如粘着斑，皮质细胞骨架，和腹侧质膜，而更多的内部结构是够不着的生物结构。对于固定的标本，一个补救措施是进行cryosectioning 40。然而，这样的做法是非常费力的，并且需要专门知识是不常见的访问。
另外，iPALM可以通过干涉与3D-STORM采用散光散焦方案结合12适于扩展Z-范围。这种方法提供了双重z坐标读数，首先由干涉，这是高的精度，但周期性的，和所述第二通过象散散焦，这是不太精确但是非周期性的。然后后者可以用来“解开”或打破的简并性干涉z坐标，从而使iPALM成像深度为〜750纳米的三倍，有效地接近的高NA物镜的内在震源深度。与相位展开，iPALM已被用于图像结构深的样品内，如线粒体，尽管在所有3个维度稍微降低精度由于额外的散焦40。
iPALM的另一个固有局限性是成像速度。由于帧的大量需要获得定位坐标的高密度，相机速度通常是在采集速率的极限。在10运行电流EMCCD相机 - 20MHz的读出速率，需要数十分钟的一段足够数量的帧。这样长的时间尺度需要将标本固定。这里，最近在照相机技术的进步，如更快的科学互补金属氧化物半导体（SCMOS）照相机，可以使在即时快速增加老化速度41，尽管这尚未为iPALM实施爱好。对于一些单分子定位显微镜方法，密集的单分子场可以通过修改后的算法42来分析或压缩传感43。这样的策略的自适应也可通过允许更密集的单分子图像加快iPALM，因此，帧更少。
在速度和成像范围和空间分辨率的限制的优点，对于iPALM一个主要应用是作为一个利用荧光标记的好处揭开特定蛋白质14,15,44的纳米级组织的超微结构方法。进一步的改进，无论是在光学和荧光技术而言，应使在iPALM空间分辨率进一步提高。例如，iPALM图像处理目前采用相对简单的一阶近似的方法，用由2D高斯函数和作为建模每个单分子sumed是同位素平均偶极子。这可能与最近的方法，其中使用的点扩散函数和偶极取向，或跨越视场的光学像差的显式处理的一个更准确的模型，以显著改善的空间分辨率来扩充。同样，photocaging已经报道，这增强了由大小45的订单荧光亮度。事实上，因为他们的组织超微结构的关键要素已经充分表征的F-微丝骨架可能是在测试iPALM进一步方法发展一个非常有价值的模型系统。光镜与真正的EM级分辨能力来分析蛋白质组织的能力，预计将大大增强我们的细胞结构和功能的众多方面的理解。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
YW和PK非常感谢来自新加坡国家研究基金会，授予PK（NRF-NRFF-2011-04和NRF2012NRF-CRP001-084）的资金支持。我们也感谢对基础设施的支持MBI开放实验室，显微镜的核心设施。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| optical table | Newport, CA | RS4000 | iPALM, installed on 4 Newport Stabilizer vibration isolators |
| vibration isolator for optical table | Newport, CA | S-2000 | |
| laser-642 | Newport, CA | 1185055 | output power=100 mw |
| laser-561 | Newport, CA | 1168931 | output power=200 mw |
| laser-488 | Newport, CA | 1137970 | output power=200 mw |
| laser-405 | Newport, CA | 1142279 | output power=100 mw |
| broadband dielectric mirrors | Thorlabs, NJ | BB1-E02 | laser combiner |
| dichroic beamsplitter | Semrock, NY | LM01-427-25 | |
| acousto-optic tunable filter | AA Opto-Electronic, France | AOTFnC-VIS-TN | |
| Linear polarizer | Newport, CA | 05LP-VIS-B | |
| baseplate | local workshop | customized | |
| turning mirror (22.5°) | Reynard Corpporation, CA | customized | 22.5° mirror |
| motorized optic mounts | New Focus, CA | 8816 | |
| motorized XYZ translation stage | Thorlabs, NJ | MT3/M-Z6 | sample holder |
| T-Cube DC servo motor controller | Thorlabs, NJ | TDC001 | |
| Piezo Phase Shifter | Physik Instrumente, Germany | S-303.CD | |
| objective lens | Nikon, Japan | MRD01691 | objective. Apo TIRF 60X/1.49 oil |
| translation stage | New Focus, CA | 9062-COM-M | |
| Pico Motor Actuator | New Focus, CA | 8301 | |
| rotary Solenoid/Shutter | DACO Instruments, CT | 5423-458 | |
| 3-way beam splitter | Rocky Mountain Instruments, CO | customized | beamsplitter |
| Piezo Z/Tip/Tilt scanner | Physik Instrumente, Germany | S-316.10 | |
| motorized five-axis tilt aligner | New Focus, CA | 8081 | |
| Picmotor ethernet controller | New Focus, CA | 8752 | |
| Piezo controllers/amplifier/digital operation module | Physik Instrumente, Germany | E-509/E-503/E-517 | |
| band-pass filter | Semrock, NY | FF01-523/20 | filters |
| band-pass filter | Semrock, NY | FF01-588/21 | |
| band-pass filter | Semrock, NY | FF01-607/30 | |
| band-pass filter | Semrock, NY | FF01-676/37 | |
| notch filter | Semrock, NY | NF01-405/488/561/635 | |
| motorized filter wheel with controllter | Thorlabs, NJ | FW103H | |
| EMCCD | Andor, UK | DU-897U-CSO-#BV | 3 sets |
| Desktop computers for controlling cameras and synchronization | Dell | Precision T3500 | PC, 4 sets |
| coverslips with fiducial | Hestzig, VA | 600-100AuF | sample preparation. fiducial marks with various density and spectra available |
| fibronectin | Millipore, MT | FC010 | |
| paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences, PA | 15710 | fixation. 16% |
| glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences, PA | 16220 | 25% |
| triton X-100 | Sigma aldrich, MO | T8787 | |
| HUVEC cells | Life Technologies, CA | C-015-10C | |
| Medium 200 | Life Technologies, CA | M-200-500 | |
| Large Vessel Endothelial Factors | Life Technologies, CA | A14608-01 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | 14190367 | ||
| Pennicillin/Streptomycin | 15140122 | ||
| Trypsin/EDTA | Life Technologies, CA | 25200056 | |
| PIPES | Sigma aldrich, MO | P1851 | PHEM |
| HEPES | 1st base, Malaysia | BIO-1825 | |
| EGTA | Sigma aldrich, MO | E3889 | |
| MgCl2 | Millipore, MT | 5985 | |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Invitrogen, CA | A22287 | staining |
| sodium borohydride (NaBH4) | Sigma aldrich, MO | 480886 | quenching |
| glucose | 1st base, Malaysia | BIO-1101 | imaging buffer |
| glucose oxidase | Sigma aldrich, MO | G2133 | |
| catalase | Sigma aldrich, MO | C9322 | |
| cysteamine | Sigma aldrich, MO | 30070 | |
| Epoxy | Thorlabs, NJ | G14250 | |
| vaseline | Sigma aldrich, MO | 16415 | sample sealing |
| lanolin | Sigma aldrich, MO | L7387 | |
| parafin wax | Sigma aldrich, MO | 327204 | |
| Immersion oil | Electron Microscopy Sciences, PA | 16915-04 | imaging. Cargille Type HF |
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