Summary
Vi presenterar ett protokoll för tillämpning av interferometriska photoactivated Lokalisering Microscopy (iPALM), en 3-dimensionell enda molekyl lokalisering superupplösning mikroskopi metoden, avbildning av aktin cytoskelettet i vidhäftande däggdjursceller. Detta tillvägagångssätt gör ljusbaserad visualisering av nanoskala strukturella egenskaper som annars skulle förbli olösta genom konventionell diffraktionsbegränsad optisk mikroskopi.
Abstract
Fluorescensmikroskopi möjliggör direkt visualisering av specifika biomolekyler inom celler. Men för konventionell fluorescensmikroskopi, är den spatiala upplösningen begränsad av diffraktion till ~ 200 nm inom bildplanet och> 500 nm längs den optiska axeln. Som ett resultat, fluorescensmikroskopi har länge varit starkt begränsad i observationen av ultrastrukturella egenskaper inom celler. Den senaste tidens utveckling av superupplösning mikroskopimetoder har övervinna denna begränsning. Särskilt tillkomsten av photoswitchable fluoroforer möjliggör lokalisering baserade superupplösning mikroskopi, som ger upplösningsförmågan närmar molekyl-längdskala. Här beskriver vi tillämpningen av en tredimensionell superupplösning mikroskopi metod som bygger på en enda molekyl lokalisering mikroskopi och flerfasig interferometri, kallas interferometriska photoactivated Lokalisering Microscopy (iPALM). Denna metod ger nästan isotropiska upplösning påstorleksordningen 20 nm i alla tre dimensioner. Protokoll för att visualisera den filamentösa aktincytoskelettet, inklusive extraktion och drift av iPALM instrumentet, beskrivs här. Dessa protokoll är också lätt anpassningsbar och lärorikt för studier av andra ultra funktioner i celler.
Introduction
Visualisering av komplexa cellulära strukturer har länge varit en integrerad del av biologiska insikter och upptäckter. Även fluorescensmikroskopi kan bildceller med hög molekylspecificitet, dess upplösningsförmåga är begränsad av diffraktion till ~ 200 nm i bildplanet (x, y, eller lateral dimension) och> 500 nm längs den optiska axeln (z, eller axiell dimension) 1,2. Därför har observationen av ultra funktioner historiskt varit begränsade till elektronmikroskopi (EM). Lyckligtvis har den senaste utvecklingen av superupplösning mikroskopi kringgås denna gräns, vilket möjliggör spatial upplösning i 10-100 nm 1-6. I synnerhet, strategier superupplösning baserad på samma molekyl lokalisering, känd av akronymer såsom PALM (photoactivated Lokalisering Microscopy) 4, FPALM (Fluorescence photoactivated Lokalisering Microscopy) 5 (d) STORM (direkt Stochastic Optical återuppbyggnad Microscopy) 6,7, färg ( point Ackumulering för Imaging Nanoscale Topography) 8, GSDIM (grundtillståndet Depletion Mikroskopi följt av enskilda molekyl avkastning) 9, eller SMACM (Single-Molecule Active-Control Mikroskopi) 10, såväl som deras 3-dimensionella (3D) implementeringar, såsom interferometrisk PALM (iPALM) 11 eller 3D-STORM 12, har varit värdefulla i att avslöja nya insikter i nano organisation av ett flertal biologiska strukturer, inklusive neuronala axoner och synapser 13, fokala sammanväxningar 14,15, cellcellkontakter 16, kärnpor 17 och centrosom 18-20, för att nämna några.
En annan ultra funktion i celler som superupplösning mikroskopi är potentiellt användbart är aktin cytoskelettet. Den komplexa nätverket av fintrådiga (f) aktin i cellen cortex spelar en viktig roll i kontrollen av cell form och mekaniska egenskaper 21. Organisationen of f-aktin aktivt och dynamiskt regleras även många regulatoriska proteiner som starkt påverkar polymerisation, tvärbindning, omsättning, stabilitet och nätverkstopologin 22. Men även om karakterisering av F-aktin nätverket arkitektur är viktigt för mekanistiska insikter i en rad olika cellulära processer, den lilla storleken (~ 8 nm) av F-aktin filament försvårar deras observation genom konventionell diffraktionsbegränsad ljusmikroskop; därmed visualisering av aktin fin struktur har hittills uteslutande utförs av EM. Här beskriver vi protokoll för att visualisera f-aktin cytoskelettet i vidhäftande däggdjursceller, med hjälp av iPALM superupplösning mikroskopi teknik för att dra fördel av sin mycket hög precision kapacitet i 3D 11,23. Även om iPALM instrumentet högt specialiserad, har instruktioner om att inrätta ett sådant instrument beskrivits nyligen 23, medan tillgång till iPALM mikroskop värd HoWard Hughes Medical Institute har också gjorts tillgängliga för forskarsamhället med minimal kostnad. Dessutom är provframställningsmetoder som beskrivs häri är direkt tillämpliga på alternativa 3D superupplösning metoder, såsom de som är baserade på astigmatisk oskärpa på punktspridningsfunktion (PSF) 12 eller bi-planet upptäckt 24, som är mer allmänt tillgängliga.
Vi noterar att en nödvändig ingrediens för enda molekyl lokalisering baserade superupplösning mikroskopi i allmänhet är photoswitchable fluoroforen 25, vilket gör att de tre kritiska kraven på enda molekyl lokalisering baserade superupplösning mikroskopi vara uppfyllda: i) hög enda molekyl ljusstyrka och kontrast i förhållande till bakgrundssignaler; ii) gles fördelning av enskilda molekyler i en given bildram; och iii) hög spatial densitet av märkning är tillräcklig för att fånga profilen hos den underliggande strukturen (även känd som Nyquist-ShanIcke provtagning kriterium) 26. Således, för tillfredsställande resultat, bör betonas lika på både korrekt beredning av prover för att optimera fluoroforen photoswitching och bevara den underliggande ultra, liksom på instrumentering och förvärvs aspekter av experimenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Imaging Provberedning
- Eftersom bakgrundsfluorescens signaler störa fluorescens från fluoroforen etiketter, rengöra täckglas genom att först skölja dem i avjoniserat vatten (DDH 2 O) och sedan lufttorkning dem med tryckluft. Därefter utför plasmaetsning i en plasma renare under 15 sekunder, eller längre om det behövs.
- För att aktivera driftkorrigering och iPALM kalibrering, använda # 1,5 runda (22 mm diameter) i förväg rengjorda täckglas inbäddade med fluorescerande nanopartiklar som referensmärken, som tjänar som mycket fotostabila referenser för tillförlitlig kalibrering och korrigering av. Grund av den långa inhämtningstiden som krävs för att ackumulera tillräckligt med fluoroforen densitet (> 15-30 min), är provglidning oundviklig.
- Placera varje fiducialed coverglass in i en 6-brunnars vävnadsodlingsplatta. Sterilisera dem genom ultraviolett (UV) strålning i ett dragskåp med laminärt flöde under 15 min.
- I en steril laminärt flöde huva, förbereda fibronectin lösning för coverglass beläggning genom att späda 1 mg / ml fibronektin stamlösning i steril Dulbeccos fosfatbuffrad saltlösning (DPBS) till en slutkoncentration 2-10 ug / ml. Skölj varje coverglass tre gånger med DPBS och inkubera med 2 ml av fibronektinlösningen över natten vid 4 ° C. Därefter aspirera ut fibronektin lösning och skölj en gång med DPBS.
- Skölj cellerna kort med DPBS. Inkubera med 1 - 2 ml av trypsin under några minuter vid 37 ° C tills cellerna lossnar och avbryt reaktionen med ~ 10 ml färskt seruminnehållande cellkulturmedium. Till exempel, för humana navelvenendotelceller (HUVEC), använd stort fartyg endothelial odlingsmedium kompletterat med stora kärl endoteliala faktorer och penicillin eller streptomycin.
