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Immunology and Infection

Flusso analisi di citometria di Natural Killer cellulare Lytic attività nel Sangue umano intero

Published: March 17, 2017 doi: 10.3791/54779
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 1
1Center for Excellence in Post-Harvest Technologies, North Carolina A&T State University, North Carolina Research Campus, 2Human Performance Laboratory, Appalachian State University, North Carolina Research Campus

Abstract

citotossicità delle cellule NK è una misura ampiamente utilizzato per determinare l'effetto di un intervento esterno sulla funzione delle cellule NK. Tuttavia, la precisione e la riproducibilità di questo test possono essere considerati instabili, sia a causa di errori dell'utente oa causa della sensibilità delle cellule NK di manipolazione sperimentale. Per eliminare questi problemi, un flusso di lavoro che li riduce al minimo è stato stabilito ed è presentato qui. Per illustrare, abbiamo ottenuto campioni di sangue, in vari momenti, da corridori (n = 4), che sono stati sottoposti ad un intenso periodo di esercizio. In primo luogo, le cellule NK sono contemporaneamente identificati e isolati attraverso CD56 tagging e smistamento magnetico-based, direttamente dal sangue intero e da un minimo di un millilitro. Le cellule NK ordinati vengono rimossi di eventuali anticorpi reagenti o tappatura. Essi possono essere contati per stabilire un accurato conteggio delle cellule NK per millilitro di sangue. In secondo luogo, le cellule NK ordinati (effettori cellule o E) possono essere miscelati con 3,3'-Diotadecyloxacarbocyanine perclorato (DIO) etichettato cellule K562 (cellule bersaglio o T) in un saggio-ottimale 1: 5 T: rapporto E e analizzato utilizzando un flusso-citometria di imaging che permette la visualizzazione di ogni evento e l'eliminazione di falsi positivi o falsi negativi (come doppiette o cellule effettrici). Questo flusso di lavoro può essere completato in circa 4 ore, e consente di ottenere risultati molto stabili anche quando si lavora con campioni umani. Quando disponibile, gruppi di ricerca possono testare diversi interventi sperimentali in soggetti umani, e confrontare le misurazioni attraverso diversi punti di tempo senza compromettere l'integrità dei dati.

Introduction

cellule killer naturali sono un elemento essenziale del sistema immunitario innato. Mentre sono molto disciplinati, hanno la capacità di riconoscere ed eliminare le cellule anomale attraverso il contatto cellula-cellula e senza attivazione preventiva 1. Come tali, essi formano una linea veloce di difesa contro le infezioni. Esercizio, particolarmente intenso, ha dimostrato di deprimere transitoriamente il sistema immunitario 2, 3, 4, 5. Cellule NK sono particolarmente soggetti a questo effetto 4, 6, 7, creando una finestra di una maggiore sensibilità alla malattia. Pertanto, lo studio di interventi prima, durante o dopo un intenso esercizio con l'obiettivo di ridurre l'impatto sulla funzione delle cellule NK è di particolare interesse per il benessere degli atleti post-concorsi.

8, a circa l'1% del vano globuli bianchi; 2) le cellule NK sono molto sensibili allo stress e si basano su costante esposizione a condizioni fisiologiche di rimanere vitali e stabile durante la sperimentazione; e 3) test standard per determinare la citotossicità delle cellule NK, come Ficoll gradienti 9 e rilasciare dosaggi 10, sono inaffidabili e inconsistenti. La variabilità intrinseca dei campioni umani composti soltanto questi problemi. campioni umani freschi raccolti durante interventi sono abbastanza regolamentato e difficili da procurare, almeno rispetto ai campioni animali o linee cellulari immortalizzate. Questo riduce la possibilità di ripetere gli esperimenti o aggiungere partecipanti allo studio di coorte per raggiungere significativi soglie statistiche. Collettivamente, questi problemi sostengono la necessità di un protocollo semplificato che permette FOR sia high-throughput e l'analisi ad alta affidabilità di NK attività litica delle cellule in campioni umani.

Abbiamo stabilito un flusso di lavoro che riduce il tempo necessario per identificare, isolare e le cellule NK di prova da sangue intero umano, riducendo al minimo l'esposizione a fattori estranei. Il metodo ottimizza l'uso di due strumenti, un sorter magnetico a base cellulare e un flusso di imaging citometro, ed una, T ottimizzata specifico per il dosaggio: rapporto E per consentire il rilevamento di diminuzioni o incrementi di citotossicità delle cellule NK.

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Protocol

NOTA: Tutte le procedure di raccolta del sangue sono state condotte in conformità con le linee guida stabilite dalla Appalachian State University (ASU) Institutional Review Board (IRB).

