Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Analyse av koronarkar i Slettet embryonale Hearts

doi: 10.3791/54800 Published: December 7, 2016

Summary

Vi presenterer en protokoll for analyse av koronarkar i hele embryoniske muse-hjerter opp til E15.5, ved hjelp av standard immunologiske farvemetoder etterfulgt av optisk klaring og konfokal mikroskopi. Denne teknikken gjør det mulig for visualisering av blodårene i hele hjertet uten behov for tidkrevende analyse av seriesnitt.

Introduction

Etablering av et fungerende koronar nettverk er avgjørende for hjertefunksjon og embryoutvikling og analyse av genetiske mus mutanter kan gi verdifull innsikt i de molekylære signaler bak denne utviklingsprosess. Evnen til å visualisere de embryoniske koronar plexus som en helhet, heller enn angitt i en serie av histologiske snitt, er vesentlig for å lette analysen av fartøyet mønster i genetiske mutanter, og unngår det potensielle tap av informasjon som kan oppstå som et resultat av mekanisk kutting av vevet. Fartøy skjebnebestemt til å danne arterier og kapillærer er lokalisert dypt innenfor veggene i begge ventriklene og aorta 1-3. Men mens fluorescerende merking av celler kombinert med laser-scanning konfokalmikroskopi kan gi høyoppløselige bilder av wholemount-merket overfladiske vene / lymfekar 4,5, er dybden av bildebehandling begrenset av optisk penetrasjon. Høyoppløselig avbildning av capillaries og arterier gjennom hele dybden av hjertet er derfor ikke mulig uten noen form for vev clearing.

Dårlig optisk gjennomtrengning er forårsaket av den høye brytningsindeksen for den multiple cellulære og ekstracellulære (f.eks kollagen- og elastiske fibrer) komponenter av tykk vev. Dette sprer bilde lys, forårsaker uskarphet og redusert kontrast. Oppgjørs midler vanligvis samsvare med høy brytningsindeks på slike vev, noe som betyr at lys kan reise gjennom prøven uhindret og trenge dypere inn i vevet. Før rensing, vev er vanligvis dehydrert som vann har en forholdsvis lav brytningsindeks. En mengde nye clearing metoder har nylig blitt utviklet, men avhengig av teknikken som brukes, kan det clearing prosessen ta dager eller uker, og kan kreve kostbare reagenser 6-9. BABB (en 1: 2 blanding av benzylalkohol og benzylbenzoat) er en billig, som vanligvis brukes clearingmiddel, som har denFordelen med å rydde prøvene svært raskt. BABB basert avregning og avbildningsteknikker har blitt beskrevet tidligere for nevrologiske prøver og ulike organer 10-13. Her beskriver vi en robust og enkel teknikk for BABB clearance av immunostained prøver etterfulgt av konfokal mikroskopi, med spesiell henvisning til undersøkelse av blodårer i murine hjerter fra E (embryonale dag) 11,5 til 15,5. Imidlertid, slik det også er vist, teknikken kan like godt anvendes for analyse av hele embryoer, så vel som andre celletyper, så lenge høy kvalitet antistoffer mot markører av interesse er tilgjengelig.

Protocol

Alle dyreforsøk ble utført i henhold til institusjonelle retningslinjer på lisens fra det britiske Home Office.

