Summary
इस प्रोटोकॉल के समग्र लक्ष्य सही अनुकूलित 3 डी-मुद्रित मस्तिष्क धारकों और स्लाइसर बक्से के सृजन के माध्यम से ऊतक विज्ञान वर्गों के साथ चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) छवि संस्करणों के लिए पंक्ति में है।
Protocol
सभी जानवर से निपटने और इस के साथ साथ वर्णित प्रक्रियाओं एक प्रोटोकॉल मस्तिष्क संबंधी विकार के राष्ट्रीय संस्थान और स्ट्रोक पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित के अनुसार में प्रदर्शन कर रहे थे। दिमाग आम marmosets (Callithrix jacchus) EAE विकसित करने के लिए प्रेरित से एकत्र किए गए थे। 11 दिमाग 3 सप्ताह और एक साल 4% paraformaldehyde के transcardial छिड़काव द्वारा इच्छामृत्यु के बाद बीच के लिए 10% formalin में संग्रहीत किया गया।
1. शवपरीक्षा एमआरआई तैयारी और अधिग्रहण
- एक प्रकार का बंदर मस्तिष्क
- कपास धुंध के साथ एक कार्य केंद्र, एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब, छोटे spatulas, एक fluorinated तेल, आयल की 30 मिलीलीटर, और एक प्रकार का बंदर मस्तिष्क तैयार ~।
- fluorinated तेल और 20 एमएल निशान धुंध के साथ ट्यूब भरें। धुंध सेक जिस तरह से साथ हवाई बुलबुले को दूर करने के लिए।
- एक कागज तौलिया के साथ मस्तिष्क की सतह से धीरे सूखी formalin। के नीचे की ओर ललाट पोल के साथ मस्तिष्क डालेंनली। ध्यान से अपनी स्थिति को ठीक करने के लिए पक्षों के आसपास अधिक धुंध का उपयोग कर ट्यूब में मस्तिष्क को सुरक्षित। अतिरिक्त एमआरआई स्कैन की स्थापना के लिए एक एमआरआई मस्तिष्क पालने बनाने की एक विधि के लिए अनुपूरक धारा 11 का संदर्भ लें।
- धुंध और fluorinated तेल के साथ ट्यूब के बाकी भरें। ध्यान से जिस तरह से साथ हवाई बुलबुले को दूर। टोपी को सुरक्षित और आयल के साथ ट्यूब सील।
- interhemispheric विदर के साथ लाइन में टोपी निशान। एक कागज तौलिया ट्यूब में लपेटें और मार्क शीर्ष केंद्र के साथ कुंडली में डालें।
- मोल 2 डी स्पिन गूंज T2। पैरामीटर तालिका 1 में दिया जाता है।
- Mipav में 10 संरचनात्मक 150 माइक्रोन T2-weigted अधिग्रहण खोलें और 6 वें अधिग्रहण करने के लिए रजिस्टर।
नोट: पंजीकरण स्वतंत्रता के 9 डिग्री, विंडोड sinc प्रक्षेप, सामान्यीकृत पार सहसंबंध लागत समारोह, एक पावेल बुला ब्रेंट खोज एल्गोरिथ्म के साथ साथ एक अनुकूलित स्वत: पंजीकरण 3.5D एल्गोरिथ्म है। घुमाव 10 से नमूना थे6; 5 डिग्री बढ़ाने मोटे घुमाव और ठीक घुमाव 1 ° बढ़ाने के साथ -10 डिग्री करने के लिए। तब पंजीकृत छवियों औसत: यूटिलिटीज, छवि कैलकुलेटर थोक छवियों, औसत।
- मानव मस्तिष्क
- brainstem मध्यमस्तिष्क के स्तर पर एक कट का उपयोग करने से अग्रमस्तिष्क अलग करें। 10 गोलार्द्धों भी midline नीचे कटौती के साथ अलग किया जा सकता है।
- एक छोर पर एक hemispheric गुंबद और दूसरे छोर पर एक टोंटी के साथ एक बेलनाकार नली में अग्रमस्तिष्क स्थिति।
- टोंटी के माध्यम से एक fluorinated तेल के साथ ट्यूब भरें। कोमल चूषण के लिए ~ टोंटी के माध्यम से 30 मिनट का उपयोग कर हवा बुलबुले निकालें।
- मोल 3 डी टी 1-MPRAGE। पैरामीटर तालिका 1 में दिया जाता है।
2. मस्तिष्क की सतह निकालने: Mipav 7.2
- राज्याभिषेक अभिविन्यास में एमआरआई खोलें।
- एल्गोरिदम, परिवर्तन उपकरण का चयन करें, बदलने, प्रतिदर्श चैनल। उपयोगकर्ता द्वारा निर्धारित आकार का चयन करें और isot को resampleropic voxels: 0.1 x 0.1 x 0.1 मिमी। Brain_MRI_Resampled के रूप में resampled एमआरआई बचाओ। मानव: प्रतिदर्श चैनल voxels isotropic 0.3 x 0.3 x 0.3 मिमी।
- एल्गोरिदम, फिल्टर (स्थानिक), nonlinear शोर में कमी का चयन करें। डिफ़ॉल्ट सेटिंग का उपयोग, ठीक पर क्लिक करें।
- दिखाता खोज तालिका का चयन करें और दोहरी दहलीज बटन पर क्लिक करें। ग्राफ पर स्लाइडर खींचें पूरे मस्तिष्क को कवर करने के लिए।
- एल्गोरिदम, विभाजन, सीमा, सीमा का उपयोग कर न्यूनतम / अधिकतम चयन करें। तीव्रता ग्राफ "ऊपरी सीमा" बॉक्स में (सिर्फ पैमाने के नीचे) के नीचे बाएँ कोने में स्थित मान दर्ज करें। "बाइनरी" उत्पादन छवि प्रकार के लिए में चयन करें और अचयनित "पलटना दहलीज।"
- एल्गोरिदम, रूपात्मक का चयन करें, छेद भरें। "2.5D में प्रक्रिया।" चेक