1. Raccolta Sangue intero

  1. Avere un flebotomo certificato prelevare il sangue secondo le linee guida dell'Organizzazione Mondiale della Sanità.
  2. Disegnare il sangue in un 4 ml di tubo di raccolta del sangue contenente acido Di-Potassio etilendiamminotetraacetico (K 2 EDTA). Capovolgere tubo di raccolta sangue secondo le istruzioni del produttore. Mantenere tubo di raccolta di sangue a temperatura ambiente su un agitatore meccanico banco fino separazione.

2. Preparazione delle cellule bersaglio Dio-etichettati

  1. Crescere K562 cellule in completa di Iscove Modified Dulbecco media (IMDM) supplementato con siero fetale bovino al 10% (FBS) e 1% di penicillina streptomicina per diverse settimane prima del test per garantire la salute delle cellule. Regolare il concentratione delle cellule per 3 x 10 5 cellule / ml al giorno attraverso il completamento di una cella di conteggio e successivo passaggio delle cellule. Eseguire un completo cambiamento dei media ogni 2 o 3 giorni.
  2. Il giorno del test, eseguire una conta cellulare utilizzando un 1: 1 emocitometro.
    1. Rimuovere 10 microlitri dal pallone K562 e posto in 1,5 ml di tubo.
    2. Aggiungere 10 ml di colorante blu trypan nella stessa provetta da 1,5 ml per un fattore di diluizione di 1: 1.
    3. Delicatamente a scatti la provetta per mescolare K562 cellule e trypan colorante blu.
    4. Lasciare K562 colorante blu cellula-trypan per incubare per 1 minuto a temperatura ambiente.
    5. Rimuovere 15 ml di cellule K562 macchiati dal tubo.
    6. Pipetta su emocitometro per la conta delle cellule.
    7. Contare le celle nelle quattro piazze d'angolo così come la piazza centrale per un totale di cinque piazze.
    8. Calcolare conta cellulare utilizzando l'equazione:
      Totale cellule / ml = cellule totali contate X (fattore di diluizione / numero di caselle) X 10.000 / mL
    Risospendere le cellule bersaglio K562 con una densità finale di 1 x 10 6 cellule / ml in terreno di coltura libera IMDM siero.
  3. Per le cellule bersaglio K562 senza macchia, aggiungere 10 ml di cellule bersaglio K562 a uno 15 ml di tubo ad una densità di 1 x 10 6 cellule / ml per un totale di 10 x 10 6 cellule K562. Mettere in un incubatore a 37 ° con 5% di CO 2 fino al momento dell'uso.
  4. Per le cellule bersaglio DiO macchiato K562, aggiungere 10 ml di K562 obiettivi cellule ad uno 15 ml di tubo ad una densità di 1 x 10 6 cellule / ml per un totale di 10 x 10 6 cellule K562.
    1. Aggiungere 1 ml di soluzione DiO cella-etichettatura per ml di sospensione cellulare in 15 ml di tubo designato per DiO colorazione e delicatamente vortice. Ad esempio, aggiungere 10 ml di soluzione di cellule-etichettatura DiO a 10 x 10 6 cellule / ml K562 ad un volume di 1 x 10 6 cellule / ml.
    2. Incubare soluzione K562-DiO per 20 min a 37 ° C con 5% di CO 2 in una provetta da 15 ml.
  5. Seguiincubazione ing, aggiungere 3 ml di soluzione fisiologica a temperatura ambiente tampone fosfato (PBS) per soluzione K562-dio contenente 15 ml di tubo.
  6. Centrifugare per 10 min a 135 xg a temperatura ambiente.
  7. Rimuovere con attenzione il surnatante senza disturbare il pellet cellulare con 1.000 ml di volume regolabile pipetta.
  8. Aggiungere 10 ml di IMDM fresco alla cella pellet contenente 15 ml di tubo.
  9. Delicatamente tubo vortex per risospendere le cellule.
  10. Ripetere i punti 2.7 a 2.10 altre due volte.
  11. Cellule Conservare in un incubatore a 37 ° con il 5% di CO 2 fino al momento dell'uso.
    NOTA: Le celle possono essere memorizzati in incubatrice fino a 24 h, ma è preferibile usarli lo stesso giorno.

3. Preparazione di controlli

  1. Trasferire il seguente in separati e opportunamente etichettati tubi da 1,5 ml:
    1. Aggiungere 500 ml di IMDM fresco contenente risospeso DIO-etichettato K562 cellule nel "Double Positive" etichettato 1,5 ml di tubo.
    2. Aggiungere 500 ml di IMDM fresco contenente risospeso cellule K562 DIO-etichettati in "Dio solo" etichettato 1,5 ml di tubo.
    3. Aggiungere 500 ml di IMDM fresco contenente cellule K562 senza etichetta risospese nella "ioduro di propidio (PI) solo" etichettati 1,5 ml di tubo.
  2. Posizionare il doppio positivo e PI solo tubi in un bagno d'acqua C 55 ° per 5 min.
  3. Dopo la 5 minuti è trascorso, rimuovere i tubi e pulire con il 70% di etanolo.
  4. Aggiungere 10 L di PI al doppio positivo e PI solo 1,5 mL.
  5. Mettere tutti i tre controlli K562 cellule bersaglio in incubatore a 37 ° C per 30 min.
  6. Dopo 30 min di incubazione è trascorso, centrifugare tutti i tre controlli di cellule bersaglio K562 per 2 min a 163 x g.
  7. Rimuovere con attenzione il surnatante senza disturbare il pellet.
  8. Risospendere ogni controllo con 20 ml di mezzi di coltura cellulare IMDM fresco, e lasciare nel 37 ° C incubatore con 5% di CO 2 per almeno30 min per il segnale DiO ottimale.
    NOTA: I controlli sono ora pronti per essere eseguito attraverso il flusso di imaging citometro.