1. Disseksjon og fiksering av embryonale Hearts

  1. Avlive en tidsbestemt-gravid musen på ønsket dag ved hjelp av en etisk godkjent avhorning teknikk, for eksempel CO 2 narkose etterfulgt av cervical forvridning, og fjern de embryonale sacs 14, plassere dem i en 10 cm petriskål fylt med fosfat saltvann (PBS) .
  2. Ved hjelp av en dissekere mikroskop og pinsett, forsiktig åpne opp livmor sekker og fjerne hvert embryo, kutte navlestrengen og fjerne plommesekken.
  3. For genotyping formål, fjerne den embryonale halen og plasser i en 1,5 ml mikro rør for lysering / DNA-ekstraksjon senere.
  4. For å fjerne hjertet, pin hvert embryo ut på ryggen i en PBS-fylt silikon elastomer-belagte 35 mm petriskål, ved hjelp av rustfritt stål minutien nålene. Bruke fin pinsett, carefully åpne brystet og bryte de store fartøyene, anterior til hjertet. nå da bak hjertet med pinsett, ta tak fartøyene bak hjertet og dra forsiktig for å fjerne hjertet; lungene kan også komme bort samtidig.
  5. Overfør hjerte til en frisk 35 mm petriskål inneholdende PBS og bruke fine tang for å trimme bort lungevev, om nødvendig. Deretter overføre hjerte til en brønn i en 48-brønners plate som er fylt med kald PBS.
  6. Etter å samle alle hjerter i 48-brønns plate, aspirer PBS med en tynn plast Pasteur pipette og erstatte med 0,5 ml 4% paraformaldehyde (PFA).
    FORSIKTIG: PFA er en kjent for å være allergifremkallende, kreftfremkallende, og giftig.
    1. Fix E11.5 - 12.5 hjerter for 15 min, E13.5 hjerter for 20 min og E14.5 - 15.5 hjerter for 30 min, i 4% PFA ved romtemperatur.
  7. Aspirer PFA med en tynn plast Pasteur pipette og skyll hjertene 2x i kaldt PBS.
    CAUTION: PFA er farlig og må kastes i henhold til institusjonelle bestemmelser.
  8. Hvis du ikke bruker umiddelbart for hele mount farging (se punkt 2), tørke hjerter ved å gjennomføre påfølgende 5 min vasker i følgende løsninger: 25% metanol / 75% PBS, 50% metanol / 50% PBS, 75% metanol / 25 % PBS.
    FORSIKTIG: Metanol er giftig, bruk hansker. Oppbevar hjertene ved -20 ° C i 100% metanol.

2. Hele Mount Farging av embryonale Hjerter med Anti-PECAM1 antistoff

MERK: Anti-PECAM1 antistoffer fungere godt for farging koronar fartøy (se trinn 2.4), men noen pan-endothelial markør som gir en robust signal ville være passende.

  1. Ved bruk av hjerter som har vært lagret i 100% metanol, overføres til 1,5 ml mikrosentrifugerør og rehydrere ved å utføre suksessive 5 min vaskinger i de følgende oppløsninger: 75% metanol / 25% PBS, 50% metanol / 50% PBS og 25% metanol / 75% PBS. Permeabilize hjertene ved å utføre 3 x 10 min vaskinger i 0,5 til 1,0 ml PBST (PBS / 0,1% Tween-20), som roterer ved romtemperatur.
  2. Blokkere hjertene ved dreining i 1 time ved romtemperatur i 1,0 ml 10% geiteserum i PBST.
  3. Fjern blokkering buffer med en tynn plast Pasteur pipette eller 1000 mL pipette tips og erstatte med 400 - 500 mL frisk blokk som inneholder anti-PECAM1 primært antistoff fortynnet 1:50. Roter rørene over natten ved 4 ° C.
  4. Den neste dag, Aspirer blokk / primære antistoff med en tynn plast Pasteur pipette eller 1000 ul pipettespiss og å utføre minst 6 x 1 time vaskinger i 1,0 ml PBST, roterende rør ved romtemperatur.
  5. Erstatte den siste vaskingen med frisk blokkeringsbuffer inneholdende det fluorofor-konjugert sekundært antistoff fortynnet 1: 500, og inkuber over natten ved 4 ° C med rotasjon. Beskytt mot lys ved å pakke rørene i folie.
  6. Dagen etter, aspirer blokk / sekgående antistoff med en tynn plast Pasteur-pipette og å utføre minst 6 x 1 time vaskinger i 1,0 ml PBST, roterende rør ved romtemperatur.
  7. Oppbevar hjertene ved 4 ° C (beskyttet fra lys) inntil nødvendig.

3. Utarbeidelse av Fjerne Solutions og Mikros Retter

MERK: Når bildebehandling hjerter i Babb er det viktig at ingen av BABB løsningen kommer i kontakt med komponentene i mikroskop. For dette formålet følgende protokollen inneholder instruksjoner for å forberede silikon-forseglet retter egnet for fluorescens mikroskopi, som kan tilberedes i god tid. Den silikon gir en barriere å inneholde BABB og hindre den fra potensielt siver mellom glassbunn og polykarbonat sidene av parabolen.