- क्योंकि इस पूरे मस्तिष्क के एक एमआरआई है, वहाँ hindbrain और कोर्टेक्स भरे जाने की जरूरत है कि दोनों के बीच कुछ खाली जगह है। मानव मस्तिष्क: इस कदम को छोड़।
- लाइन VOI का उपयोग करना, एक कनेक्शन में आकर्षितसबसे पार्श्व बिंदु पर hindbrain और मस्तिष्क के दोनों किनारों पर कोर्टेक्स के बीच। मस्तिष्क के माध्यम से इस जारी रखें।
- VOI, Voi रूपांतरण, द्विआधारी मुखौटा करने के लिए सभी का चयन करें। यूटिलिटीज का चयन करें, छवि कैलकुलेटर। का चयन करें या ऑपरेटर लटकती मेनू से और मस्तिष्क मुखौटा का चयन करें। का चयन करें "को बढ़ावा देने गंतव्य छवि प्रकार"
- एल्गोरिदम, रूपात्मक का चयन करें, छेद भरें। चेक "2.5D में प्रक्रिया"
- Brain_Model.nii के रूप में द्विआधारी मुखौटा बचाओ।
- एल्गोरिदम, निकालें सतह (अग्रसर क्यूब्स) का चयन करें। मुखौटा छवि का चयन करें, Brain_Model.ply के रूप में सहेजें।
3. स्लाइस स्थानों के चयन: Mipav 7.2
- ब्याज या स्थिति शुरू से ऊतक को पहचानें। इरादा स्लैब मोटाई की गणना। एक प्रकार का बंदर मस्तिष्क में, खंड प्रति 30 एमआरआई स्लाइस, और ब्लेड अंतराल के प्रति 5 एमआरआई स्लाइस, गिनती .5 मिमी ब्लेड अंतराल के साथ 3 मिमी वर्गों बनाता है, ~ 3.5 मिमी स्लैब में जिसके परिणामस्वरूप। मानव मस्तिष्क: खंड के अनुसार 20 एमआरआई स्लाइस, और 4 एमआरआई SLब्लेड अंतराल के प्रति ices, 1.2 मिमी ब्लेड अंतराल के साथ 6 मिमी वर्गों बनाता ~ 7.2 मिमी स्लैब में जिसके परिणामस्वरूप।
- पहले ब्लेड अंतराल के स्थान पर, पर "बॉक्स VOI" पर क्लिक करें और फिर मस्तिष्क पर एक बॉक्स आकर्षित। बॉक्स के अंदर क्लिक करें यह चयन करने के लिए। कॉपी और प्रत्येक एमआरआई टुकड़ा ब्लेड की खाई को इसी के लिए समोच्च पेस्ट करें।
- खंड मोटाई के लिए इसी एमआरआई स्लाइस की संख्या से आगे बढ़ें और कॉपी और समोच्च अगले ब्लेड की खाई को इसी पेस्ट करें। मस्तिष्क के माध्यम से इस प्रक्रिया को दोहराएं।
- VOI, Voi रूपांतरण, बाइनरी मुखौटा करने के लिए सभी का चयन करें। Blade_Gaps.nii के रूप में सहेजें।
- एल्गोरिदम, निकालें भूतल (अग्रसर क्यूब्स), मास्क छवि, Blade_Gaps.ply का चयन करें।
4. बनाना एमआरआई ब्लेड नक्शा: Mipav 7.2
- Brain_MRI_Resampled और Blade_Gaps.nii छवियों को खोलें।
- चुने गए Blade_Gaps.nii छवि, उपयोगिताएं का चयन करें, छवि गणित के साथ। छवि प्रकार और गुणा को बढ़ावा देने का चयन करें।मूल्य के रूप में 10,000 दर्ज करें।
- यूटिलिटीज का चयन करें, छवि कैलक्यूलेटर। जोड़ें का चयन करें, और फिर छवि लटकती बॉक्स से Brain_MRI_Resampled छवि का चयन करें। को बढ़ावा देना गंतव्य छवि प्रकार का चयन करें।
- इस छवि को Brain_BladeMap.nii के रूप में सहेजें।
- Triplanar दृश्य पर क्लिक करके, स्थानों जहां मस्तिष्क कटा हुआ हो जाएगा तीन orthogonal विचारों में देखा जा सकता है।
5. मस्तिष्क और ब्लेड गैप सतहों आयात: Netfabb व्यावसायिक
- भाग का चयन, भाग जोड़ें। फ़ाइलों Brain_Model.ply और Blade_Gaps.ply चुनें
- मस्तिष्क का चयन करें और मरम्मत मोड पर क्लिक करें। मरम्मत मोड में:
- खोल चयन बटन पर क्लिक करें और फिर मस्तिष्क पर क्लिक करें।
- अन्य meshes का चयन करने के लिए टॉगल चयन बटन पर क्लिक करें। निकालें पर क्लिक करें अन्य meshes हटाने के लिए।
- पर क्लिक करें मरम्मत लागू करें, और पुराने हिस्से को हटा दें।
- सही मस्तिष्क पर क्लिक करें। इस कदम का चयन करें। पर क्लिक करेंमूल बटन करने के लिए। रिकॉर्ड XYZ पैरामीटर है कि दिखाई देते हैं। ये अनुवाद मानकों को ब्लेड स्थिति Mipav में स्थापित बनाए रखने के लिए आवश्यक हैं। अनुवाद पर क्लिक करें। फिर विंडो बंद करें। (एक बार से अधिक का अनुवाद क्लिक न करें। यह फिर से एक ही मापदंड का उपयोग कर अनुवाद करेंगे।)
- Blade_Gaps मॉडल का चयन करें। सही भाग पर क्लिक करें, और इस कदम का चयन करें। XYZ मापदंडों के बक्से में पहले से दर्ज XYZ मान दर्ज करें। अब अनुवाद करें क्लिक करें और विंडो बंद करें।
- Brain_Model मॉडल का चयन करें और मरम्मत मोड पर क्लिक करें। मरम्मत मोड में:
- खोल चयन बटन पर क्लिक करें और फिर मस्तिष्क पर क्लिक करें।
- ठीक क्लिक करें और चिकना त्रिकोण का चयन करें। 4-5 पुनरावृत्तियों दर्ज करें। रोकें मात्रा सिकुड़ने की जाँच करें। मानव मस्तिष्क: 1-2 पुनरावृत्तियों।
- राइट क्लिक करें, त्रिकोण में कमी का चयन करें। लक्ष्य त्रिकोण गिनती में 200000 दर्ज करें और निष्पादित करें।