4. NK cellulare automatizzata Separazione

  1. Accendere separatore cellulare e consentire il ciclo di start-up alla fine.
  2. Assicurarsi che tutte le bottiglie di illuminazioni fluidi sono verdi e che la bottiglia è vuota rifiuti.
  3. Ottenere un ambiente a temperatura 15 ml portaprovette.
    NOTA: La selezione è basata su volumi di campione. Ad esempio, per un volume inferiore a 3 ml utilizzano un portaprovette 15 ml e per un volume superiore a 3 mL utilizzano una mL cremagliera 50 del tubo.
  4. tubi campione Etichetta di conseguenza (Ripeti per campione / partecipante): Partecipante 1 campione di sangue intero; Partecipante 1 frazione negativa; Partecipante 1 frazione positiva.
  5. pipettare delicatamente 1,5 ml di sangue intero dal punto 1.2 in 15 tubo "intero campione di sangue" mL.
  6. Posizionare il tubo adeguatamente etichettati 15 mL "intero campione di sangue" dal punto 4.5 ed etichettati 15 mL "frazione negativa" etubi "frazione positiva" dal passo 4.4 nel rack tubo. Utilizzare thefollowing cremagliera campione di set-up: Riga (R1) A: Campione di sangue intero, Fila (R2) B: Negativo, frazione senza etichetta, Fila (R4) C: Positivo, frazione magneticamente etichettati.
  7. Inserire il rack di separazione sul MiniSampler per autolabeling.
  8. Selezionare "reagente" sul menu ed evidenziare la posizione in cui il flaconcino verrà inserito nel rack separatore.
  9. Selezionare "Leggi reagente" per attivare il lettore di codici 2D.
  10. Posizionare la fiala reattivo appropriato davanti al lettore di codici 2D tra 0,5-2,5 cm dal coperchio del lettore di codice.
    NOTA: per esempio, il reagente necessario per la separazione delle cellule NK è CD56.
  11. Tenere reagente flacone con un angolo di fronte lettore di codici 2D per una lettura ottimale.
  12. Posizionare il flacone di reagente in posizione corretta cremagliera separatore.
  13. Evidenziare le posizioni desiderate nella scheda di separazione sullo schermo.
  14. Dal sottomenu Etichettatura, assegnare un auprogramma di tolabeling.
  15. Assegnare le cellule di separazione reagente CD56 microsfere di accumulare posizioni 1, 2, 3, e 4.
  16. Selezionare il programma di separazione "posselwb".
  17. Selezionare il programma di lavaggio "risciacquo".
  18. Inserire un volume di campione di 1.500 ml nel sottomenu "Volume" utilizzando il tastierino numerico.
  19. Selezionare l'opzione "Invio" sulla tastiera.
  20. Selezionare "Run" per avviare la separazione delle cellule.
  21. Selezionare "OK" per confermare tale buffer sufficiente è disponibile per l'elaborazione di tutti i campioni.

5. NK cellulare Conte seguito cellulare Separazione

  1. Immediatamente dopo separazione cellulare con il separatore cellulare, recuperare la frazione positiva. Lasciare a temperatura ambiente. Questa frazione contiene la popolazione di cellule NK puro desiderato.
  2. Per ogni singolo campione, eseguire una conta delle cellule utilizzando un emocitometro come da Fase 2.2.
    1. Dopo i calcoli, registrare la conta delle cellule.

    6. citotossicità Assay Preparazione del campione

    1. Preparare ed etichettare provette da 1,5 ml per ogni campione / partecipante di conseguenza.
    2. Pipetta rapporto tra cellule NK e K562 DIO-etichettati desiderato in ogni provetta.
      NOTA: per esempio, il rapporto desiderato di cellule bersaglio K562 e cellule effettrici NK è 1: 5.
    3. Centrifugare per 5 min a 135 x g.
    4. Rimuovere con attenzione il surnatante senza disturbare il pellet.
    5. Risospendere NK-dio etichettato miscela di cellule K562 in 500 ml di mezzi delle cellule NK, senza l'interleuchina-2 (IL-2) e 2-mercaptoetanolo (2-ME) (incompleta NK coltura cellulare media).
      NOTA: I terreni di coltura delle cellule NK incompleta è Minimum Essential medio di Eagle con bicarbonato di sodio, senza L-glutammina, ribonucleosides e deoxyribonucleosides.
    6. Aggiungere 5 ml di PI ad ogni provetta.
    7. Centrifugare per 2 minuti a 163 x g.
    8. Incubare le cellule a 37 ° C per 2 ore.
    9. Dopo 2 ore di incubazione, centrifuge per 2 min a 163 x g.
    10. Rimuovere con attenzione il surnatante senza disturbare il pellet.
    11. Risospendere le cellule in 25 microlitri incompleta terreni di coltura delle cellule NK.