- Förnyad utbredning cellerna har laddats in i fibronektin-belagda coverglass (för gles densitet, platta <50000 celler per täckglas) och bibehålla odlingen i en inkubator inställd på 95% fuktighet, 5% CO2, och 37 & #176; C.
- För korrekt bevarande av de fina strukturerna av F-aktin cytoskelettet använda buffertlösningar baserade på god buffertreagens 27.
- Till exempel, förbereda PHEM-buffert som ett 2x stamlösning (120 mM PIPES, 50 mM HEPES, 20 mM EGTA, 4 mM MgCl2, pH 7,0 med KOH) genom upplösning av 6,5 g HEPES, 3,8 g av EGTA och 190 mg av MgCl2 i ~ 300 ml DDH 2 O, med pH justerat till 7,0 genom droppvis tillsats av koncentrerad KOH-lösning; Lägg sedan till DDH 2 O för att bringa volymen till 500 ml. Sterilisera bufferten med hjälp av en 0,22-im filter, förvaras vid 4 ° C, och späda ut det 1: 1 med DDH 2 O före användning.
- För bästa resultat med hög märkning av f-aktin densitet, användning phalloidin konjugerat med organiska fluoroforer, såsom Alexa Fluor 647. Vid önskad tidpunkt efter cell omstryka, fixera cellerna på följande sätt:
- Aspirera media från varje odlingsbrunn innehållande cell prov. Försiktigt men snabbt dispensera 2 ml varm (37 ° C) utvinning fixativ innehållande 0,25% glutaraldehyd i PHEM-buffert med 0,25% Triton X-100. Inkubera i rumstemperatur under 1 - 2 min. För efterföljande steg, använda 2 ml fixativ eller släckning buffert per coverglass, om inte annat anges.
- Byt utvinning fixativ med en 2,5% glutaraldehyd fixativ i PHEM buffert och låt prover inkubera i 10-12 minuter. Detta och följande steg utförs alla vid rumstemperatur.
- Sug ut fixativ och försiktigt ersätta dem med PHEM buffert. Tilt och snurra försiktigt, och sedan tvätta igen med PHEM. Upprepa två gånger.
- Att släcka autofluorescens från glutaraldehyd, som kan överväldiga signaler från de önskade fluoroforer, inkubera proverna med en nygjord släckningsbuffert innehållande NaBH4 vid en masskoncentration på 0,1% i PHEM. Riklig bubblor kommer att observeras. Ibland knacka provet skålen försiktigt Dislodge bubblorna. Låt den inkubera i 5-10 min.
- Sug ut släckningsbuffert och försiktigt ersätta det med PHEM buffert. Skölj några gånger för att rensa bort bubblorna. Pipett i 2 ml PHEM-buffert och låt den inkubera i mörker under 5 min. Upprepa två gånger och låt provet vila i PHEM buffert när du är klar.
- Förbered en fuktkammare för falloidin inkubation med hjälp av en stor plast petriskål vadderad med en bit hushållspapper generöst fuktad med 5 - 10 ml DDH 2 O. Placera ett stort ark av ren Parafilm ovanpå det våta pappershandduk.
- På grund av den relativt höga kostnaden för märkt falloidin, använd en liten volym för varje märkning. För hög märkning densitet, börja med en koncentration av 0,3 | iM. Förbereda ~ 60 | il per coverglass med användning av falloidin-Alexa Fluor 647 i PHEM-buffert.
- Pipettera 55 - 60 pl av falloidin lösningen på Parafilm arket i fuktkammaren. Med fin pincett, försiktigt bort provet covergtös. Var noga med att notera rätt cellinnehållande ansikte.
- Snabbt och knacka försiktigt bort överflödig buffert genom att trycka på kanten av coverglass med en vikt bit av delikata absorberande papper, och sedan placera coverglass cellsidan nedåt på droppe falloidin lösningen på Parafilm. Se till att det inte finns några bubblor fångade av coverglass.
- Placera locket på fuktkammaren. Linda den kammare i aluminiumfolie för att skydda den från omgivande ljus, och låt provet inkubera över natten vid 4 ° C. Provet kan hållas i detta tillstånd under flera dagar. Se till att fuktkammaren förblir fuktig om lång lagringstid planeras.
- Före avbildning, försiktigt placera coverglass cellsidan upp på en ny 6-brunnar innehållande 2 ml PHEM buffert per brunn.
- Förbered syre rensas tiol-baserad avbildning buffertar med hjälp av följande stamlösningar: 1 M glukos, 1 M cysteamin, och 100x glukosoxidas / katalas enzym Mixture (4 mg katalas och 10 mg glukosoxidas i 100 pl PHEM-buffert, blandas väl genom skakning) 28. Precis innan avbildning, blanda 75 | il 1 M glukoslösning, 30 ^ 1 M cysteamin lösning, och 3 pl 100x lager enzymblandningen. Justera volymen till 300 pl med PHEM buffert och använd omedelbart efter blandning för att montera provet.
- För iPALM, förbereda prov avbildning med en i förväg rengjord # 1,5 täckglas (22 mm diameter).
- Alternativt kan du använda en glasskiva (3 "x 1") med en dubbelsidig självhäftande distans för att underlätta monteringen om astigmatism baserad 3D-STORM 12 ska användas i stället.
- För att montera provet avbildning, använd fin pincett för att försiktigt ta bort provet coverglass från bufferten väl. Sedan, snabbt och knacka försiktigt bort överflödig buffert genom att trycka på kanten av täckglas med vikta absorberande papper.
- Placera täckglas cellen uppåt på en bit av ren linspapper. Skölj provetgenom att placera 30 - 50 pl avbildning buffert på provet, och ta bort överflödig buffert genom att luta och knacka med vikta absorberande papper.
- Upprepa sköljningssteget några gånger, och sedan placera 30 - 50 | il av avbildningsbuffert på provet. Torka kanten av täckglas och placera flera mycket små prickar av snabbhärdande epoxi på den torkade området.
- Långsamt sänka annan förren # 1,5 täckglas (vanligt, rund coverglass, 18 mm diameter) på mitten av den cellinnehållande 22 mm coverglass. Låt bildbufferten väta båda täckglas genom kapillärverkan. De små prickar av snabbhärdande epoxi bör följa båda täckglas.
- Tryck försiktigt på den sammansatta provet med vikta absorberande papper för att fördela trycket jämnt. Använd tillräckligt tryck för att göra provcell tunt och jämnt (<15 um), men inte så mycket som att krossa cellerna. Gauge rätt tjocklek genom att observera Newtons ringar mönster. Se också till att utföra denna step försiktigt för att minimera luftbubblor. Om det behövs, öva med tomma täckglas flera gånger i förväg.
- Täta provet med smält vaselin-lanolin-paraffin (valap, stock framställd från 100 g vardera av vaselin, lanolin, och paraffin, smälte samman) 29, skölj förseglat prov med DDH 2 O, och blås torrt med tryckluft. Provet är nu klar för montering på mikroskop för avbildning.
2. Prov Placering och iPALM Alignment
- Flytta den fjäderbelastade övre objektivlins uppåt för att medge avlägsnande av provhållaren. Placera förseglade prov som framställts i steg 1,10 på provhållaren och säkra med flera små sällsynta jordartsmagneter. Applicera immersionsolja på båda sidor av provet avbildning. Placera provhållaren tillbaka i den optiska vägen och försiktigt sänka den övre objektiv.
- Slå på excitation lasrar. Slå på Electron Multiplying Charge-Coupled Device (EMCCD) kamera i ram-överföringsläge.
- Rotera i rätt emissionsfilter. Aktivera en mekanisk slutare för att blockera den övre strålgången (Figur 1A) och öppna den nedre strålbanan. Ta botten objektiv i fokus genom translation i små steg med hjälp av piezo ställdon.
- När förankrings är i fokus, öppna den övre strålgången och blockerar den nedre strålgången och föra den övre objektiv i fokus på ett liknande sätt. Övervaka bredden av utgångs på datorns skärm för optimal fokus.