- स्वत: मरम्मत, डिफ़ॉल्ट की मरम्मत पर क्लिक करें। फिर पर क्लिक करें मरम्मत लागू करें
- ठीक क्लिक करें, नाम बदलें। Smoothed_Brain_Model के रूप में smoothed मस्तिष्क का नाम बदलें।
- Smoothed_Brain_Model का चयन करें। राइट क्लिक करें, निर्यात, एसटीएल।
6. संपादन ब्रेन आकृति: Meshmixer
- Meshmixer में Smoothed_Brain_Model आयात करें।
- जाल करने के लिए समायोजन करने के लिए sculpting और चयन उपकरण का प्रयोग करें। संपादन में शामिल हैं:
- Sculpting उपकरण, मजबूत चिकनी का प्रयोग करें। क्षेत्र लाइन VOIs करने के लिए इसी चिकना। मानव मस्तिष्क: इस कदम को छोड़।
- कोर्टेक्स कि बॉक्स में नीचे चेहरा होंगे की सतह चिकनी।
- छोटे divots है कि हो सकता है meshing और संपादन की प्रक्रिया में बनाया गया है दूर चिकना।
- विश्लेषण, इंस्पेक्टर, सब Autorepair का चयन करें।
- Smoothed_Brain_Model Smoothed_Edited_Brain_Model के रूप में निर्यात करें।
7. ब्रेन स्लाइसर बॉक्स बनाने: Netfabb व्यावसायिक
- भाग का चयन, भाग जोड़ें। Fil चुनेंई Smoothed_Edited_Brain_Model।
- भाग का चयन, भाग जोड़ें। तब एसटीएल फ़ाइल ब्रेन स्लाइसर Parts_Marmoset का चयन करें और खोलें क्लिक करें। मानव मस्तिष्क: मस्तिष्क स्लाइसर Parts_Human (पूरक कोड फ़ाइलें)।
- सही भाग पर क्लिक करें, और भागों के लिए बढ़ा दिया, गोले का चयन करें। व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक भाग का चयन करें और उन्हें सही नाम बदलने के लिए क्लिक करें। (आंख एक उद्देश्य के लिए अगले पर क्लिक करके यह खाल या यह दिखाई देता है।) बड़ी बॉक्स मुख्य, छोटे से बॉक्स उप, और काटने बॉक्स Box_Cutout, षट्कोण आकार Blade_Holder_Main, छोटे फ्लैट बॉक्स microtome ब्लेड, और आधा नाम बदलें ट्यूब वस्तु पालना। मानव मस्तिष्क: नहीं Blade_Holder_Main, microtome ब्लेड, या पालना।
- मुख्य, उप, ब्लेड, Blade_Holder_Main, microtome ब्लेड, और पालना छिपाने के लिए और सभी छह और Box_Cutout चयन करने के लिए पारी का चयन का उपयोग करें। केवल Box_Cutout और Smoothed_Edited_Brain_Model दिखाई जानी चाहिए, लेकिन Smoothed_Edited_Brain_Model चयनित नहीं किया जाना चाहिए।
- क्लिक करें और बॉक्स स्थिति मस्तिष्क के सापेक्ष समायोजित करने के लिए चयनित भागों खींचें।
- बॉक्स के केंद्र में मस्तिष्क की स्थिति। स्थिति मस्तिष्क बॉक्स में काफी गहरे कसकर जकड़ लिया जा सकता है, लेकिन overhangs कि उचित स्थान रोकने बनाने के लिए भी गहरी नहीं।
- एक बार हों, मस्तिष्क बॉक्स समोच्च overhangs के लिए परीक्षण किया जा सकता है। Box_Cutout और Smoothed_Edited_Brain_Model का चयन करें। बूलियन ऑपरेशन का चयन करें।
- Smoothed_Edited_Brain_Model पर क्लिक करें यह लाल बारी है।
- बूलियन घटाव का चयन करें, और गणना लागू होते हैं।
- overhangs कि सुरक्षित रूप से बक्से में रखा जा रहा है मस्तिष्क के ऊतकों को रोका जा सके मस्तिष्क के लिए बॉक्स को चेक करें। इन overhangs मौजूद हैं, तो मस्तिष्क को समायोजित तो यह बॉक्स के भीतर कम गहरा है। मस्तिष्क वांछित गहराई और overhangs पर हैमौजूद हैं, overhangs को हटाने के लिए एक समाधान के लिए अनुपूरक धारा 10 को देखें।
- Blade_Gaps मॉडल का चयन करें। राइट क्लिक करें, का चयन हटो। स्थिति Z मूल्य रिकॉर्ड, फिर विंडो बंद करें। यह सबसे पीछे ब्लेड खाई की स्थिति होगी।
- ब्लेड एसटीएल कि मस्तिष्क स्लाइसर भागों से आए चयन करें। राइट क्लिक करें, का चयन हटो।
- निरपेक्ष अनुवाद का चयन करें। 7.8 से Z मान दर्ज करें। एक्स और वाई मूल्यों के लिए, वर्तमान स्थिति पैरामीटर बक्से से इसी मान दर्ज
- ब्लेड एसटीएल का चयन करें। राइट क्लिक करें, डुप्लिकेट क्लिक करें।
- भागों की व्यवस्था की जाँच करें। कुल गिनती में ब्लेड की कुल संख्या दर्ज करें। जेड गिनती बॉक्स में यही संख्या लिखें। जेड खाई में स्लैब मोटाई दर्ज करें। डुप्लिकेट पर क्लिक करें। अगर स्लैब मोटाई विविध किया गया था, ब्लेड को व्यक्तिगत रूप से तैनात करने की आवश्यकता होगी। पिछले से प्रत्येक नए ब्लेड डुप्लिकेट (पीछे से आगे बढ़ पूर्वकाल के लिए)Z अंतर है कि खंड के लिए खंड मोटाई के बराबर है।