    7. Preparazione di spontanea ( "S") Esempio

    1. Pipettare 500 ml di cellule K562 DIO-etichettati (concentrazione di 1 x 10 6 cellule / ml) in 1,5 ml di tubo.
    2. Aggiungere 10 ml di PI ad ogni provetta.
    3. provetta per centrifuga per 2 min a 163 x g.
    4. Incubare le cellule a 37 ° C per 2 ore.
    5. Dopo 2 h di incubazione, centrifugare per 2 min a 163 x g.
    6. Rimuovere con attenzione il surnatante senza disturbare il pellet.
    7. Risospendere le cellule in 25 ml incompleta Essential Medium (α-MEM) terreni di coltura delle cellule alfa-minimo.

    8. Acquisizione dati con Imaging citofluorimetro

    1. Premere il tasto verde all'interno dello sportello anteriore della dell'imaging citofluorimetro per accendere lo strumento.
    2. Attivare all computer associati imaging citofluorimetro.
    3. Avviare il flusso di imaging citometro software.
    4. Fare clic sul pulsante "Avvio" per lavare il sistema e preparare la linea del campione.
    5. Una volta che il "Avvio" è completa, chiudere la finestra "Calibrations".
    6. Assegnare i canali: sul lato superiore sinistro, cliccare su ogni canale, al fine di assegnare loro.
    7. Sul lato destro, fare clic sul pulsante grafico a dispersione per creare 4 a dispersione: Raw Max Pixel _MC_6 vs Area_M06, Crudo Max Pixel _MC_2 vs Area_M02, Crudo Max Pixel _MC_5 vs Area_M05 e FieldArea_M01 vs AspectRatio_M01.
    8. Iniziare l'analisi di campioni in primo luogo usando il comando "Doppio positivo".
      1. Clicca su "Carica".
      2. Posizionare il tubo da 1,5 ml con il campione "Double Positive" da Piazza di 3,4 a 3,9 nel caricatore del campione.
      3. Selezionare l'obiettivo 40X nella scheda "ingrandimento".
      4. Accendere il 405 mW e642 laser MW.
      5. Accendere il canale "Brightfield".
      6. Clicca su "Seleziona intensità."
      7. Sulla base del campione di controllo "Double positivo", determinare l'intensità desiderata per il laser 405 mW quindi il rivelatore non è sovraccarico.
        Nota: Ad esempio, l'intensità ottimale per questo esperimento è stato fissato a 11 mW.
    9. Dopo il set-up desiderato si ottiene, acquisire i dati.
      1. Nella scheda "File di acquisizione", inserire il nome del file in un testo personalizzato. Selezionare una cartella in cui salvare il file di dati (s).
      2. Inserire il numero di cellule di acquisire accanto a "raccogliere". In genere questo numero varia tra 1.000 a 10.000.
      3. Clicca su "Acquisisci".
        NOTA: Una volta che il numero desiderato di cellule viene acquisito, il file di dati viene salvato automaticamente nella cartella precedentemente selezionata.
    10. Dopo l'acquisizione termina, caricare il campione di controllo successivo - Dio solo il controllo.
    11. Clicca su "Carica".
    12. Posizionare il tubo 1,5 ml con l ' "unico Dio" campione nel caricatore di campione.
    13. Lasciare l'obiettivo 40X nella scheda "ingrandimento" selezionato.
    14. Lasciare il laser 405 mW acceso.
    15. Spegnere il laser 642 mW e il canale "Brightfield".
      NOTA: Ora che la desiderata set-up è stato raggiunto, i dati possono essere acquisiti.
    16. Nella scheda "File di acquisizione", inserire il nome del file in un testo personalizzato e selezionare una cartella in cui salvare il file di dati (s). Inserire il numero di cellule di acquisire accanto a "raccogliere".. In genere questo numero è 1.000.
    17. Clicca su "Acquisisci".
      NOTA: Una volta che il numero desiderato di cellule viene acquisito il file di dati viene salvato automaticamente nella cartella precedentemente selezionata.
  3. Ripetere il passaggio 8.10 per il "solo PI" campione di controllo. I campioni sperimentali sono ora pronti per essere raccolti.
  4. Gestire le remaining campioni sperimentali, tra cui i "Campioni spontanee" S "" come segue:
    1. Lasciare l'obiettivo 40X nella scheda "ingrandimento" selezionato.
    2. Accendere il 405 mW e 642 mW laser.
    3. Attivare il canale "Brightfield".
    4. Clicca su "Imposta intensità."
    5. Nella scheda "File di acquisizione", inserire il nome del file in un testo personalizzato e selezionare una cartella in cui salvare il file di dati (s). Inserire in un testo il nome del file personalizzato.
    6. Inserire il numero di cellule di acquisire accanto a "raccogliere".
    7. Fare clic sul pulsante "Acquisisci".
      NOTA: Una volta che il numero desiderato di cellule viene acquisito il file di dati viene salvato automaticamente nella cartella precedentemente selezionata.
  5. Ripetere il passaggio 8.12 per tutti i campioni sperimentali.
  6. Dopo che tutti i dati sperimentali e file sono stati raccolti, fare clic sul pulsante "Shutdown" per sterilizzare il sistema.