- För korrekt centrering, öppen både topp- och botten strålbanor. manuellt justera den övre objektivlins medan botten målet hålls konstant med hjälp av ett par av mikrofina ställskruvarna, tills de referens bilderna överlappas så nära som möjligt, företrädesvis inom en pixel.
- Därefter utföra finjusteringar så att de referensbilder i steg 2,3 överlappning inom en tiondel av en EMCCD pixel. Justera toppen2-axliga piezo-monterade speglar via styrprogram medan du håller både objektiv och botten eftertanke speglar konstant. Jämför centra referenserna i toppen och botten objektiva synpunkter via datorskärmen för att styra processen.
3. Kalibrering av iPALM Setup
OBS: Eftersom fluorescensemission är osammanhängande, för störningar som skall iakttas vid iPALM, längder vägen genom de övre och nedre mål måste vara nära varandra, inom några få mikrometer. Detta kan uppnås på följande sätt:
- Med laser på kamerorna kontinuerligt strömmande, och både topp- och botten strålbanor öppna, svänga provhållaren z-piezo använder en sinusformad spänningsvågform alstras av styrprogram för en kontinuerlig z-axelsvängning över en magnitud på 400 nm .
- Dra nytta av det faktum att, när av optimal anpassning varierar förankrings intensitet lite med than oscillation, översätta manuellt den motoriserade stråldelaren aggregatet upp eller ned tills intensiteten hos de referens oscillerar på grund av den önskade enkel-foton-interferenseffekt. Detta innebär ett nära matchning av en optisk väglängd. Ett förhållande topp-till-dal av> 10 kan åstadkommas i optimala fall (figur 1D).
- För att säkerställa att både amplitud och fas vid varje yta är så enhetliga som möjligt över fältet, justera den nedre spegel av stråldelaren enheten i små steg för att finjustera springan och lutningsvinklar. Utför stråldelare fin inriktning genom att översätta provet i 8 nm z-steg över 800 nm.
- Övervaka förankrings intensitet bland kameror # 1 - 3. Justera höjden, positionen och lutningen på botten spegeln i stråldelaren enheten i små steg, så att svängningsfasen av kamera # 1 i förhållande till kameran # 2 maximeras, idealiskt på 120 ° (Figur 1B-D).
- När den förstainriktningen är klar, översätta provet för att söka efter en lämplig synfält som innehåller både celler till bild och flera referenser i närheten. Placera en inneslutning runt systemet för att blockera ströljus och omgivande störningar. När bildområdet hittas utföra proceduren i steg 3,4 igen och spela in kalibreringskurvan för användning i efterföljande z-koordinat extraktioner med kommandot "Hämta Kalibrerings Scans vs prov Piezo Position" i de viktigaste gränssnittet.
4. Data Acquisition
- När ett önskat område hittas och kalibreringskurvan erhålls anger lämpliga filnamn i mjukvaran. Öppna både den övre och nedre balkbanor. Öka excitation makt 642 nm laser för att maximalt. För Alexa Fluor 647, kan en inledande period på fluorofor avstängning behövas (Figur 2A).
- Exponera med en konstant 642-nm excitation under 5 minuter, eller längre om så behövs, tills single molekyl blinkar observeras (Figur 2B). Programvaran tillåter en automatisk ökning med 405 nm fotoaktivering under förvärvet. Ett stort antal förvärvsramar vanligtvis krävs för tråd funktioner för att vara väl synlig (> 50.000 ramar). När du är klar, påbörja förvärv av rå bilduppsättningar med kommandot "Start iPALM Acquisition" i de viktigaste gränssnittet.
- Under förvärvs, avstämma fotoaktiveringsnivå genom att justera intensiteten hos 405-nm laser för att bibehålla den rätta blinkande tätheten som behövs (se exempel i Figur 2B).
OBS: När förvärvet är genomfört kommer programmet automatiskt konvertera bildfiler till rätt binärt format. Det datalagringsutrymme i beräkningen servern är monterad som en nätverksenhet, så att data som skall direkt kopieras dit för ytterligare behandling.
5. Data Processingoch analys
- Utföra lokaliseringsanalys med hjälp av en specialutvecklad programvara för att extrahera mest lämpliga parametrar för alla enskilda molekyler samt referenserna 11,15,23. Detta ger inte bara de x, y-koordinat, men även den intensitet som används för kalibreringskurvan analys.
- Importera råkalibreringsdata som förvärvats i steg 3,5 med kommandot "Utdrag Peaks flera etiketter" under menyn "File" för att utföra enda molekyl lokalisering. Efter den inledande lokaliseringsanalys, koordinater erhålls från kameror # 1 - 3 finns i rött, grönt och blått kanaler, respektive, och kan sparas för vidare analys med kommandot "Spara Bearbetat som IDL (.sav)" under " Arkiv "-menyn.
- Att föra data från kameror # 1 - 3 i registrerings med hjälp av fluorescerande referenserna inbäddade på täck, välja flera ljusa referenser för att ge täckning av den centrala bilden (t.ex.Figur 1B) med kommandot "Anchor referenspunkten" under menyn "Bildtransformations". Använd de tredubbla uppsättningar lokalisering koordinater från kameror # 1-3 erhålls från de ljusa referenserna i steg 5,1 för att beräkna rotation och skalning matris som kommer att ge kameror # 1 och # 3 i register med kamera # 2. Med ett tillräckligt stort antal referenser, kan högre ordningens polynom skevhet utföras för bättre passar.
- När transformationsmatrisen beräknas omvandla rådata av kameror # 1 - 3 tillsammans för att uppnå de summerade rådata. Utför ytterligare en runda av lokalisering analys för att i utbyte ge en mer exakt x, y-koordinat och för att bestämma det relativa bidraget av varje kamerakanal till den summerade rådata; använd kommandot "Trans rå, Spara och spara Sum (dat)" under menyn "Bildtransformations". Denna intensitetsförhållande innehåller z-koordinatinformationen.
- Välj en ljus förankrings och utföra zkalibrering montering med hjälp av funktionen "Test Wind Point 3D" i pop-up dialogrutan genom att klicka på "Z-koordinat Operations" under menyn "Specialfunktioner". Detta kommer att passa 3-sinusformade funktioner för att intensiteterna hos de 3 kamerakanaler för att bestämma kalibreringskurvan. Kalibrerings filen sparas sedan för vidare användning på de viktigaste datamängder.
- För att testa kvaliteten på kalibreringskurvan, utföra z-koordinat extraktion, såsom beskrivits tidigare 23. För väluppfostrade referenser i en väl kalibrerad systemet bör z-koordinaten skala linjärt, eftersom kalibreringsdatamängder tas med en linjär svep i z-positionen. Vidare bör z-positionerna för alla referenserna skala med en liknande lutning.
- När en tillfredsställande kalibrering erhålls utföra lokalisering och omvandling analys för råbilddatamängder som förvärvats i steg 4 efter samma förfarande som beskrivs i steg 5.1-5.3. När du är klar, ladda kalibreringsfilen från steg 5.4 och utför z-koordinat extraktion med funktionerna "Pick WND File" och "Utdrag Z-koordinat" i pop-up dialogrutan genom att klicka på "Z-koordinat Operations" under menyn "Specialfunktioner".
OBS: Eftersom ackvisitionstiden är> 15 min, är mekanisk avdrift som kan förväntas. - För att utföra driftkorrigering i x, y, välj en ljus förankrings från lokaliseringskoordinater. Denna förankrings bör finnas i alla ramar. Sedan använder x, y-koordinat drift av utgångs att anpassa alla andra koordinater inom samma ram tillbaka till registrering (Figur 3A-B) med hjälp av funktionen "Test / Skriv Guide Star" under menyn "Bildtransformations". Z-koordinat registrering kan utföras på liknande sätt genom att gå till "Test Guide Star" och "Skriv Guide Star" funktioner i pop-up dialogrutan genom att klicka på "Z-koordinat Operations" under menyn "Specialfunktioner".