- Microtome ब्लेड के लिए कदम 7.9 और 7.10 दोहरा द्वारा बिल्कुल स्लाइसर में ब्लेड के रूप में एक ही अंतराल पर microtome ब्लेड भागों स्थिति। मानव मस्तिष्क: इस कदम को छोड़।
- Blade_Holder_Main भाग के साथ-साथ microtome ब्लेड का चयन करें और बूलियन ऑपरेशन का चयन करें।
- उन्हें लाल को उजागर करने microtome ब्लेड में सभी ब्लेड का चयन करें। बूलियन घटाव पर क्लिक करें, और गणना लागू होते हैं।
- मरम्मत मोड का चयन करें। एक विस्तारित मरम्मत कार्य करें। मरम्मत लागू चयन करें, और पुराने हिस्से को हटा दें।
- हिस्सा ब्लेड धारक का नाम बदलें। एसटीएल के रूप में हिस्सा निर्यात करें।
- शिफ्ट का चयन Smoothed_Edited_Brain_Model, पिछले चरण में बनाए ब्लेड मॉडल के सभी, और उप मुख्य और। बूलियन संचालन पर क्लिक करें।
- एसई द्वारा मुख्य लाल के अलावा भागों के सभी बनाओउन्हें lecting और हरे रंग के बॉक्स के तहत तीर पर क्लिक उन्हें लाल को स्थानांतरित करने के लिए।
- बूलियन घटाव का चयन करें और फिर गणना लागू चयन करें।
- मरम्मत मोड पर क्लिक करें। मरम्मत मोड में:
- overhangs और तेज अंक के लिए बॉक्स को चेक करें। ये Netfabb या Meshmixer में smoothed जा सकता है।
- स्वत: मरम्मत, विस्तारित मरम्मत पर क्लिक करें। उसके बाद सुधार लागू करते हैं और पुराने हिस्से को हटा दें
- सही मरम्मत मस्तिष्क बॉक्स पर क्लिक करें और यह नाम बदलने ब्रेन स्लाइसर बॉक्स। एक एसटीएल के रूप में निर्यात।
8. Ultimaker 2 पर मुद्रण ब्रेन स्लाइसर बॉक्स
- एक प्रकार का बंदर दिमाग: Cura
- आयात Cura में मस्तिष्क स्लाइसर बॉक्स।
- घुमाएँ का चयन करें और बॉक्स बारी बारी से करने के लिए तो यह बिस्तर पर फ्लैट है वृत्त खींचें।
- 0.1 मिमी परत संकल्प, 50% भरने घनत्व, बेड़ा: मुद्रण सेटिंग्स समायोजित करें।
- एसडी कार्ड के लिए उपकरण सेव पथ का चयन करें। (प्रिंट समय ~ 12 ज।)
- में आयात ब्लेड धारकCura करने के लिए और इसे बारी बारी से इतनी स्लॉट पक्षों पर हैं और षट्भुज चेहरे XZ या yz विमान में है।
- वस्तु डुप्लिकेट।
- 0.2 मिमी परत संकल्प, 20% भरने घनत्व, किनारा: मुद्रण सेटिंग्स समायोजित करें।
- एसडी कार्ड के लिए उपकरण सेव पथ का चयन करें। (प्रिंट समय ~ 3 ज)
- मानव मस्तिष्क: Cura
- आयात Cura में मस्तिष्क स्लाइसर बॉक्स और 8.1.2 के रूप में बारी बारी से।
- .2 मिमी परत संकल्प, 30-35% भरने घनत्व, बेड़ा: मुद्रण सेटिंग्स समायोजित करें।
- एसडी कार्ड को बचाने के उपकरण पथ का चयन करें। (प्रिंट समय एकल गोलार्द्ध बॉक्स के लिए ~ 70 ज।)
- Ultimaker 2 पर
- गोंद छड़ी गोंद की एक पतली परत लागू प्लेट बनाने के लिए।
- एसडी कार्ड डालें। प्रिंट का चयन करें और भाग का चयन करें।
9. मस्तिष्क काटना
- एक प्रकार का बंदर मस्तिष्क
- तय मस्तिष्क, मस्तिष्क स्लाइसर, दो ब्लेड धारकों, microtome ब्लेड, fluorinated तेल के 1 मिलीलीटर, च के साथ एक कार्य केंद्र तैयारLat चिमटी, सुरक्षात्मक दस्ताने, और embedding कैसेट।
- नई microtome ब्लेड ब्लेड धारकों पर उतारने में रखें। सुनिश्चित करें कि प्रत्येक ब्लेड की beveled बढ़त एक ही दिशा में सामना करना पड़ रहा है। सुरक्षात्मक दस्ताने पहनें जब microtome ब्लेड से निपटने।
- formalin से मस्तिष्क निकालें और धीरे सूखी।
- मस्तिष्क स्लाइसर में रखें। fluorinated तेल की कुछ बूँदें आसान स्थिति के लिए अनुमति देने के लिए मस्तिष्क और स्लाइसर के लिए लागू किया जा सकता है। यकीन है कि मस्तिष्क जगह में मजबूती है सुनिश्चित करें।
- इसी ब्लेड स्लॉट में ब्लेड के साथ ब्लेड धारकों स्थिति।
- ब्लेड धारकों पर मजबूती से नीचे पुश और मस्तिष्क के माध्यम से कटौती करने के लिए धीमी गति से संतुलन दबाव लागू होते हैं।
- एक समय में एक पत्थर की पटिया, निकालें, मस्तिष्क के सामने से शुरू। यह स्लैब हटाने से पहले से ही एक स्लैब के सामने microtome ब्लेड को दूर करने में मदद करता है। प्रत्येक स्लैब के पूर्वकाल / पीछे की ओर रुख करने के लिए करीब ध्यान देना।
- पूर्वकाल एक की तस्वीरें ले लोप्रत्येक स्लैब के डी पीछे सतह। पीछे स्लैब सबसे अधिक संभावना अलग टुकड़े होते हैं, तो embedding के लिए टुकड़े के उन्मुखीकरण पर ध्यान देना होगा। प्रत्येक स्लैब एक embedding कैसेट में रखें और उन सब को एक 10% formalin समाधान में डाल दिया।
- मानव मस्तिष्क
- ध्यान से बॉक्स में मस्तिष्क के फिट का परीक्षण करें।