9. ImaginAnalisi dei campioni g citofluorimetro

  1. Aprire il flusso di imaging citometro applicazione software di analisi.
  2. Sotto "File", aprire un file .RIF sperimentale.
  3. Costruire una nuova matrice utilizzando i file .RIF singolo colore (Dio-solo il controllo e il controllo PI-only, creato durante fasi 8.10 e 8.11) selezionando "Crea un nuovo Matrix" nella scheda di compensazione nel flusso di immagini citometro software.
    NOTA: Il software chiederà per la selezione dei file a colori singoli e unirli per creare un file di matrice (estensione del file .ctm), che deve essere selezionato per applicare la compensazione del canale.
  4. Creare diagrammi di punti utilizzando la funzione di "mattoni" del software.
    1. Creare un dot-plot (BrightFieldGradient_RMS vs Frequency) per porta le cellule mirate. Chiama il cancello "Focus" (Figura 1A).
    2. Utilizzando la porta "Focus", creare un diagramma a punti di Bright Campo Area vs campo luminoso Proporzioni di g mangiato le cellule di singoletto. Chiama il cancello "Single" (Figura 1B).
    3. Utilizzando la porta "Single", creare un diagramma a punti di Intensity_MC_Ch02 vs Intensity_MC_Ch5. Utilizzare questa trama per identificare e porta Dio-positivo solo le cellule (obiettivi, vivo) e PI-dio cellule doppio positive (obiettivi, morte) (Figura 1C).
      NOTA: Tutte le trame descritto nei punti 9.4.1, 9.4.2, 9.4.3 e possono essere creati utilizzando la funzione "mattoni" del software.
  5. Fare clic sulla funzione statistica della trama punto per accedere ai numeri cellulari di ogni porta.
  6. Calcolare la percentuale di bersagli morti nel campione spontanea e campioni sperimentali utilizzando la seguente formula:
    % bersagli morti in campione = (target #dead x 100) / (# vivono obiettivi + #dead obiettivi)
  7. Calcolare citotossicità utilizzando la seguente formula:
    % Citotossicità = [(Experimental dead-spontaneo morto) / (morto 100-spontaneo)] x100
_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figura 1
Figura 1: istogrammi rappresentativi, grafici a dispersione e le immagini per l'analisi attività citotossica. Analisi (A) cella di messa a fuoco. (B) analisi singola cella. Analisi (C) bersaglio colorazione delle cellule. Tutte le determinazioni sono realizzati con l'immagine allegata ad ogni evento. Questo può essere letta in software di analisi, semplicemente cliccando sulla manifestazione sui grafici. (D) immagine rappresentativa di un evento doppietto, che mostra un cellulare per apoptosi NK e un obiettivo K562 dal vivo. CH01, Brightfield. Ch02, DIO. CH05, PI. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Representative Results

Determinazione del numero di cellule NK
L'effetto della corsa pesante sul conteggio delle cellule NK nel sangue intero è stato misurato, utilizzando il protocollo di esercizio descritto nella Figura 2. I campioni di sangue sono stati elaborati prima dell'esercizio, immediatamente dopo l'esercizio, 1,5 ore dopo l'esercizio, e, infine, 24 e 48 ore dopo il prelievo di sangue iniziale. La concentrazione di cellule NK per millilitro di sangue intero è stato misurato per ciascun canale (Figura 3A) e in media (Figura 3B) per ciascun punto di tempo.

I nostri risultati (Figura 3a) mostrano che i corridori 1, 2, e 4 presentano un modello simile, con un leggero aumento del numero di cellule NK dopo l'esercizio, subito seguito da un netto calo, tornando prima lentamente alla normalità dopo 24 e 48 ore. Questa tendenza è stata particolarmente visibile tracciando le medie delle cellule NK per il gruppo di corridori, ma nessuna differenza significativa dai livelli di pre-esercizio è stato rilevato. Runner 3 ha presentato un numero molto alto, inizialmente, che nettamente diminuita dopo l'esercizio fisico e 1,5 ore dopo l'esercizio, prima lentamente tornando alla normalità dopo 24 e 48 ore. In media, il conteggio delle cellule NK (Figura 3B) è diminuita di 1,5 h dopo l'esercizio (anche se non in modo significativo), ma è tornato a livelli normali vicino dopo 24 ore.