  1. For å forberede silikon-belagt retter, ta optiske glassbunn kultur retter og plassere en cap fra en 4 ml skrukork hetteglass (ca. 1,5 cm i diameter) I midten av hver tallerken.
    MERK: Dette vil danne en brønn for prøven når elastomeren anvendes på fatet.
  2. Fyll retter med silikon til en dybde på omtrent 0,5 cm, ved bruk av en applikator patron for å blande de to komponentene som de er brukt i henhold til produsentens instruksjoner. La herde i minst 24 timer, noe som gjør at korken er fortsatt i midten av hver tallerken.
    MERK: Bruk vernebriller for å unngå utilsiktet kontakt av silikon elastomer med øynene.
  3. Etter herding av elastomer, fjerne korken fra hver tallerken, Dette vil legge igjen en sentral godt hvor prøven som skal avbildes kan plasseres i direkte kontakt med glasset bunnen av fatet.
    MERK: Når herdet elastomer skal være fast og tørr å ta på.
  4. Klargjør BABB løsning (en del benzylalkohol til 2 deler benzylbenzoat). Dette bør være lagret i en glassflaske og beskyttet mot lys.
    FORSIKTIG: BABB er en toksisk, korrosiv oppløsning. Må behandles i et avtrekksskap mens bruk passende verneutstyr.
  5. Mix BABB og metanol for å lage en 50:50 løsning (1 - 5 ml) i et hetteglass. Beskytt mot lys, for eksempel ved å pakke flasken i folie.

4. Dehydrering, Clearing og montering av Hearts for konfokalmikroskopi

MERK: Større prøvene kan være ryddet i 4 ml hetteglass, men for små prøver (f.eks hjerter opp til E13.5) det er bedre å utføre clearing prosessen direkte i mikros fatet. Dette bidrar til å hindre "miste" prøvene som hjerter blir veldig gjennomsiktig når fjernet. For disse små prøver clearing er veldig rask, forekommer i løpet av få minutter.
MERK: Beskytt prøvene fra lys under alle følgende trinnene ved å pakke / dekker rør og retter med folie.

  1. Før rydde, tørke De immun-hjerter gjennom en metanol-serien ved å rotere hjertene på rommet temperatur i et 1,5 ml mikrosentrifugerør i suksessive endringer av de følgende oppløsninger: 25% metanol / 75% PBS, 50% metanol / 50% PBS og 75% metanol / 25% PBS (5 min hver). Til slutt, roter i 3 x 5 min i 100% metanol.
  2. For hjerter opptil E13.5, sted i sentrum av mikros rett; under mikroskopet at hjertet er orientert med sin dorsale side øverst. Fjern eventuelle metanol fra rundt hjertet med en tynn plast Pasteur pipette.
  3. Ved hjelp av en ren fin-tipped plast Pasteur pipette, tilsett BABB: metanol 50:50 løsning i et tilstrekkelig volum til å fordype hjertet (ca. 300-400 mL). Som hjertene kan noen ganger snu i løsningen, sjekke retningen på nytt mens hjertene er fortsatt ugjennomsiktig. La i løsningen i 5 min.
  4. Fjern 50:50 løsning på et glass avfallsflasken i avtrekksskap og erstatte med BABB, igjen med en fin-tipped plast Pasteur pipette.
    MERK: Et stort volum er ikke nødvendig, legge sufficient slik at hjertet sitter i en dråpe av oppløsningen. Hjertet skal klare innen 5 min.
  5. For større hjerter, fjerner prøvene i glassflasker.
    MERK: En E15.5 hjerte bør klare innen 30 min-1 time, men kan stå over natten om nødvendig.
  6. Etter at prøven er klar, fjerne løsningen og erstatte med et minimalt volum av BABB. Eventuelt kan dekke prøven med et dekkglass, for å bidra til å holde den på plass, men dette er ikke absolutt nødvendig. Bruk hjertet for bildebehandling.

5. diagnostikk klarert Hearts av konfokalmikroskopi

MERK: Bilder ble tatt til fange på en invertert konfokalmikroskop hjelp 10X eller 20X tørre målsettinger. Selv om det er mulig å anvende retter på en oppreist konfokalt, må ekstra forsiktighet utvises for å unngå kontakt av mål med den BABB løsning.

  1. Samle en z-scan av hjertet 15. Avhengig av størrelsen av hjertet, kan en flis skanning være nødvendig for å avbilde hele hjertet 16.
    FORSIKTIG: BABB er en etsende løsning, slitasje rene hansker og sikre utsiden av mikros parabolen er fri fra BABB. Håndter fatet forsiktig og holde lokket på fatet for å minimere risikoen for utilsiktet søl på mikroskopet.
  2. Hvis målet arbeidsavstanden tillater det, bruke en høyere forstørrelse for å oppnå høyere oppløsning bilder av områder av interesse.