- स्लाइस मस्तिष्क एक angled कटौती का उपयोग कर एक छोर से शुरू, धीरे धीरे लेकिन मजबूती से टुकड़ा करने की क्रिया। प्रत्येक ब्लेड अंतराल के माध्यम से मस्तिष्क कट।
- एक समय में प्रत्येक स्लैब निकालें, संख्या और प्रत्येक स्लैब के पूर्वकाल / पीछे की ओर रुख करने के लिए करीब ध्यान दे।
- प्रत्येक स्लैब के पूर्वकाल और कूल्हों की सतह की तस्वीरें ले लो। सील 10% formalin बैग में स्लैब रखें। ऊतक ब्लॉक स्लैब से कटौती और embedding के लिए कैसेट में रखा जाएगा।
10 ब्रेन बॉक्स में हटाने overhangs (पूरक अनुभाग)
- स्लाइस बाहर खींच: Meshmixer
- Smoothed_Edit आयात करेंed_Brain_Model।
- संपादित करें का चयन करें, स्लाइस बनाओ। मेक स्लाइस में:
- चयन स्टैक्ड 3 डी, जेड, 1-2 मिमी मोटाई दर्ज करें। कंप्यूट क्लिक करें। जब स्लाइस लोड, स्वीकारें पर क्लिक करें।
- कोर्टेक्स के तल के पास बड़ी परिधि के साथ 1 या 2 स्लाइस का चयन करें। इन स्लाइस उप बॉक्स के स्तर से नीचे होना चाहिए।
- Brain_Slice_ # के रूप में इन स्लाइस की प्रत्येक निर्यात करें।
- स्लाइस overhangs को दूर तक विस्तार: Netfabb व्यावसायिक
- आयात Brain_Slice_ # स्लाइस।
- डुप्लिकेट प्रत्येक Brain_Slice_ # (अचयनित भागों की व्यवस्था करता है, तो जाँच)।
- सही प्रत्येक Brain_Slice_ # और चयन स्केल की एक प्रति पर क्लिक करें।
- अचयनित फिक्स्ड स्केलिंग अनुपात। तब वाई दिशा में मस्तिष्क टुकड़ा ऊपर पैमाने पर इतना है कि यह उप बॉक्स के नीचे के स्तर तक पहुंच जाएगा।
- नाम बदलें इन स्लाइस Brain_Slice_Big_ #।
- Y स्थिति ओ चेकएफ मूल Brain_Slice_ # हिस्से पर राइट क्लिक करें और का चयन करने के लिए कदम के द्वारा। मूल Brain_Slice_ # स्लाइस से प्रत्येक के लिए y स्थिति रिकॉर्ड।
- गणना करते हैं: Brain_Slice_ # [y स्थिति] - (Brain_Slice_Big_ # [Y आकार] - Brain_Slice _ # [Y आकार])
- के Brain_Slice_Big_ # प्रत्येक व्यक्तिगत रूप से का चयन करें, ठीक क्लिक करें और इस कदम का चयन करें।
- Y अनुवाद पैरामीटर बॉक्स में गणना की 10.2.6 से मान दर्ज करें। एक्स और जेड अनुवाद मापदंडों के लिए, वर्तमान स्थिति पैरामीटर बक्से में स्थित मान दर्ज। चयन निरपेक्ष अनुवाद। पर क्लिक करें अनुवाद और विंडो बंद करें।
नोट: Brain_Slice_Big_ # स्लाइस जब बॉक्स बनाने मस्तिष्क और ब्लेड के साथ साथ घटा दिए जाएंगे।
- Y अनुवाद पैरामीटर बॉक्स में गणना की 10.2.6 से मान दर्ज करें। एक्स और जेड अनुवाद मापदंडों के लिए, वर्तमान स्थिति पैरामीटर बक्से में स्थित मान दर्ज। चयन निरपेक्ष अनुवाद। पर क्लिक करें अनुवाद और विंडो बंद करें।
अतिरिक्त स्कैनिंग के लिए 11. एक प्रकार का बंदर मस्तिष्क एमआरआई पालना
- ब्रेन एमआरआई पालना बनाना
- सीआर का यकीन है कि शीर्ष सतह बनानेAdle Box_Cutout के रूप में एक ही ऊंचाई पर है। गहराई और पालने में मस्तिष्क की स्थिति सेटअप होना चाहिए बस के रूप में यह स्लाइसर के लिए है।
- शिफ्ट का चयन Smoothed_Edited_Brain_Model और पालना चयन करने के लिए।
- बूलियन आपरेशन का चयन करें। उजागर करने के लिए इसे लाल, तो बूलियन घटाव का चयन मस्तिष्क का चयन करें। फिर गणना लागू होते हैं। (इसके अलावा Brain_Slice_Big_ # स्लाइस यदि लागू चयन करें।)
- के रूप में स्लाइसर के लिए पहले से किया पालने समोच्च में किसी भी तेज अंक दूर करने के लिए मरम्मत मोड दर्ज करें। विस्तारित मरम्मत का चयन करें। मरम्मत लागू करें, और पुराने हिस्से को हटा दें।
- सही भाग एमआरआई मस्तिष्क पालना नाम बदलने के लिए क्लिक करें। , निर्यात का चयन करें एसटीएल।
- पालने मुद्रण: Cura
- Cura में एमआरआई मस्तिष्क पालना आयात और इसे बारी बारी से इतना है कि मस्तिष्क कटआउट के साथ फ्लैट हिस्सा सामना करना है।
- 0.1 मिमी परत संकल्प, 100% भरने घनत्व, बेड़ा: मुद्रण सेटिंग्स समायोजित करें। <ली> एसडी कार्ड को बचाने के उपकरण पथ का चयन करें। (प्रिंट समय ~ 10 ज)
- 8.3 में वर्णित के रूप में Ultimaker 2 पर मुद्रित।
- एक कागज तौलिया के साथ मस्तिष्क की सतह से धीरे सूखी formalin।
- के रूप में स्लाइसर के लिए वर्णित पालने में मस्तिष्क की स्थिति।
- मस्तिष्क और 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में पालने स्लाइड। fluorinated तेल के साथ सीमा से भरें।