Determinazione della citotossicità delle cellule NK
Dopo aver calcolato il numero di cellule NK, cellule NK sono stati immediatamente istituiti per determinare la loro attività citotossica come descritto nella sezione 6 del protocollo. I risultati sono presentati nella Figura 4A per ogni singolo canale, con la Figura 4B raffigurante la citotossicità NK media. I nostri risultati mostrano che la media citotossicità NK è leggermente diminuito dopo l'esercizio e 1,5 ore dopo l'esercizio (anche se non in modo significativo), ma significativamente aumentato dopo 24 ore. La citotossicità NK è rimasta elevata rispetto al prelivelli -Esercizio, anche se non in modo significativo (in parte a causa del piccolo numero di partecipanti a questo progetto pilota).

figura 2
Figura 2: protocollo di esercizio. I prelievi di sangue (frecce rosse) sono stati eseguiti su n = 4 corridori.

Figura 3
Figura 3: le cellule NK conta pre-allenamento, post-allenamento, 1,5 h e 21 h post-allenamento. Conteggio (A) cellule NK per millilitro di sangue intero per ogni singolo canale. Count (B) delle cellule NK media per millilitro di sangue intero. N = 4; Barre di scala = errore standard.

Figura 4
Figura 4:NK cellule citotossicità pre-allenamento, post-allenamento, 1,5 h e 21 h post-allenamento. Citotossicità (A) cellule NK (espressa come percentuale di cellule bersaglio morte) per ogni singolo canale. (B) media citotossicità delle cellule NK (espressa come percentuale di cellule bersaglio morti). N = 4; Barre di scala = errore standard; *: P <0.05; **: P <0.005.

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Discussion

Il metodo descritto in questo studio misura direttamente l'attività specifica di cellule NK di un individuo in risposta a stimoli (in questo caso particolare, esercizio prolungato). Tipicamente, le cellule NK sono isolati dal proprio sangue utilizzando gradienti di densità o di separazione delle cellule utilizzando una combinazione di marcatori. Mentre questi metodi sono ampiamente utilizzati, hanno molti svantaggi: sono in termini di tempo, coinvolgono più manipolazioni, e sono fortemente dipendenti dell'utente. Come risultato, eccessivo stress è posto sulle cellule NK isolate, che può risultare in un aumento della variabilità da esperimento per sperimentare, o anche all'interno dello stesso esperimento. In questo articolo, abbiamo descritto un protocollo che utilizza isolamento magnetico-based. Ciò consente ordinamento rapido e affidabile di un elevato numero di cellule NK nel sangue intero di un individuo, minimizzando sangue o manipolazione di cellule NK.

Questo metodo è particolarmente adatto per gli studi umani in cui i campioni sono scarsi, masul flipside metodo diventa piuttosto difficile quando troppo campioni devono essere trattati insieme. Infatti, la finestra di acquisizione a dosaggio citotossico deve essere tipicamente entro 30 minuti dopo la fine dell'incubazione, che nella nostra esperienza traduce in 5 campioni per volta al massimo. Se molti campioni devono essere trattati, è fondamentale per stabilire un programma sconcertante per consentire un tempo sufficiente per l'acquisizione di citometria a flusso. Un altro inconveniente di questo metodo potrebbe essere il costo dei reagenti che sono abbastanza elevati e possono essere consumati rapidamente se più quantità di sangue viene elaborato per la maggiore resa NK. Tuttavia, riteniamo che questi costi sono bilanciati dalla notevole quantità di tempo risparmiato.

I passaggi critici in questo protocollo sono quelli che sono i più aperti a modifiche. E 'fondamentale per mantenere il sangue a temperatura ambiente e di elaborare entro un'ora di disegno per evitare lo stress delle cellule NK. Dopo l'isolamento, la conta delle cellule è estremamente critica peraccuratezza dei risultati, in modo che il metodo di conteggio deve essere costante: ad esempio, per il saggio blu trypan fare in modo che più le piazze sono contate sul emocitometro, e che l'utente o il laboratorio sta utilizzando gli stessi parametri di identificazione. Il protocollo qui presentata utilizza 1,5 mL di sangue e citotossicità cella di prova NK a T: E rapporto di 1: 5, tuttavia questi parametri può essere ottimizzato a seconda del dosaggio desiderato e la quantità disponibile di sangue: se meno sangue è disponibile, allora è possibile utilizzare rapporti inferiori come 1: 4 o 1: 3 per avere ancora tempo di acquisizione ragionevole. Nella nostra esperienza rapporti più bassi potrebbero essere insufficienti per consentire una adeguata attività citotossica. Inoltre, a causa di variazione di esempio, accade che il numero di cellule NK è molto inferiore al previsto; in risposta, è necessario ridurre la quantità di cellule bersaglio in provette di reazione per mantenere la stessa T: rapporto E durante un esperimento. Durante l'analisi risultato, la fase più critica è quello di spendere così tanto tempo necessario perottenere una buona matrice. Questo può essere ottenuto solo se la grande cura è presa per preparare i controlli descritti al punto 3 del protocollo. Una volta che cancelli sono stati stabiliti come descritto al punto 9, i file possono essere batch insieme e analizzati in serie con pochissima variazione. In caso di dubbio, l'utente deve sempre fare riferimento alla galleria di immagini cliccando su ogni caso tracciata su un grafico (visto in Figura 1C), al fine di verificare che tutti gli eventi corrispondenti sono compresi nella porta corretta.