6. Data Analysis Bruke Fiji programvare

  1. Åpne z bunke bilder i Fiji 17.
  2. For å gjøre az projeksjon av hele bunken eller deler av den, klikk på bildet og velg Stack, etterfulgt av Z-prosjektet. Angi Start- og Stopp-slice tall, og velg typen z projeksjon, f.eks, middels intensitet, maks intensitet.
  3. For å fremheve enkelte fartøy innenfor en bunke med bilde skiver bruker Blow verktøyet (fra Plugins menyen velger Segmentering, og deretter blåse / lassoverktøyet), og klikk på de områdene av bildet som skal fylles i each skive. Bruk Fill-kommandoen (klikk på Rediger, velg Fill) for å fylle de utvalgte områder med forgrunnsfargen valg (klikk på Rediger, og velg deretter Alternativer, etterfulgt av farger og forgrunn).
  4. Z prosjekt bildet stable som før.

7. 3D Surface Volumgjengivelse av koronararteriene generert ved hjelp Imaris

  1. Klikk på overgå utsikten ikonet øverst på skjermen, og dra og slippe bildefilen inn i datavinduet. Klikk på 3D-View-ikonet øverst på skjermen.
  2. Velg ikonet overflater (blått ikon) og klikk deretter på kategorien Opprett. Klikk på "Hopp automatisk oppretting, redigere manuelt" i dialogboksen, og klikk på Draw-ikonet (tynne blyantikonet).
  3. Velg kategorien Contour, og deretter kategorien Mode. I modus, klikk på tryllestav eller isoline ikoner. Velg pekeren modus i Pointer valg på høyre side av skjermen ved å klikke ved siden av "Velg", og klikk deretter på 'Tegn9; boksen (i nedre venstre hjørne av skjermen).
  4. Bruk isoline eller tryllestav verktøyet for å velge konturene av arteriene i påfølgende skiver. Naviger fra skive til skive med Slice posisjonsknappen.
  5. Når alle konturer er valgt, klikker du på Opprett Surface boksen. De omkringliggende volum kan gjøres usynlig, eller gjort mer eller mindre dekkende å bruke blandemodus; Klikk på Volum for å markere den, og velg deretter kategorien Innstillinger, etterfulgt av flippen Modus. Velg Blend og bruke glidebryteren for å endre tettheten.
  6. Ta bilder ved hjelp av Snapshot-funksjonen.

Representative Results

Som hjertet utvikler seg, er det ventrikulære myokard invadert av endotelceller (ECS) fra ulike kilder, og en vaskulær plexus er dannet. Fartøy som utvikler seg innen den ventrikulære hjertemuskelen vil gå på å danne kapillære og arterielle nettverk leverer oksygenrikt blod til hjertet vev 18. På samme tid (rundt E11.5) den koronare stilkene begynne å utvikle seg uavhengig av hverandre fra et separat kapillært nettverk (kjent som peritruncal plexus) som omgir hulrommet av aorta 14,19,20. Peritruncal plexus ECS i utgangspunktet danner flere forbindelser med lumen av aorta på nivå med ventil bihulene, imidlertid til syvende og sist bare ett skip vil vedvare på hver side av aorta, som skjer for å danne røttene av de venstre og høyre koronar-arteriene 21. Fra rundt E13.5 den peritruncal og ventrikulære hjerteinfarkt fartøy bli med opp for å danne en sammenhengende nettverk, slik at blodstrømmen fra enOrta i kransårene 14,22. Farging av ECS med anti-PECAM-1-antistoff, kombinert med BABB klaring av de intakte hjerter, tillater analyse av den utviklings koronare nettverk fra de tidligste mulige stadier. På senere utviklingsstadier mønstringen av modning koronararteriene kan også bli undersøkt. Denne metoden kan også bli anvendt for å flekke vaskulaturen av hele embryoer (opp til E11.5 minst), og med forskjellige antistoffer, for eksempel, anti-alfa-glattmuskel aktin (Sm22α) og Endomucin.