- धीरे ट्यूब निचोड़ हवा के बुलबुले मस्तिष्क से बचने के लिए अनुमति देने के लिए। वहाँ के गठन से हवाई बुलबुले को रोकने के लिए ट्यूब की टोपी के इनसेट में कैप सम्मिलित करें। टोपी सुरक्षित, और तेल के साथ ट्यूब सील।
- ट्यूब कुंडली में जगह के रूप में पहले से वर्णन किया। 3 डी टी 2 * मापदंडों तालिका 1 में दिया जाता है।
- Mipav में 18 संरचनात्मक 100 माइक्रोन टी 2 * भारित अधिग्रहण खोलें और 10 वें अधिग्रहण करने के लिए रजिस्टर। पंजीकरण के मापदंडों 1.1.7 के रूप में ही कर रहे हैं। पंजीकृत छवियों औसत: केन्द्र शासित प्रदेशोंilities, छवि कैलकुलेटर थोक छवियों, औसत।
Representative Results
इस विधि के कार्यप्रवाह चित्रा 1 में संक्षेप बार मस्तिष्क कटा हुआ है, एमआर छवियों और स्लैब की ऊपरी सतहों के चित्रों के बीच एक दृश्य तुलना कई स्लैब भर में एक अच्छा उन्मुखीकरण मैच (चित्रा 2) से पता चलता है। बाद स्लैब पैराफिन में एम्बेडेड रहे हैं, वे एक microtome पर sectioned और दाग रहे हैं। उच्च संकल्प पोस्टमार्टम एमआरआई और दाग ऊतक विज्ञान वर्गों के बीच एक और अधिक पूरी तरह से तुलना दर्शाता एक प्रकार का बंदर मस्तिष्क के सभी संरचनाओं के पार एक सटीक और लगातार मैच (चित्रा 3)।
एमएस के इस पशु मॉडल में, जानवरों सफेद पदार्थ मस्तिष्क सफेद बात भर में फैले हुए घावों का विकास। इन घावों एमआरआई प्रदर्शन से noninvasively का पता लगाया जा सकता है। चित्रा 4 एमआरआई निष्कर्षों के रोग सब्सट्रेट स्पष्ट करने के लिए इस तकनीक की क्षमता को दर्शाता है। छोटे घावों में विवो एमआरआई पर पता चला सकते हैंदोनों पोस्टमार्टम एमआरआई और ऊतक विज्ञान पर नज़र रखी जा। जैसा कि insets में दिखाया गया है, घावों के भीतर माइलिन रहित मुख्य घटक एमआर संकेत परिवर्तन (आसपास के ऊतकों की तुलना में hyperintensity) ड्राइविंग में से एक है। ऊतक विज्ञान और पोस्टमार्टम एमआरआई भी इन विवो एमआरआई (चित्रा 4) पर याद किया घावों दिखा सकते हैं।
एक प्रकार का बंदर मस्तिष्क स्लाइसर बॉक्स बनाने के लिए चित्रा 1. कार्यप्रवाह। मस्तिष्क formalin (A1) और एक टी 2 भारित एमआरआई बढ़त प्रति 150 माइक्रोन (A2) की isotropic voxels के साथ अधिग्रहण कर लिया है के साथ तय हो गई है। छवियाँ संसाधित और एक द्विआधारी मुखौटा (ए 3) बनाने के लिए thresholded रहे हैं। सतह तो 3 डी मॉडलिंग सॉफ्टवेयर (ए 4) में गाया जाता है। एक स्लाइसर टेम्पलेट और मस्तिष्क मॉडल के बीच एक बूलियन घटाव मस्तिष्क स्लाइसर (B1) की एक डिजिटल मॉडल बनाता है। मस्तिष्क स्लाइसर बॉक्स एक 3 डी प्रिंटर (B2) पर छपा हुआ है। मस्तिष्क के लिए तो स्लाइसर बॉक्स में मजबूती से रखा गया हैकाटने (बी 3)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2. बाएं से दाएं: vivo एमआरआई, पोस्टमार्टम एमआरआई, और ऊतक स्लैब तस्वीर। टुकड़ा करने की क्रिया विमानों पोस्टमार्टम एमआरआई (बी) के आधार पर स्थापित किए गए थे और नेत्रहीन इसी इन विवो एमआरआई टुकड़ा (ए) की तुलना में। मस्तिष्क तो कट गया था, और जिसके परिणामस्वरूप स्लैब संगत (सी) पाए गए। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3. उच्च संकल्प पोस्टमार्टम एमआरआई और ऊतक विज्ञानखंड मिलान। स्लैब पैराफिन में एम्बेडेड थे, 4 माइक्रोन वर्गों में एक microtome साथ में कटौती, और तेजी से नीले और बैंगनी cresyl (बी) के साथ दाग। वर्गों तो नेत्रहीन 100 माइक्रोन टी 2 * भारित एमआरआई मस्तिष्क संरचना (ए) पर आधारित के साथ मिलान किया गया। इस छवि को प्राप्त करने के लिए विवरण प्रोटोकॉल और तालिका 1. मस्तिष्क संरचना का अनुपूरक अनुभाग में हैं: (1) लाल तीर = आंतरिक कैप्सूल, नीले तीर = पूर्वकाल संयोजिका; (2) लाल तीर = putamen, नीले तीर = ऑप्टिक पथ; (3) लाल तीर = पूंछवाला, नीले तीर = हिप्पोकैम्पस; (4) लाल तीर = महासंयोजिका, नीले तीर = मस्तिष्क जलसेतु; (5) लाल तीर = अवर colliculus, नीले तीर = पिरामिड पथ। बी 1 में धराशायी बॉक्स एक टुकड़ा जहां, या तो मस्तिष्क काटने या आयल embedding के दौरान एक त्रुटि वाई अक्ष के बारे में एक मामूली रोटेशन के कारण होता है, बाईं तरफ पूर्वकाल संयोजिका के बेमेल के लिए अग्रणी इंगित करता है। एक देखने के लिए यहाँ क्लिक करेंयह आंकड़ा का बड़ा संस्करण।