I risultati rappresentativi nella Figura 2A hanno mostrato che 3 corridori su 4 hanno presentato un modello simile. Il modello del 4 ° corridore era probabilmente specifico per quel individuale e non rappresenta una misura errata. La conta delle cellule NK per questo individuo era al limite superiore del range accettato nel sangue intero umano sia pre-esercizio e 48 ore post-esercizio. Questo dimostra uno dei punti di forza del metodo descritto in questo documento, dove NK cells possono essere ottenuti con precisione. Inoltre, la possibilità di ottenere cellule native attraverso un passo di etichettatura unico, permette il minimo stress e le modifiche alle cellule NK. Questo è particolarmente importante quando citotossicità delle cellule NK viene misurato in condizioni di stress fisiologico.

Dopo aver isolato, citotossicità delle cellule NK è tipicamente determinata mediante citometria di flusso o un test di rilascio radioattivo (test di cromo per esempio). Mentre i test di rilascio sono considerati un gold standard, si basano sull'uso di isotopi radioattivi e relative apparecchiature, che sono estremamente costosi. Inoltre, i regolamenti per l'utilizzo e lo smaltimento dei materiali radioattivi aggiungere complessità agli esperimenti che richiedono tempo-efficienza e precisione. L'uso di un citofluorimetro approccio ha senso ma precauzioni tipici deve essere seguita incluse le impostazioni laser, e compensazione fluorocromo e gating. Ciò è particolarmente vero quando 2 differenti tipi di cellule sono in sample, come è il caso per saggi citotossici. Tuttavia, nel nostro caso l'utilizzo di un flusso di imaging permette citometro un'immagine da acquisire per ogni evento, e il parametro rapporto dimensionale consente la separazione di doppietti da singole cellule. Questo è un punto critico, in quanto il dosaggio citotossico basa sul contatto fisico tra l'effettore e il bersaglio; molto spesso questi 2 tipi di cellule saranno ancora insieme durante la misurazione del flusso, l'introduzione di falsi positivi doppie nei risultati. Questo molto punto è illustrato in Figura 1D, che mostra un doppietto formata da un (morendo, PI positivo) delle cellule NK, e un (vivo, DiO positivi, PI negativo) K562. In citometria di flusso tradizionale, questo evento verrà aggiunto al conteggio morte cellulare K562, ma è in realtà un falso positivo. Dati Rimozione possono infatti essere problematico, tuttavia non è, se è fatto costantemente e utilizzando parametri molto rigidi da esperimento per esperimento (in questo caso, il parametro "rapporto d'aspetto"). In cambio,i dati ottenuti saranno molto più stabile. Inoltre, la visualizzazione di tutti gli eventi permette di gating preciso (e contare) di ogni evento in base ai parametri del colore, senza fare affidamento su porte rigide che sono tradizionalmente stabiliti utilizzando i controlli e che non tengono conto del naturale "deriva dei dati" che può verificarsi in citometria a flusso. La capacità aggiunta di immaginare ogni singolo evento di destinazione durante l'acquisizione, consente una migliore controllo dell'immagine singola (solo DiO, che rappresenta le cellule bersaglio vivi) e la popolazione doppio macchiato (DIO + PI macchiato, che rappresenta le cellule bersaglio morte).

Inoltre, il flusso di lavoro qui presentato è stato ottimizzato per tener conto della scarsità di cellule NK nel sangue intero e la necessità di risultati accurati. Mentre tradizionali saggi di citotossicità delle cellule NK esplorare l'attività litica in diversi T: rapporti E, è poco pratica per un paio di ragioni: 1) la quantità di cellule NK disponibili dal sangue intero è limitato ed estremamente variable e 2) la quantità di cellule bersaglio necessarie per l'analisi deve essere sufficientemente grande da consentire l'acquisizione abbastanza veloce dei dati. Diversi test a diversi rapporti (non illustrato qui) hanno mostrato che una 1: 5 T: rapporto E, che si traducono in 4 x 10 4 T / 2 x 10 5 E dà un equilibrio ottimale, e permette di grande riproducibilità. Sulla base di analisi utilizzate con campioni provenienti da diversi individui (non illustrati), questo rapporto fornisce anche una attività citotossica previsto di 50-70% in campioni normali, che offre una significativa sopra e sotto finestra per misurare l'effetto di interventi.