Figur 1 viser maksimal intensitet z-projeksjoner av en E11.5 hjerte generert ved hjelp av Fiji programvare. Den Tile funksjonen ble brukt til å samle flere partielle bilder av hjertet og sy dem sammen til et komplett bilde; Dette er nyttig for å gi en oversikt over flekker i hele prøven. På dette stadiet PECAM1 antistoff flekker hovedsakelig endokardial slimhinnen i hjertet og utstrømningen vessels, men noen få ECS kan også observeres i det venstre ventrikulære veggen (eske region i figur 1A, som er vist forstørret i 1A "). I tillegg kan peritruncal plexus observeres tydelig i veggen av utløpskanalen (OT) (pakket region i figur 1B). I det sistnevnte tilfelle, å redusere antallet av skiver i z-stabelen som brukes til å generere fremspring forbedret klarhet i bildet, slik at forbindelser med den lumen av aorta for å bli visualisert mer utpreget (figur 1B). I figur 2, kan den økte vaskulatur proksimalt til aorta holdes i en E12.5 hjerte. Figur 3 viser peritruncal plexus i en E12.5 hjerte. Den 12-skive z projeksjon på figur 3A viser hele plexus, men som noen fartøyer er lokalisert ventralt til lumen av aorta (som også er sterkt farget med anti-PECAM1 antistoff), splitting av z-stack inFor en rekke under stabler (figur 3B-D) gir mer visuell informasjon. For eksempel, sub-stack anslått i Figur 3B viser et peritruncal fartøy kobler til den ventrale overflaten av aorta lumen, som ikke er synlig i det hele projeksjon. Figur 4 viser en del av en E15.5 hjerte; koronararteriene er godt synlig på dette stadiet (figur 4A, 30-bit projeksjon). I de fem-slice z anslagene vist i figur 4B og C aorta og pulmonalklaff kan også visualiseres ved PECAM1 flekker; grenene og forbindelsene av koronar kapillær nettverk er også tydeligere i disse mindre sub-stack anslag. Manuell segmentering teknikker har blitt brukt til å markere koronararteriene ved hjelp av Fiji (figur 4D) eller Imaris (figur 4D og E). 3D-overflaten volumgjengivelse av koronararteriene / aorta lumen generert uSing Imaris kan vises med eller uten den omkringliggende blodkar (Figur 4E og F).

Blodkar av hele embryo kan også bli undersøkt ved hjelp PECAM1 farging / BABB klaring. 4A og A ', viser z anslag generert fra under stabler fra høyre side (z skiver 11 - 65) og venstre side (z skiver 66-110) av embryo hhv. Sammenligning av de to bildene viser at intensiteten av fluorescenssignalet ikke signifikant reduseres med dypere penetrering inn i vevet. I figur 4B, PECAM1 (rødt signal) og Endomucin (grønt signal) antistoffer ble kombinert for å merke intersomitic arteriene (isas) og årer henholdsvis, av en E11.5 embryo. Figur 4C viser SM22α (rød signal) og PECAM1 farging (grønt signal) av ISA i en E11.5 embryo. I figur 6, E11.5 embryoerfarget med PECAM 1 ble avbildes umiddelbart etter BABB klaring (figur 4A) eller etter et intervall på omtrent to måneder (figur 4B). Det fluorescerende signalet var likevel sterk nok til å bilde på riktig måte etter forlenget lagring av prøven i Babb.