- När provet kan uppvisa svag lutning, utföra tiltkorrigering genom att x, y, z-koordinater för 3 referenspunkter som definierar plan som bör sättas nivå med hjälp av funktionen "Ta bort XYZ Tilt" i pop-up dialogrutan genom att klicka på " Z-koordinat Operations "under" "menyn Specialfunktioner.
- Efter de drift och tilt korrigeringar spara lokaliseringskoordinater. Rekonstruera en superupplösning bild för vidare analys (Figur 4A-D) genom att använda "Render" kommandot på de viktigaste gränssnittet. Färg kan användas för att indikera z-koordinaten. Alternativt kan en sidovy av det markerade området också göras. De lokaliserings koordinater kan exporteras som textfiler för ytterligare kvantifiering eller rekonstruerade bilden kan sparas som en TIF-fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kritiska krav iPALM är inriktningen, registrering och kalibrering av de optiska systemen. Dessa är nödvändiga för att säkerställa korrekt störningar inom 3-vägs stråldelare förutsättning för z-koordinat extraktion. För att möjliggöra kontinuerlig övervakning, fasta punktkällor för fluorescens är nödvändiga. Detta kan åstadkommas med hjälp av fluorescerande Au eller bi-metalliska nanopartiklar 23, vars fotoluminescens uppstår lokaliserad ytplasmonresonans (LSPR). De fungerar som en stabil gemensam dipol vid belysning och kan normalt lokaliseras med 5-10 nm noggrannhet. Dessa kommersiellt tillgängliga nanopartiklar avger en ljusstyrka inom intervallet för de flesta enda molekyl fluoroforer, så att båda fluoroforema och referenserna kan avbildas med liknande excitation intensitet och förstärkningsinställningarna på EMCCD kameror, utan mättnad (Figur 1B). Dessutom är dessa referenser också kraftigt facilitate fokusering, varvid den uppskattade bredden av referenserna kan övervakas under ställa in skärpan. Också, stringent rengöring av coverglass ytan, såsom genom Piranha etsning eller plasmarengöring, även är nödvändigt, eftersom falsk bakgrundsfluorescens av ej rengjorda, eller dåligt rengjorda täckglas lätt kan överväldiga enda molekyl signaler, såsom beskrivits tidigare.
iPALM förlitar sig på flerfasiga interferometri för att möjliggöra hög precision z-koordinat mätning samtidigt med PALM (för x, y). I iPALM instrumentet kan betraktas varje emitterad fluorescens fotonen att fortplanta sig genom både optiska banor, som sedan själv lägga sig i en specialtillverkade 3-vägs stråldelare. Z-koordinaten är således kodad i fasen för den störda fotonen. De ömsesidiga fasskillnader av ~ 120 ° av de utgående strålarna från 3-vägs stråldelare resultat i intensitet variationen av enda molekyl bilder mellan den 3 camersom, så att z - koordinat extraktion från en kalibreringskurva. Baserat på detta, är iPALM provhållarenheten en väsentlig komponent, eftersom den är utrustad med ett par piezoelektriska manövreringsorgan som tillåter nm-precision translation i z som kan användas för inriktning och kalibrering.
Vid rätt fokus och inriktning, kommer översättningen av provet längs z-axeln generera en interferenseffekt. Detta visar sig som oscillationen av utgångsintensiteten mellan de tre kamerakanaler (Figur 1C-D). Dessa oscillationer indikerar också att både de övre och undre optiska strålbanor är nästan matchas, vilket möjliggör enkel-foton-interferens. Vanligtvis när du slår på instrumentet, de inledande faserna av varje kamera kommer inte att vara optimal och genomsökningen av z-positionen behövs som ett diagnostiskt verktyg för kalibrering och justering. Att komma fram till de optimala faser, den nedre spegel av stråldelaren(Figur 1A) kan justeras med hjälp av piezoelektriska tip-tilt stadiet. Kalibrerings genomsökning av z-positionen tas efter varje liten 10-20 nm justering. Intensiteten av referens i varje kanal bestäms sedan genom lokaliseringsanalys (dvs passande med en 2D-Gauss funktion). Intensiteten normaliseras genom totala intensiteten kan approximeras med en sinusformad vågform, vilket gör att fastermen som skall beräknas; således kan fas som motsvarar varje kamera bestämmas, vilket kan ses i Figur 1C. Vi noterar att principen enda foton störningar används i iPALM också kan påvisas med hjälp av en mycket enklare 2-vägs stråldelare. Men det är en två-vägs stråldelare opraktiskt för 3D superupplösning mikroskopi sedan vid eller nära gränsen för destruktiv interferens, är signalen i en kanal minimal, vilket resulterar i bullriga uppskattningar av intensitet och lokaliseringskoordinater, som effektivt begränsar z-koordinaten beslutsamhet att det ringdee där båda kamerorna har stor intensitet (<100 nm). Det minsta antalet kanaler som behövs för att övervinna denna effekt är tre, och 3- och 4-vägs projektionssystem har beskrivits i litteraturen 11,30.
Under optimala betingelser, för en 3-vägs stråldelare bör fasskillnaderna mellan de 3 kameror vara omkring 120 °. 3-vägs stråldelare för iPALM innehåller 3 reflekterande gränssnitt, som i diagramform i figur 1A. Stråldelaren är placerad ovanför en plan dielektrisk spegel, med en tunn spalt fylld med brytningsindex matchande olja, för att möjliggöra finjustering av banlängder inom stråldelaren och att uppnå optimala fasskillnader. Såsom visas i figur 1C-D, vid korrekt inriktning för iPALM, kamerorna är nära en 120 ° inbördes fasskillnad. I praktiken är en fasskillnad som är större än 105 ° i allmänhet godtagbara. Sådan kalibrering både indicates att systemet är väl i linje och att den kommer att användas för efterföljande z-koordinat extraktion. Det är också bra att utvärdera kalibreringskurva som genererats med olika referenser. De flesta referenser med måttlig ljusstyrka avger i allmänhet som en enda dipol, vilket ger väluppfostrade kalibreringskurvor. Emellertid kan enstaka aggregat av referenserna (ofta de med extrem ljusstyrka) bete sig på ett avvikande sätt, vilket ger opålitliga kalibreringskurvor. Det är också lämpligt att välja referenser nära centrum av bildfältet och nära området biologiskt intresse (Figur 1B), särskilt eftersom den höga NA mål objektiv som används i iPALM installationen är inte platt-fält korrigeras. Den effektiva field-of-view är begränsad till det centrala området, framgår av de större referenspunkternas bredder mot kanten av fältet.
Efter den initiala inriktningen, fälten-of-view som innehåller celler med önskvärd morphology och flera referenser för att säkerställa god kalibrering väljs för avbildning. Detta kan uppnås genom att långsamt översätta provhållaren med användning av två-axelservomotor enheter. Translation av provet kommer att resultera i en viss oskärpa, eftersom det prov som inte alltid är helt plana. Därför måste fokus kontinuerligt justeras under översättningen. När bildfältet har valts till en annan runda av kalibrering optimera kalibreringskurvan genomförs sedan för att finjustera systemet anpassning och för att erhålla den faktiska kalibreringskurvan. Viktigt bör områden under kärnan eller i närheten av områden med heterogena brytningsindex (t.ex. luftbubblor) undvikas i allmänhet, eftersom dessa kommer att orsaka betydande förändring av den relativa banlängder, förvränga z-koordinat.