चित्रा 4. ऊतक विज्ञान अनुभाग के लिए इन विवो एमआरआई से घावों ट्रैकिंग। इन विवो एमआरआई असामान्य hyperintensity संकेत का कोई ठोस सबूत या तो ऑप्टिक पथ (A1) में घावों करने के लिए सुझाव दिखाया। हालांकि, उच्च संकल्प पोस्टमार्टम एमआरआई दोनों ऑप्टिक इलाकों (A2) में स्पष्ट अति तीव्र लाइनों से पता चलता है। तेजी से नीले / cresyl एक 4 माइक्रोन ऊतक विज्ञान खंड के बैंगनी दाग से पता चलता है कि hyperintense क्षेत्रों पूर्व vivo एमआरआई पर देखा demyelinated कर रहे हैं (ए 3)। मस्तिष्क सफेद बात में, इन विवो एमआरआई सूक्ष्म hyperintensity द्विपक्षीय (बी 1, insets में बढ़े हुए) से पता चलता। hyperintense क्षेत्रों उच्च संकल्प पोस्टमार्टम एमआरआई (B2) पर और अधिक स्पष्ट कर रहे हैं। एक 4 माइक्रोन ऊतक विज्ञान खंड के LFB दाग से पता चलता है कि इन क्षेत्रों (बी 3) demyelinated रहे हैं। आधारभूत मैं के साथ तुलना करने के बादn विवो एमआरआई और एक hemotoxylin और eosin दाग, दाईं ओर एक संरचनात्मक विषमता नहीं, एक demyelinated घाव होने के लिए निर्धारित किया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
पूरक कोड फ़ाइलों। Brain_Slicer_Parts_Marmoset.stl: इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें। Brain_Slicer_Parts_Human.stl: इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें। Cap_Insert.stl: इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
Discussion
प्रोटोकॉल यहाँ उल्लिखित एमआरआई और ऊतक विज्ञान वर्गों के बीच एक सटीक तुलना में सक्षम बनाता है। प्रोटोकॉल के लिए एक एकीकृत स्वरूप है कि इस तरह के marmosets या कृन्तकों के रूप में मनुष्य या छोटे जानवरों के दिमाग के लिए लागू किया जा सकता है में प्रस्तुत किया है। बड़े (मानव) के लिए विशिष्ट और छोटे (nonhuman रहनुमा और कृंतक) दिमाग डाला जाता है, और साथ वीडियो और आंकड़ों में अंतर हम एक प्रकार का बंदर में आवेदन प्रदर्शित करता है। हालांकि दृष्टिकोण स्पष्ट है, विधि कई कदम के साथ ही सॉफ्टवेयर के कई प्रकार के उपयोग की आवश्यकता है। इसके अलावा, कई मुद्दों संभवतः इस विधि की सटीकता को प्रभावित करने का उल्लेख करने के लिए महत्वपूर्ण हैं।
इन विवो एमआरआई की छवि गुणवत्ता एक महत्वपूर्ण कारक है। एमआरआई और digitalized ऊतक विज्ञान छवियों के बीच छवि संकल्प में असमानता को कम करने के लिए, छोटी संभव एमआरआई voxel आकार इस्तेमाल किया जाना चाहिए। इस अवधारणा को भी पोस्टमार्टम के एमआरआई की छवि गुणवत्ता के लिए लागू होता है। जबकि वृद्धिपोस्टमार्टम एमआरआई में अधिग्रहण के समय में बहुत अधिक छवि संकल्प तैयारी ऐसी हवा के बुलबुले से संबंधित फोकल संकेत छोड़ने वाले बच्चों के रूप में छवि कलाकृतियों को पेश कर सकते हैं अनुमति देता है। इन कलाकृतियों ऊतक के क्षेत्रों अस्पष्ट कर सकते हैं और साथ ही अपनी समोच्च प्रभावित करते हैं। इसके अलावा, पोस्टमार्टम एमआरआई पर ऊतक के आयामों के निर्धारण की प्रक्रिया और अवधि से प्रभावित होने की संभावना है। जबकि पूर्व vivo एमआरआई मैच के लिए इन विवो बारीकी अधिग्रहण के दौरान टुकड़ा ज्यामिति सेटअप में संरचनात्मक स्थलों के उपयोग के द्वारा अनुमानित किया जा सकता है, एक गैर रेखीय पंजीकरण अभी भी उन दो एमआरआई छवियों से मेल खाते में सटीकता की एक उच्च डिग्री तक पहुंचने के लिए आवश्यक होगा।
मस्तिष्क धारक और स्लाइसर की डिजाइन भी एक महत्वपूर्ण कदम है। मस्तिष्क के डिजिटल मॉडल बनाने में, एक समरेखण एल्गोरिथ्म लागू किया जाता है कि थोड़ा मायनों में इजाफा तय मस्तिष्क के लिए मॉडल रिश्तेदार। यह अपनी धारक और स्लाइसर में मस्तिष्क की आसान प्रविष्टि सक्षम बनाता है और धारक में तेज किनारों को कम करता है और# 39; s समोच्च। हालांकि, अगर मॉडल बहुत बड़ा है (उदाहरण के लिए, 5% से अधिक) के द्वारा, मस्तिष्क पोस्टमार्टम एमआरआई और / या सेक्शनिंग दौरान कदम हो सकता है। एक अन्य महत्वपूर्ण बिंदु मस्तिष्क मॉडल के डिजाइन अनुकूलित करने के लिए इतना है कि सेरिबैलम ठीक से 3 डी मुद्रित वस्तु के अंदर रखा गया है। यह विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण हो सकता है जब सेरिबैलम शव परीक्षा में मस्तिष्क निकासी के दौरान क्षतिग्रस्त हो गया है।