Figur 1
Figur 1. Farging av en E11.5 Hjerte med Anti-PECAM1 Antistoff (Detected med Anti-rotte IgG konjugert til Alexa 594). (A, B) et 2 x 2 lagte bilde ble oppsamlet ved hjelp av 10X objektiv av en omvendt konfokalmikroskop. PECAM1 antistoff flekker både endokardiale og vaskulær ECS. Anslag (maks intensitet) ble samlet inn 22 (A) eller 5 (B) z skiver hver av 4 mikrometer tykkelse, ved hjelp av Fiji programvare. A 'og B' er enlargements av eske områder i henholdsvis A og B. Pilene i A 'indikere blodårene i ventrikkel veggen; i B ', indikerer braketten den peritruncal plexus. OT, utløpskanalen; LV, venstre ventrikkel, RV høyre ventrikkel. Alle bilder er direkte utsikt. Skala barer i A og B = 200 mikrometer; skala barer i A 'og B' = 100 mikrometer. Panel 1B 'ble tilpasset fra Ivins et al., 2015 19. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Farging av en E12.5 Hjerte med Anti-PECAM1 antistoff. Panel A viser az projeksjon (maks intensitet) av en 2x2 flislagt scan. Eske region i A vises enlarged i A '; Pilene angir flere blodkar proksimalt til aorta (Ao). LV, venstre ventrikkel, RV høyre ventrikkel. Alle bilder er direkte utsikt. Scale bar i A = 200 mikrometer; skala bar i A '= 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Imaging av Peritruncal Plexus i en E12.5 Heart. Confocal bilder av en E12.5 aorta (Ao) farget med anti-PECAM1 antistoff ble samlet inn ved hjelp av 10X objektiv. Z projeksjon (maks intensitet) i A ble generert fra 12 z skiver (4 mikrometer tykkelse); Pilene viser peritruncal plexus fartøy. BD 12 z stykker ble delt i tre under stabler som angitt og anvendt for å danne separate projections; pilspisser angir forbindelser som dannes ved peritruncal plexus til lumen av aorta. Peritruncal fartøy lokalisert ventralt til lumen av aorta er synlige i B og C. Alle bilder er direkte utsikt. Scale bar = 50 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. koronararteriene og Capillary Plexus i en E15.5 Heart. Confocal bilder av en E15.5 hjerte farget med anti-PECAM1 antistoff ble samlet inn ved hjelp av 10X objektiv. Panel A viser en maksimal intensitet z projeksjon generert fra 30 z skiver (4 mikrometer tykkelse); Pilene viser venstre og høyre koronararteriene (LCA og RCA) som kan sees koble til aorta (Ao). Bruke different 5 z skive sub-stabler aorta og lungeventilene (AOV og PV) kan sees i B og C henholdsvis (blå parentes). Den ventrikkel kapillær plexus er også tydeligere i disse mindre sub-stack anslag; blodkar proksimale til lunge ventilen (liten boks) er vist forstørret i høyre panel C (stor boks). Fiji ble brukt til å markere enkelte blodkar, for eksempel, for panel D Blow / lasso verktøyet ble brukt til å fylle koronararteriene med rød farge manuelt i hvert z skive før projeksjon. Imaris programmet ble brukt til å lage 3D-bilder av arteriene (rød) og aorta lumen (grønn) i E og F; igjen dette ble gjort manuelt, ved hjelp av tryllestav verktøyet for å lage objekt konturer i hvert z skive. Tettheten av omkringliggende volum kan endres i Blend mode, som i E. Alternativt kan 3D-bildet bli trukket ut, slik som vist i f- ventrikkel. Alle bilder er direkte utsikt. Scale bar i A = 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. Imaging av Embryonic blodkar. Paneler A og A 'viser confocal bilder av en E10.5 villtype embryo farget med anti-PECAM1 antistoff, samlet med 10X objektiv (flislagt scan). Gjennomsnittlig intensitet z anslagene ble samlet z skiver 11-65 (A) og 66-110 (A ') av en 120 z skive scan (4 mikrometer tykke skiver), viser bare et lite tap av fluorescens intensitet over tykkelsen av embryo . Panel B viser intersomitic fartøy av en E11.5 embryo farget med antibod kaper mot PECAM1 (rødt signal fra 594-konjugert sekundært antistoff) og Endomucin (EMCN, grønt signal fra 488-konjugert sekundært antistoff), som flekker på intersomitic arterier (pil) og vener (pilspiss) henholdsvis (middels intensitet z projeksjon fra en flislagt skanning). Panel C viser intersomitic arterier (isas) fra en E11.5 villtype embryo farget med antistoffer mot PECAM1 (grønt signal fra 488-konjugert sekundært antistoff) og SM22α (rødt signal fra 594-konjugert sekundært antistoff). Confocal bilder ble samlet inn ved hjelp av 20X tørr objektiv og brukes til å generere maksimal intensitet z anslag. Alle bilder er sagittale visninger. Skala barer i A og B = 250 nm, skala bar i C = 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