Med hög densitet märkning, kan fluorescenssignaler från organiska fluoroforer såsom Alexa Fluor 647 vara extremt ljusstark. Såsom visas iI figur 2A, med rätt buffert preparat innehållande en hög koncentration av tiol (-SH) grupper 31, fluoroforen bör snabbt avstängd under högt exciteringsbelysning. Detta resulterar i dämpningen av de fluorescenssignaler från de flesta av molekylerna. Vid en given instans, en mycket liten minoritet av fluoroforer stokastiskt återgå till "på" tillstånd. Dessa väntas bli glest fördelade och därmed kan visualiseras som enskilda molekyler för en eller ett fåtal bildrutor innan växling "off." De photoswitching dynamik är starkt beroende av exciteringsintensitet och koncentrationen av -SH, och därmed för ett givet system, omsorg måste vidtas för att optimera korrekt märkning densitet, i synnerhet eftersom en relativt hög excitation intensitet (640-647 nm) behövs för att stänga en majoritet av Alexa Fluor 647 molekyler. Om excitation är inte tillräckligt stark, en betydande del av Alex Fluor 647 kommerkvar i "on" tillstånd, vilket resulterar i hög bakgrund, svårigheter att observera enda molekyl fluorescens, och slutligen, dålig kvalitet enda molekyl lokaliseringsresultat. Under ett balanserat tillstånd, bör enda molekyl rådata innehåller ett tillräckligt stort antal molekyler (hundratals) per ram (figur 2B), medan varje molekyl är tillräckligt gles för att möjliggöra entydig detektering och lokalisering analys. Det är också värt att notera att för iPALM principerna om photoswitching är identiska med dem i PALM eller STORM, och därmed kan proverna ordentligt förberedda för iPALM användas direkt på enklare 3D-PALM eller 3D-STORM system. Att förvärva en tillräckligt hög täthet av molekyler för att tillfredsställa Nyquist provtagning, vanligtvis 50.000 eller flera ramar av rådata krävs (dvs 150.000 totala ramar för 3 kameror). Som förvärvet fortskrider, kan en ökande andel av fluoroforer vara uttömda genom destruktiv fotoblekning, vilket resulterar i sparser enda molekyl densitet. För att kompensera för detta, kan korta pulser av 405 nm blått ljus (405 nm) belysas på provet vid intervaller för att främja fluoroforen aktivering.
På grund av den långa förvärvs tid som krävs optimala resultat iPALM (eller enda molekyl lokalisering mikroskopi i allmänhet) kräver låg prov drift och / eller god drift korrigering. Till exempel med hjälp av exponeringstid på 50 msek i ram överföringsläge (20 Hz bildfrekvens), den totala förvärvstiden för 50.000 ramar är 42 min. Under denna period är mekanisk drift över tiotals nm förväntas. Faktum är att i tillägg till den höga lokalisering precision och hög märkning densitet, upplösningen är också beroende av driftkorrigering kvalitet. Det finns flera ursprung till dessa drivor med termisk fluktuation är en viktig orsak. På grund av detta övervägande, om möjligt, iPALM delar special bearbetas med Invar, en låg värmeutvidgning legering eller rostfritt stål,vilka båda har mycket lägre expansionsegenskaper termiska än mässing eller aluminium. Tyvärr har detta medför också en extra kostnad i förhållande till aluminium, vilket är en mer vanligt förekommande metall för optomechanical komponenter, är mycket billigare och lättare att bearbeta. Andra källor till drift kan vara mekaniska vibrationer från kringutrustning, omgivande miljö, eller luftströmmar. Dessa bör minimeras genom att placera systemet i ett lämpligt hölje och genom att omdirigera luftflödesriktningen i mikroskopet området. Installations bör byggas på en optisk bord forskningskvalitet och, om möjligt, fläkt innehåller komponenter ska placeras utanför den optiska bordet. Icke desto mindre, trots alla försiktighetsåtgärder, kommer en viss mängd av avdrift kvar. Kritiskt måste dessa drivor minimeras så att bilden förblir i fokus under insamlingstiden. I våra system, dessa passiva metoder räcker för att minimera avdrift till acceptabla nivåer. Emellertid bör det vara möjligt att genomföra aktiv avdrift comersättning metoder för att aktivera en långsiktig och hög precision avbildning 32.
Efter behandlingen av rådata, kan 3D-lokaliserings koordinater erhållas med typiskt 5-10.000.000 enda molekyl toppar per dataset. Såsom visas i fig 3, kan avdriften som en funktion av tiden visualiseras från lokaliserings koordinaterna för referenserna. Flera referenser kan användas för att beräkna den genomsnittliga driftkorrigering bana (Figur 3A-B). Dessutom är det brukligt att filtrera bort toppar som passar dåligt till 2D-gaussisk funktion under lokaliseringsanalys. Detta kan bero på felaktiga ljud eller delvis överlappande enda molekyl toppar och kan differentieras med stora kvarvarande kvadratfelet beräknas under anpassningsprocessen. Toppar med låg ljusstyrka (såsom anges av fotonräkning) och sålunda större osäkerhet (dvs., större än ~ 25 nm) är också filtreras bort, enär dessa sannolikt härrör från icke-specifik bakgrundsfluorescens. På samma sätt är toppar för vilka intensiteter från 3 kamerakanaler passar dåligt på kalibreringskurvan också avvisas, eftersom z-koordinater som erhålls är opålitliga. Det bör noteras att hela innehållet i iPALM (och lokalisering mikroskopi i allmänhet) informationen är massiv, eftersom analysresultaten inte bara i fluoroforen koordinater, utan också i ett flertal ytterligare parametrar, såsom intensitet, bredd, ljusstyrka, etc. Men i praktiken, eftersom relativt få beräkningsverktyg finns för närvarande tillgängliga för analys i koordinatmodell, är lokaliseringskoordinater typiskt återges eller rekonstruerade i pixelbaserade bilder för vidare analys.
Den vanligen använda metoden för iPALM bildrekonstruktion är att representera varje lokalisering samordna med en normaliserad 2D Gauss funktion, med lokaliserings osäkerhet satt som Gaussian bredd 33. Således, med hög precision koordinater (typiskt enda molekyl toppar med hög ljusstyrka mot låg bakgrund) visas som skarpa och smala toppar, medan de låg precision koordinater (typiskt låg ljusstyrka eller höga bakgrunds enda molekyl toppar) visas som dimmer och bredare toppar. På detta sätt bidrar varje molekyl samma mängd intensitet i bilden. För en 3D-datamängd, kan z-koordinat vara representerade med hjälp av färg, typiskt baserad på en nyans skala (Figur 4C-D). Alternativt kan bilderna visas som en sidovy (x, z eller y, z) projektion eller volymer. Ett antal allmänt tillgänglig programvara kan användas för att visualisera sådana uppgifter 34.
Såsom visas i figurerna 4-6, iPALM bilder ge en betydande förbättring jämfört med diffraktionsbegränsad fluorescensmikroskopi. F-aktin arkitektur i HUVEC-celler kan visualiseras med mycket förbättrad rumslig resolution. I de områden i cortex, kan nätverk av distinkta trådar ses, medan i spännings fibrer, buntar och lamellipodia är de tätt packade f-aktin nätverk observerades ha en filamentös textur, även om enskilda filament är inte urskiljbara. Detta beror sannolikt på grund av de begränsningar i både ljusstyrkan på fluoroforer och lokalisering precision. Förekomsten av olika kortikala trådar tyder på att ultra av f-aktin nätverket är tillräckligt väl bevarade; alltså, iPALM kan vara ett användbart verktyg för att karakterisera kortikala arkitektur. I figur 5, är en underregion av en HUVEC-cell visas med profilerna för en aktin filament kvantifieras. Det kan ses att z-histogram för ett filament är omkring 15 nm i bredd, relativt små jämfört med ~ 45 nm för den tvärgående (x, y), som visar att iPALM ger en signifikant upplösning förbättring i z-upplösning i förhållande till x-, y-planet, som förväntat. Eftersom emellertid actual diameter av f-aktin är ~ 8 nm, är det oklart om den observerade filament är en enkelfilament eller ett knippe av några få filament. Korrelat avbildning med iPALM och EM skulle kunna vara en användbar strategi för ytterligare karakterisering av f-aktin arkitekturen, även om detta tillvägagångssätt inte har tillämpats för att studera f-aktin ännu 23.