La conta delle cellule NK era simile a quanto riscontrato in altre opere 11, 12, 13, e in linea con la gamma accettata della frequenza di cellule NK di sangue 14. Tuttavia, il vantaggio di questo nuovo workflow è dimostrato in figura 3B, dove rileviamoed un significativo aumento della citotossicità delle cellule NK dopo 24 h rispetto ai livelli pre-allenamento, nonostante un numero di cellule NK che era in media (anche se non significativamente) inferiore a quello stesso punto temporale. Questo risultato si differenzia da altri studi pubblicati in cui i livelli di citotossici erano per lo più identici (o anche meno) ai livelli pre-allenamento. Si suggerisce che invece di essere depresso per un lungo periodo di tempo post-esercizio, citotossicità delle cellule NK potrebbe essere in grado di "rebound" livelli ancora più elevati dopo appena 21 h post-esercizio. Questa osservazione utilizzando una nuova metodologia con cellule NK, sane puri, se confermato in studi di follow-up, ha il potenziale per cambiare il punto di vista attuale che lo sforzo pesante è immunosoppressiva. Quando le cellule NK sono ottenuti utilizzando gradienti di Ficoll o l'ordinamento a base di citometria a flusso, la popolazione risultante è mescolato con altri tipi di cellule, contenere più le cellule NK nocivi e / o cellule NK con risposta modificato. Queste conseguenze sono da aspettarsi considering la lunghezza, durezza e / o imprecisa dei metodi di cui sopra. La rimozione di questi problemi, e stare vicino a condizioni fisiologiche in ogni momento, porterà a risultati sperimentali più rappresentativo delle cellule NK nel comportamento vivo.

Per riassumere, abbiamo descritto un workflow integrato che consente un facile, isolamento accurata e rilevamento della citotossicità delle cellule NK da piccoli campioni di sangue umano che evita alcune delle limitazioni associate con altri metodi. Mentre il sangue umano è stato al centro di questo lavoro, è da notare che questa metodologia può essere applicata a campioni di sangue animale. Questo flusso di lavoro è estremamente riproducibile e in grado di rilevare piccole variazioni, il che è particolarmente utile per gli studi di esercizi dove i numeri dei partecipanti sono misure di sangue limitate e seriali vengono acquisite. Come sottolineato nei risultati rappresentativi, questo metodo migliorato ha il potenziale per sfidare e migliorare le conoscenze attuali in esercizio immunologia,e altri settori legati alle NK immuno-sorveglianza.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
K-562 lymphoblasts ATCC CCL-243
Iscove's Modified Dulbecco's Media ATCC 30-2005 High glucose, with L-Glutamine, with HEPES, Sterile-filtered
Alpha Minimum Essential medium ATCC CRL-2407 Without ribonucleosides and deoxyribonucleosides but with 2 mM L-glutamine and 1.5 g/L sodium bicarbonate
Trypan Blue Solution 0.4% Amresco K940-100ML Tissue culture grade
Propridium Iodide Staining Solution BD Pharmingen 51-66211E
Vybranto DiO cell-labeling solution Vybranto V-22886
autoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec 130-092-545
autoMACS Running Buffer Miltenyi Biotec 130-091-221
autoMACS Washing Buffer Miltenyi Biotec 130-092-987
autoMACS Columns Miltenyi Biotec 130-021-101
Whole Blood CD56 MicroBeads, human Miltenyi Biotec 130-090-875
ImageStream X Mark II Imaging Flow Cytometer EMD Millipore
Speedbeads Amnis Corporation 400030
0.4-0.7% Hypochlorite (Sterilizer) VWR JT9416-1
Coulter Clenz Beckman Coulter 8546929
70% Isopropanol (Debubbler) EMD Millipore 1.3704
D-PBS (Sheath fluid) EMD Millipore BSS-1006-B (1X) No calcium or magnesium
INSPIRE Software EMD Millipore Version Mark II, September 2013
Ideas Application Software EMD Millipore Version 6.1, July 2014

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References

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  5. Simpson, R. J., Kunz, H., Agha, N., Graff, R. Exercise and the Regulation of Immune Functions. Prog Mol Biol Transl Sci. 135, 355-380 (2015).
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Immunologia delle cellule Natural Killer citotossicità umano sangue intero l'esercizio fisico citometria a flusso
Flusso analisi di citometria di Natural Killer cellulare Lytic attività nel Sangue umano intero
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McBride, J. E., Meaney, M. P., John, … More

McBride, J. E., Meaney, M. P., John, C., Nieman, D. C., Warin, R. F. Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood. J. Vis. Exp. (121), e54779, doi:10.3791/54779 (2017).

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