मस्तिष्क स्लाइसर और धारक जब मुद्रण, 3 डी प्रिंटर के प्रकार भी ध्यान से चुना जाना चाहिए। कुछ मल्टी-जेट प्रिंटर समर्थन सामग्री को हटाने के लिए एक ओवन का उपयोग कर बाद के प्रसंस्करण की आवश्यकता होती है। इन प्रिंटर वस्तुओं है कि निर्विवाद और डेस्कटॉप इनकार बयान मॉडलिंग (FDM) प्रिंटर की तुलना में अपेक्षाकृत अधिक टिकाऊ होते हैं उत्पादन कर सकते हैं, वहीं गर्म करने की प्रक्रिया का समर्थन करता है को दूर करने के लिए थोड़ा बॉक्स ताना कर सकते हैं, ब्लेड अंतराल है कि पूरी तरह से मस्तिष्क समोच्च को सीधा नहीं कर रहे हैं बनाने।
मस्तिष्क सेक्शनिंग प्रक्रिया में एक और महत्वपूर्ण कदम है। वें काटने से पहलेई स्लैब में पूरे दिमाग, यह सुनिश्चित करें कि मस्तिष्क मस्तिष्क स्लाइसर अंदर कसकर बैठा है बनाने के लिए महत्वपूर्ण है: कोई प्रस्ताव जब थोड़ा दबाव मस्तिष्क पर लागू किया जाता है वहाँ होना चाहिए। यह संभव ब्लेड जांचकर्ताओं द्वारा निर्धारित सटीक स्थान पर मस्तिष्क के माध्यम से कटौती करने के लिए कर देगा। जब काटने के लिए एक सतत, संतुलित दबाव दोनों ब्लेड धारकों के लिए लागू किया जाना चाहिए। ब्लेड की कुशाग्रता और ऊतकों की कठोरता के आधार पर, एक मामूली अनुप्रस्थ काटने गति फ्लैट में कटौती सतहों को बनाए रखने के लिए फायदेमंद हो सकता है।
आयल embedding प्रक्रिया भी एमआरआई और ऊतक विज्ञान के बीच misalignment का एक स्रोत हो सकता है। ऊतक स्लैब एम्बेडिंग प्रक्रिया के दौरान कैसेट के खिलाफ फ्लैट बैठा नहीं है, तो वहाँ microtome के काटने के विमान और स्लैब की सतह जगह के बीच एक झुकाव होगा। यह व्यर्थ वर्गों को काटने एक फ्लैट विमान, जिसमें सभी ऊतक सामने आ रहा है पता लगाने के लिए की आवश्यकता होगी। एक तरीका यह झुकाव के लिए सही करने के लिएउच्च isotropic संकल्प पोस्टमार्टम एमआरआई पर देखने विमान के कोण बदलने की है। हालांकि, इस विवो एमआरआई कि आम तौर पर anisotropic संकल्प (आम तौर पर मोटी राज्याभिषेक स्लाइस) के साथ अधिग्रहण कर लिया है पर प्रदर्शन करने के लिए लगभग असंभव है।
अंत में, ऊतक, साथ ही स्लाइड (तह, खुर, झुर्रियाँ) की तैयारी के दौरान formalin निर्धारण अवधि और आयल एम्बेडिंग (संकोचन) के दौरान कुछ विरूपण अनुभव कर सकते हैं। इन विकृतियों के कुछ स्लाइड पर स्थानांतरित करने से पहले एक नहाने के पानी में 4-5 माइक्रोन वर्गों डालने से सुधारा जा सकता है। अन्य विकृतियों को आंशिक रूप से पोस्टमार्टम एमआरआई छवियों ऊतकीय डिजीटल छवियों के विरूप्य की छवि coregistration प्रदर्शन से हल किया जा सकता है। फिर भी, सावधान और कुशल अभ्यास के साथ विकृतियों को कम मात्रा में एमआरआई मिलान वर्गों ऊतक विज्ञान के लिए सबसे प्रभावी तरीका है।
अंत में, कार्यप्रणाली यहां पेश चालान में सक्षम बनाता हैestigators सही एमआरआई निष्कर्षों के अंतर्निहित विकृति का आकलन करने के लिए। आम तौर पर, यह पहचान करने और / या अनुसंधान अध्ययनों कि इस तरह की सूजन या remyelination के रूप में विशिष्ट रोग प्रक्रियाओं, लक्ष्य के लिए उपन्यास एमआरआई बायोमार्कर मान्य करने के लिए एक आशाजनक दृष्टिकोण है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7T/30cm USR AVIII Bruker MRI | Bruker Biospin | ||
| 38 mm Bruker Biospin volume coil | Bruker Biospin | ||
| Fomblin | Solvay Solexis | ||
| 50 ml Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile | Corning | 21008-951 | |
| Fisherbrand Gauze Sponges | Fisher Scientrific | 13-761-52 | |
| Parafilm M All-Purpose Laboratory Film | Bemis | ||
| Leica RM2235 rotary microtome | Leica | ||
| Leica Disposable Blades, low profile (819) | Leica | ||
| Cresyl Violet Acetate, 0.1% Aqueous | Electron Microscopy Sciences | 26089-01 | |
| Luxol Fast Blue, 0.1% in 95% Alcohol | Electron Microscopy Sciences | 26056-15 | |
| ETOH | |||
| Ultimaker 2 Extended | Ultimaker | ||
| .75 kg Official Ultimaker Branded PLA Filament, 2.85 mm, Silver Metallic | Ultimaker | ||
| Axio Observer.Z1 | Zeiss | ||
| Zen 2 (Blue Edition) | Zeiss | ||
| Netfabb Professional 5.0.1 | Netfabb | http://www.netfabb.com/professional.php | |
| Meshmixer 10.9.332 | Autodesk | http://www.meshmixer.com/download.html | |
| Mipav 7.2 | NIH CIT | http://mipav.cit.nih.edu | |
| Cura | Ultimaker | https://ultimaker.com/en/products/cura-software |
References
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