Figur 1: Schematisk beskrivning av iPALM 3-D Super Resolution Microscopy. En) Schema för iPALM optik. De dubbla objektiv (Nikon, NA 1,49 60X) låta varje emitterad fluorescens fotonen att propagera genom både övre och undre optiska strålgångar, och de omdirigeras att ingripa i stråldelaren av ett par speglar orienterade vid 22,5 °. Fasen för själv stört fotonen är direkt proportionell mot Az, vilket således kodar för z-koordinaten för fluoroforen, och kan mätas ossing en 3-vägs stråldelare med inbördes fasskillnader av ~ 120 ° mellan de tre utgående strålarna. De är inriktade av röret linser (L1-L3, f = 400 nm) och filtreras genom utsläpp filter (F1 - F3). Varje enda molekyl förefaller därför med olika intensitet mellan kameror (EMCCD1-3) men på liknande x, y-koordinater. (A) återges och ändras från Ref. 11. (B) diffraktionsbegränsad bild av HUVEC-celler märkta för f-aktin med Alexa Fluor 647. Ljusa fläckar beteckna Au nanopartiklar referenserna. Fasvinklarna för kameror # 1-3 representeras av röda, gröna och blå linjer, respektive, centrerad på varje förankrings, med fasskillnaden mellan kamerorna # 1 - 3 anges. Skala bar. 5 m (C) referensbilder visar interferometriska effekter. Bilder av en Au nanopartiklar förankrings för varje kamera (CCD1-3) eller total (summa), tas som z-positionen (i nm, på nedersta raden) genomsöks efter kalibrering. Intensiteten inom each kamera kan ses att oscillera med en fasförhållande, som visas i (B). (D) iPALM kalibreringskurva. Provet translateras längs z-axeln. Intensiteterna hos en Au nanopartiklar förankrings för EMCCD1-3 är showen som röda, gröna och blå linjer, respektive (överst). Dessa är sedan normaliseras och passformen för att bestämma fasskillnader (nederst). Under inriktning är systemet justeras för att uppnå den maximala fasskillnader mellan alla tre kameror. Kalibreringskurvan vid varje avbildnings webbplats för att använda i utvinning av z-koordinaten för varje enskild molekyl. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: enda molekyl avbildning av Photoswitching AlEXA Fluor 647-falloidin som Actin etiketter. (A) Initial photoswitching steg. F-aktin i fixerade celler är märkt vid en hög densitet genom falloidin konjugerad till Alexa Fluor 647. Hög intensitet belysning i en tiol-innehållande bildbuffertresulterar i snabb frånkoppling av de flesta fluoroforer. (B) Representativa ramar av rå enda molekyl ramar. Vid steady-state blinkande, bör den aktiverade Alexa Fluor 647 vara tillräckligt gles att enskilda enskilda molekyler visas som en PSF-sized plats. Bilder av samma celler visas i (A), som visas med omvänd kontrast. Skala barer i A och B:. 5 pm klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Korrigering med hjälp av Multip. le referenserna Lokalisering koordinater för fyra referenser (A, x-koordinat, B, y-koordinat) användes för att beräkna drift med hjälp av polynom beslag (5: e ordning, lämpliga parametrar på övre högra hörnet). Den genomsnittliga drift bana tillåter korrigering av drift med sub-5 nm precision (x: 3,085 nm, y: 3,606 nm). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Visualisering av 3-D f-aktin Arkitektur efter iPALM. (A) diffraktionsbegränsade bilden av HUVEC-celler med f-aktin märkta av Alexa Fluor 647-falloidin (motsvarande delområden av cellen i fig 2). Ljuspunkten beror på Au nanopartiklar referenserna.
Figur 5: Nanoscale dimension f-aktin visualiserades genom iPALM. (A) Rekonstruerade iPALM bild HUVEC-celler med f-aktin märkt B y Alexa Fluor 647-falloidin. Färgen indikerar z-koordinaten enligt färgfältet. Skalstreck:. 1 | j, m (B) Tvärgående tvärsnitt histogram av x, koordinater y-lokalisering längs den långa axeln av inramade området i (A). För att erhålla den histogram, är koordinaterna projiceras på den långa axeln av lådan och arkiveras med en 5-nm bin-storlek. Den grå kurvan indikerar en Gaussisk bäst passar till histogrammet, med en full bredd vid halva maximum (FWHM) av 43,88 nm. (C) Histogram av z-positionen för lokaliseringskoordinater i det inramade området i (A). Z-positioner är binned med en bin storlek på 1 nm. Den grå kurvan visar en Gauss bäst passar till histogrammet, med en FWHM av 17,50 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
/files/ftp_upload/54774/54774fig6.jpg "/>
Figur 6:. Jämförelse av iPALM avbildning av f-aktin Använda olika märkningsreagens Rekonstruerade iPALM bilder av F-aktin märkt med hjälp av Alexa Fluor 647-konjugerad falloidin (A), Alexa Fluor 568-konjugerad falloidin (B), eller genom transfektion med aktin -mEos2 fusionsproteinet expressionsvektor (C). Skala barer (AC):. 1 pm klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det optiska systemet i iPALM är baserad på en 4-π dubbla motsats objektiv konstruktion, såsom visas i figur 1A. Installationen är konstruerad med användning av både specialanpassade maskinbearbetade och kommersiella optomekaniska delar, såsom beskrivits tidigare 23 och räknas upp i tabell 1. Förutom vår inställning, Howard Hughes Medical Institute (HHMI) är värd ett system som är tillgängligt för det vetenskapliga samfundet vid Advanced Imaging Center vid Janelia Research Campus. För hela mekaniska ritningar, styrscheman och programvara, läsare uppmuntras att fråga med Harald Hess vid HHMI för ytterligare information. En primär fördel för att använda iPALM liksom andra enda molekyl lokalisering mikroskopi metoder för att visualisera f-aktin är den relativa lätthet för provberedning jämfört med EM-tekniker, som i allmänhet kräver hårda prov bearbetning, mödosamma förberedelser och högutbildade utövare 3,23 . AdditionallY, är fluorescens naturligtvis mottaglig för flerkanalig avbildning, som fortfarande är svårt för EM. Ändå som beskrivs närmare nedan, det finns flera aktuella begränsningar för den strategi, både när det gäller provberedning och avbildningsprocessen. Först, vilket är fallet för EM provberedning, omsorg måste vidtas för att säkerställa god ultra bevarande av proverna 35, eftersom ett protokoll tillräckliga för en diffraktionsbegränsad upplösningsnivå kan orsaka allvarliga störningar på nanonivå. För aktin avbildning, är korrekt fixering av cellerna en viktig faktor som påverkar prov kvalitet. Glutaraldehyd är en föredragen fixerings eftersom det bevarar cytoskelettet och membran mycket bra, men i fall av samtidig färgning med antikropp kan epitopställen påverkas. I sådana fall kan paraformaldehyd erbjuda en acceptabel kompromiss, eftersom det tenderar att bättre bevara antikropps epitopställen. Viktigt för enda molekyl lokalisering mikroskopi dessa fixerings tenderaratt generera bakgrunds autofluorescens; sålunda är efter fixering släckning av borhydrid nödvändigt, särskilt i fallet med glutaraldehyd.