d / 54800 / 54800fig6.jpg "/>
Figur 6. immunostained Prøver Slettet i Babb Beholde fluorescerende signal i minst to måneder. E11.5 embryoer ble farget med PECAM1 antistoff og klarert med BABB; embryoer fra samme batch ble avbildes umiddelbart eller etter et intervall på to måneder. Panel A viser intersomitic arteriene i embryo fotografert umiddelbart og panel B viser embryo avbildes to måneder senere. Confocal bilder ble samlet inn ved hjelp av 10X tørr objektiv og brukes til å generere maksimal intensitet z anslag. Dao, dorsal aorta. Bildene viser sagittale visninger. Skala barer i A og B = 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Koronar fartøy i hele embryonale hjerter ble fotografert av wholemount farging med anti-PECAM1 antistoff etterfulgt av optisk klaring og konfokalmikroskopi. Den enkle metoden beskrevet her, for clearance av embryonale mus hjerter med BABB, øker optisk penetrasjon og muliggjør fangst av høyoppløselige bilder av blodårer lokalisert i aorta og kammerveggene. Glycerol-baserte monterings reagenser slik som Vectashield (brytningsindeks 1,45) har også vært anvendt for avbildning av den koronare blodkar 22 imidlertid den høyere brytningsindeksen for BABB (1,56) reduserer lysspredning ytterligere, slik at dypere vev penetrasjon. Tissue klaring unngår behovet for mer komplekse og kostbare former av mikroskopi som multiphoton og lys-mikroskopi ark som kan være mindre lett tilgjengelig for forskere. Clearing prosessen er svært rask i forhold til andre metoder 6-9 og for små prøver kan være carried ut ved hjelp av små mengder reagenser direkte på mikros fatet. Robust farging av blodkar er nødvendig for å oppnå bilder av høy kvalitet; anti-PECAM1 antistoff ble valgt som den markerer alle typer av koronar ECS og en rekke kommersielle antistoffer ble funnet å gi egnet høye nivåer av farging. I tillegg vises det fluorescerende farging for å være ekstremt stabile i Babb; prøver lagret ved værelsestemperatur i Babb (beskyttet fra lys) beholdt sitt fluorescente signal i flere måneder. Det faktum at PECAM1 antistoff effektivt etiketter koronar endocardium samt blodkar var tidvis problematisk, spesielt når du tar bilder av peritruncal plexus. Sterkere farging av aorta lumen sammenlignet med peritruncal ECS resulterte i en fare for overmetning i enkelte områder av bildene, noe som betyr at nøye justering av bildeparametrene var nødvendig. Ideelt sett, en antistoffarging bare vaskulær ECS ville bli brukt; i praksis,imidlertid finne egnede antistoffer som gir det ønskede nivå av wholemount farging kan være vanskelig. Nylig har fettsyre-bindende protein 4 (FABP4) blitt vist å være en markør for koronar vaskulær ECS 23, og kan derfor representere et alternativ til PECAM1.

For å beholde 3D morfologi av aorta og hjertekamrene prøvene ikke var flat montert, men i stedet ble avbildet i glassbunn retter. Dybden av prøvene som skal avbildes utelukket bruken av høy forstørrelse mål, på grunn av deres korte arbeids avstander. Men høyoppløselige bilder fortsatt var mulig å bruke en 10X objektiv ved å øke pixel holdetid og bruke en piksel rekke størrelse på minst 1024 x 1024 for bildeopptak. Dette var tilstrekkelig for analyse av strukturen og fordelingen av koronarkarene, men finere analyse av cellestrukturen kan kreve flat montering av prøver. Disseksjon av de enkelte deler av hjertet for montering,f.eks ventrikkel vegger, eller aorta, kan også være nødvendig. Alternativt kan over-sampling av bildet, etterfulgt av dekonvolvering kan utføres for å øke oppløsning og sensitivitet; Dette krever imidlertid betydelig lengre skanning ganger og skaper svært store bildefiler som krever mye datakraft for å behandle.

Hjerter opp til E15.5 ble med hell avbildes ved hjelp av denne metoden, og det er også mulig å analysere vaskulaturen av hele embryoer (opp til minst E11.5) ved bruk av samme protokoll. Andre celletyper, for eksempel, glatte muskelceller Det er også avbildet i vårt laboratorium ved hjelp av denne teknikken. For tykkere vev, for eksempel, hjerter eldre enn E15.5, kan antistoffet penetrasjon være en begrensende faktor; lengre inkubasjoner og / eller økt vaskemiddel kan være nødvendig. I tillegg, når samle en stor z stabel av bilder signalstyrken kan reduseres som lasere trenge inn i de fjerneste partier av vev; men confocal innstillinger kan justeres for å øke laser makt med økende z avstand.

Denne metoden muliggjør konfokal mikroskopisk analyse av begge de tidligste stadiene av koronar fartøy dannelse og fordelingen av koronararteriene på senere utviklingsstadier. Detaljert informasjon om fordeling, forgrening og struktur av blodkar kan bli kjøpt opp i løpet av kort tid, noe som gjør dette til et verdifullt verktøy for å studere genetiske mus mutanter med spesifikke defekter i angiogenese veier.