Dessutom, korrekt val av fluoroforer och märknings strategier är bland de viktigaste faktorerna för framgångsrika experiment. På grund av nano dimension av f-aktin, är höga tätheter av etiketter som krävs för att fånga de underliggande trådnäten, i enlighet med Nyquist samplingsteoremet 36. För aktin, tillåter phalloidin mycket hög densitet märkning, med ett brett område av organiska fluoroforer är tillgängliga från många tillverkare. Eftersom falloidin är giftig, krävs cellfixering och permeabilization. Alternativa strategier för live-cell kompatibel aktin märkning inkluderar användning av fusion av fluorescerande proteiner (FP), antingen med monomert aktin eller med små aktinbindande polypeptider. Vi fann emellertid att dessa tenderar att ge en lägre märkning densitet jämfört med falloidin (
39. Detta gäller även de fördelar och begränsningar iPALM. Jämfört med andra tre-dimensionella super resolution mikroskopitekniker, har iPALM förblivit den högsta-lösa optiska tillvägagångssätt hittills, i synnerhet längs z-axeln, med z-upplösning nästan 2 gånger bättre än x, y-upplösning 11. Men beroendet av iPALM på interferometri för en hög z-upplösning innebär också en begränsning på bilddjup, eftersom kalibreringskurvan är periodisk. Med andra ord, z-koordinater upprepa varje 250 nm eller så (för ~ 700 nm emissionsvåglängder på Alexa Fluor 647). I praktiken kan detta lösas genom användning av TIRF belysning, vilket begränsar excitation zonen till inom det evanescenta fältet djup av <200 nm från coverglass. Således, fluoroforer djupare in provet inte är glada och förblir osynliga. Men detta begränsar också de biologiska strukturer som kan avbildas dem i närheten av coverglass, såsom fokala sammanväxningar, kortikal cytoskelettet och ventrala plasmamembranet, medan mer inre strukturer är utom räckhåll. För fasta prov, är ett botemedel för att utföra cryosectioning 40. Men en sådan strategi mycket arbetskrävande och kräver specialistkompetens som inte är allmänt tillgänglig.
Alternativt kan iPALM anpassas under en längre z-intervall genom att kombinera interferometri med astigmatiska-oskärpa schema 12 som används i 3D-STORM. Denna metod ger dubbla z-koordinat avläsning, den första av interferometri, som är hög precision, men återkommande, och det andra genom astigmatisk oskärpa, som är mindre exakt men icke-periodisk. Den senare kan sedan användas för att "packa upp" eller bryta degenereringen avde interferometriska z-koordinater, vilket möjliggör en tredubbling av den iPALM bilddjupet till ~ 750 nm, på ett effektivt sätt närmar sig inneboende skärpedjup på höga NA objektiv. Med fas uppackning, har iPALM använts för att avbilda strukturer djupt inne i proverna, såsom mitokondrier, om än med något reducerad precision i alla 3 dimensioner på grund av den extra oskärpa 40.
En annan inneboende begränsning av iPALM är avbildningshastigheten. Eftersom ett stort antal ramar krävs för att få en hög täthet av lokaliseringskoordinater är kameran hastighet vanligtvis gränsen på förvärvstakten. Med dagens EMCCD kameror körs vid 10 - 20 MHz avläsningshastigheter, är tiotals minuter som krävs för ett tillräckligt antal ramar. Sådana långa tidsskalor kräver att provet fastställas. Här, de senaste framstegen inom kamerateknologi, såsom mycket snabbare vetenskapliga Complementary Metal Oxide Semiconductor (sCMOS) kamera, kan möjliggöra en snabb ökning av imåldrande hastighet 41, även om detta inte har genomförts för iPALM ännu. För vissa enda molekyl lokalisering mikroskopi tillvägagångssätt, kan en tät enda molekyl fält analyseras med hjälp av en modifierad algoritm 42 eller komprimerad avkänning 43. Anpassningen av sådana strategier kan också påskynda iPALM genom att tillåta tätare enda molekyl bilder och därmed färre ramar.
Med begränsningar i hastighet och bildbehandling räckvidd och styrka i rumslig upplösning, är en viktig ansökan om iPALM som en ultra metod som utnyttjar fördelarna med fluorescerande märkning för att avslöja nano organisation av specifika proteiner 14,15,44. Ytterligare förbättringar, både när det gäller optik och fluorofor teknik bör möjliggöra ytterligare förbättring i iPALM rumslig upplösning. Till exempel, sysselsätter iPALM bildbehandling för närvarande ett relativt enkelt första ordningens approximation tillvägagångssätt, med varje enda molekyl modelleras av en 2D-gaussisk funktion och somantas vara en isotopiskt medelvärdes dipol. Detta skulle kunna kompletteras med nya metoder, som använder en mer exakt modell av punktspridningsfunktion och dipol orientering, eller explicit behandling av optiska aberrationer över synfältet att avsevärt förbättra rumslig upplösning. På samma sätt har photocaging rapporterats, vilket förbättrar fluoroforen ljusstyrka genom tiopotenser 45. I själva verket, eftersom viktiga delar av deras ultra organisation har väldefinierad, kan f-aktin cytoskelettet vara en mycket värdefull modellsystem för att testa ytterligare metodutveckling i iPALM. Förmågan att analysera protein organisation genom ljusmikroskop med sann EM-nivå upplösningsförmåga väntas avsevärt förbättra vår förståelse av otaliga aspekter av cellstruktur och funktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
YW och PK tack erkänna finansieringsstöd från Singapore National Research Foundation, tilldelas PK (NRF-NRFF-2011-04 och NRF2012NRF-CRP001-084). Vi tackar också MBI Open Lab och mikroskopi kärnanläggningar för infrastrukturstöd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| optical table | Newport, CA | RS4000 | iPALM, installed on 4 Newport Stabilizer vibration isolators |
| vibration isolator for optical table | Newport, CA | S-2000 | |
| laser-642 | Newport, CA | 1185055 | output power=100 mw |
| laser-561 | Newport, CA | 1168931 | output power=200 mw |
| laser-488 | Newport, CA | 1137970 | output power=200 mw |
| laser-405 | Newport, CA | 1142279 | output power=100 mw |
| broadband dielectric mirrors | Thorlabs, NJ | BB1-E02 | laser combiner |
| dichroic beamsplitter | Semrock, NY | LM01-427-25 | |
| acousto-optic tunable filter | AA Opto-Electronic, France | AOTFnC-VIS-TN | |
| Linear polarizer | Newport, CA | 05LP-VIS-B | |
| baseplate | local workshop | customized | |
| turning mirror (22.5°) | Reynard Corpporation, CA | customized | 22.5° mirror |
| motorized optic mounts | New Focus, CA | 8816 | |
| motorized XYZ translation stage | Thorlabs, NJ | MT3/M-Z6 | sample holder |
| T-Cube DC servo motor controller | Thorlabs, NJ | TDC001 | |
| Piezo Phase Shifter | Physik Instrumente, Germany | S-303.CD | |
| objective lens | Nikon, Japan | MRD01691 | objective. Apo TIRF 60X/1.49 oil |
| translation stage | New Focus, CA | 9062-COM-M | |
| Pico Motor Actuator | New Focus, CA | 8301 | |
| rotary Solenoid/Shutter | DACO Instruments, CT | 5423-458 | |
| 3-way beam splitter | Rocky Mountain Instruments, CO | customized | beamsplitter |
| Piezo Z/Tip/Tilt scanner | Physik Instrumente, Germany | S-316.10 | |
| motorized five-axis tilt aligner | New Focus, CA | 8081 | |
| Picmotor ethernet controller | New Focus, CA | 8752 | |
| Piezo controllers/amplifier/digital operation module | Physik Instrumente, Germany | E-509/E-503/E-517 | |
| band-pass filter | Semrock, NY | FF01-523/20 | filters |
| band-pass filter | Semrock, NY | FF01-588/21 | |
| band-pass filter | Semrock, NY | FF01-607/30 | |
| band-pass filter | Semrock, NY | FF01-676/37 | |
| notch filter | Semrock, NY | NF01-405/488/561/635 | |
| motorized filter wheel with controllter | Thorlabs, NJ | FW103H | |
| EMCCD | Andor, UK | DU-897U-CSO-#BV | 3 sets |
| Desktop computers for controlling cameras and synchronization | Dell | Precision T3500 | PC, 4 sets |
| coverslips with fiducial | Hestzig, VA | 600-100AuF | sample preparation. fiducial marks with various density and spectra available |
| fibronectin | Millipore, MT | FC010 | |
| paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences, PA | 15710 | fixation. 16% |
| glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences, PA | 16220 | 25% |
| triton X-100 | Sigma aldrich, MO | T8787 | |
| HUVEC cells | Life Technologies, CA | C-015-10C | |
| Medium 200 | Life Technologies, CA | M-200-500 | |
| Large Vessel Endothelial Factors | Life Technologies, CA | A14608-01 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | 14190367 | ||
| Pennicillin/Streptomycin | 15140122 | ||
| Trypsin/EDTA | Life Technologies, CA | 25200056 | |
| PIPES | Sigma aldrich, MO | P1851 | PHEM |
| HEPES | 1st base, Malaysia | BIO-1825 | |
| EGTA | Sigma aldrich, MO | E3889 | |
| MgCl2 | Millipore, MT | 5985 | |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Invitrogen, CA | A22287 | staining |
| sodium borohydride (NaBH4) | Sigma aldrich, MO | 480886 | quenching |
| glucose | 1st base, Malaysia | BIO-1101 | imaging buffer |
| glucose oxidase | Sigma aldrich, MO | G2133 | |
| catalase | Sigma aldrich, MO | C9322 | |
| cysteamine | Sigma aldrich, MO | 30070 | |
| Epoxy | Thorlabs, NJ | G14250 | |
| vaseline | Sigma aldrich, MO | 16415 | sample sealing |
| lanolin | Sigma aldrich, MO | L7387 | |
| parafin wax | Sigma aldrich, MO | 327204 | |
| Immersion oil | Electron Microscopy Sciences, PA | 16915-04 | imaging. Cargille Type HF |
References
- Kanchanawong, P., Waterman, C. M. Localization-based super-resolution imaging of cellular structures. Methods Mol Biol. 1046, 59-84 (2013).
- Bertocchi, C., Goh, W. I., Zhang, Z., Kanchanawong, P. Nanoscale imaging by super resolution fluorescence microscopy and its emerging applications in biomedical research. Crit Rev Biomed Eng. 41, 281-308 (2013).
- Kanchanawong, P., Waterman, C. M. Advances in light-based imaging of three-dimensional cellular ultrastructure. Curr Opin Cell Biol. 24, 125-133 (2012).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys J. 91, 4258-4272 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3, 793-795 (2006).
- Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angew Chem Int Edit. 47, 6172-6176 (2008).
- Sharonov, A., Hochstrasser, R. M. Wide-field subdiffraction imaging by accumulated binding of diffusing probes. P Natl Acad Sci USA. 103, 18911-18916 (2006).
- Fölling, J., Bossi, M., Bock, H., Medda, R., Wurm, C. A., Hein, B., Jakobs, S., Eggeling, C., Hell, S. W. Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return. Nat Methods. 5, 943-945 (2008).
- Biteen, J., et al. Single-moldecule active-control microscopy (SMACM) with photo-reactivable EYFP for imaging biophysical processes in live cells. Nat Methods. 5, 947-949 (2008).
- Shtengel, G., et al. Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure. P Natl Acad Sci USA. 106, 3125-3130 (2009).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).
- Dani, A., Huang, B., Bergan, J., Dulac, C., Zhuang, X. Super resolution imaging of chemical synapses in the brain. Neuron. 68, 843-856 (2010).
- Liu, J., et al. Talin determines the nanoscale architecture of focal adhesions. P Natl Acad Sci USA. 112 (35), E4864-E4873 (2015).
- Kanchanawong, P., et al. Nanoscale architecture of integrin-based cell adhesions. Nature. 468, 580-584 (2010).
- Wu, Y., Kanchanawong, P., Zaidel-Bar, R. Actin-delimited adhesion-independent clustering of e-cadherin forms the nanoscale building blocks of adherens junctions. Dev Cell. 32 (2), 139-154 (2015).
- Szymborska, A., et al. Nuclear Pore Scaffold Structure Analyzed by Super-Resolution Microscopy and Particle Averaging. Science. 341, 655-658 (2013).
- Lawo, S., Hasegan, M., Gupta, G. D., Pelletier, L. Subdiffraction imaging of centrosomes reveals higher-order organizational features of pericentriolar material. Nat Cell Biol. 14, 1148-1158 (2012).
- Mennella, V., Agard, D. A., Huang, B., Pelletier, L. Amorphous no more: subdiffraction view of the pericentriolar material architecture. Trends Cell Biol. 24, 188-197 (2014).
- Mennella, V., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence microscopy reveals a domain of the centrosome critical for pericentriolar material organization. Nat Cell Biology. 14, 1159-1168 (2012).
- Fletcher, D. A., Mullins, R. D. Cell mechanics and the cytoskeleton. Nature. 463, 485-492 (2010).
- Salbreux, G., Charras, G., Paluch, E. Actin cortex mechanics and cellular morphogenesis. Trends Cell Biol. 22, 536-545 (2012).
- Shtengel, G., et al. Imaging cellular ultrastructure by PALM, iPALM, and correlative iPALM-EM. Method Cell Biol. 123, 273-294 (2014).
- Juette, M. F., et al. Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples. Nat Methods. 5, 527-529 (2008).
- Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Photoactivatable fluorescent proteins for diffraction-limited and super-resolution imaging. Trends Cell Biol. 19, 555-565 (2009).
- Shannon, C. Communication in the presence of noise. Proc. IRE. 37, 10-21 (1949).
- Good, N. E., et al. Hydrogen ion buffers for biological research. Biochemistry. 5, 467-477 (1966).
- Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophys J. 94, 1826-1835 (2008).
- Shin, W. D., et al. Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. Goldman, R. D., Swedlow, J. R., Spector, D. L. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2010).
- Aquino, D., et al. Two-color nanoscopy of three-dimensional volumes by 4Pi detection of stochastically switched fluorophores. Nat Methods. 8, 353-359 (2011).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8, 1027-1036 (2011).
- Pertsinidis, A., Zhang, Y., Chu, S. Subnanometre single-molecule localization, registration and distance measurements. Nature. 466, 647-651 (2010).
- Baddeley, D., Cannell, M. B., Soeller, C. Visualization of Localization Microscopy Data. Microsc Microanal. 16, 64-72 (2010).
- El Beheiry, M., Dahan, M. ViSP: representing single-particle localizations in three dimensions. Nat Methods. 10, 689-690 (2013).
- Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nat Methods. 9, 152-158 (2012).
- Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics. Nat Methods. 5, 417-423 (2008).
- Yamashiro, S., et al. New single-molecule speckle microscopy reveals modification of the retrograde actin flow by focal adhesions at nanometer scales. Mol Biol Cell. 25, 1010-1024 (2014).
- Shroff, H., et al. Dual-color super resolution imaging of genetically expressed probes within individual adhesion complexes. P Natl Acad Sci USA. 104, 20308-20313 (2007).
- Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346, (2014).
- Brown, T. A., et al. Super resolution fluorescence imaging of mitochondrial nucleoids reveals their spatial range, limits, and membrane interaction. Mol Cell Biol. 31, 4994-5010 (2011).
- Huang, F., et al. Video-rate nanoscopy using sCMOS camera-specific single-molecule localization algorithms. Nat Methods. 10, 653-658 (2013).
- Daostorm, S. DAOSTORM: an algorithm for high-density super-resolution microscopy. Nat methods. 8, 279 (2011).
- Zhu, L., Zhang, W., Elnatan, D., Huang, B. Faster STORM using compressed sensing. Nat Methods. 9, 721-723 (2012).
- Van Engelenburg, S. B., et al. Distribution of ESCRT machinery at HIV assembly sites reveals virus scaffolding of ESCRT subunits. Science. 343, 653-656 (2014).
- Vaughan, J. C., Jia, S., Zhuang, X. Ultrabright photoactivatable fluorophores created by reductive caging. Nat Methods. 9, 1181-1184 (2012).