Acknowledgments

Arbeidet ble finansiert av British Heart Foundation'and støttet av National Institute for Health Research Biomedical Research Centre ved Great Ormond Street Hospital for Children NHS Foundation Trust og University College London.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS Life Technologies 14190-094
Forceps FST 11251-30
10 cm Petri dishes Falcon 351029
35 mm Petri dishes Sigma P5112
Stainless steel minutien pins 0.2 mm diameter FST 26002-20
Fine tip pastettes  Alpha Laboratories LW4061
1,000 ml pipette tips Sorenson 34000
48-well plate Falcon 353078
Kwik-Gard World Precision Instrument KWIKGARD Silicone elastomer Sylgard184 packaged in a cartridge for mixing and dispensing
Kwik-Gard refill World Precision Instrument KWIKGLUE Refill cartridges and dispensing tips
Paraformaldehyde Sigma P6148 Make up in PBS and store at -20 °C
100% methanol VWR 20847307
Tween®20 Sigma P1379
Goat serum Sigma G9023
Anti-PECAM1 antibody, rat anti-mouse BD Pharmingen 553370 Primary antibody, dilute 1 in 50
Anti-CD31 polyclonal, rabbit polyclonal Abcam ab28364 Primary antibody, dilute 1 in 50
Anti-CD31/PECAM1 clone 2H8, armenian hamster monoclonal Thermo Fisher Scientific MA3105 Primary antibody, dilute 1 in 400
Endomucin antibody (V.7C7), rat monoclonal Santa Cruz Biotechnology sc-65495 Primary antibody, dilute 1 in 50
Anti-SM22 alpha antibody, rabbit polyclonal Abcam ab14106 Primary antibody, dilute 1 in 250
Goat anti-rat IgG (H+L)Alexa Fluor 594 Thermo Fisher Scientific A11007 Secondary antibody, dilute 1 in 500
Goat anti-rabbit IgG (H+L)Alexa Fluor 594 Thermo Fisher Scientific Secondary antibody, dilute 1 in 500
Goat anti-Armenian Hamster IgG (H+L)Alexa Fluor 488 Abcam ab173003
Goat anti-rat IgG (H+L)Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A21208 Secondary antibody, dilute 1 in 500
Phenolic screw cap Wheaton 240408
Benzyl alcohol Sigma 402834
Benzyl benzoate Sigma B6630
Imaris Bitplane Imaging image analysis software
ImageJ software NIH Freeware

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Red-Horse, K., Ueno, H., Weissman, I. L., Krasnow, M. A. Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells. Nature. 464, (7288), 549-553 (2010).
  2. Tian, X., et al. Subepicardial endothelial cells invade the embryonic ventricle wall to form coronary arteries. Cell Res. 23, (9), 1075-1090 (2013).
  3. Wu, B., et al. Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling. Cell. 151, (5), 1083-1096 (2012).
  4. Klotz, L., et al. Cardiac lymphatics are heterogeneous in origin and respond to injury. Nature. 522, (7554), 62-67 (2015).
  5. Nam, J., et al. Coronary veins determine the pattern of sympathetic innervation in the developing heart. Development. 140, (7), 1475-1485 (2013).
  6. Zhu, D., Larin, K. V., Luo, Q., Tuchin, V. V. Recent progress in tissue optical clearing. Laser Photon. Rev. 7, (5), 732-757 (2013).
  7. Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat. Methods. 10, (6), 508-513 (2013).
  8. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neurosci. 14, (11), 1481-1488 (2011).
  9. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat. Neurosci. 16, (8), 1154-1161 (2013).
  10. Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat. Methods. 4, (4), 331-336 (2007).
  11. Zucker, R. M., Hunter, E. S., Rogers, J. M. Confocal laser scanning microscopy of morphology and apoptosis in organogenesis-stage mouse embryos. Methods Mol. Biol. 135, 191-202 (2000).
  12. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat. Protoc. 7, (11), 1983-1995 (2012).
  13. Erturk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO. J. Vis.Exp : JoVE. (89), (2014).
  14. Dyer, L. A., Wu, Y., Patterson, C. Protein isolation from the developing embryonic mouse heart valve region. J. Vis.Exp s : JoVE. (91), e51911 (2014).
  15. Wilsbacher, L. D., Coughlin, S. R. Analysis of cardiomyocyte development using immunofluorescence in embryonic mouse heart. J. Vis.Exp : JoVE. (97), (2015).
  16. StitchArt Guide for Zen 2010. Zeiss. Available from: http://www.google.co.uk/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=1&ved=0ahUKEwjC6OPVnO7NAhVD7RQKHQzqALkQFggcMAA&url=ftp%3A%2F%2Fftp.sonic.net%2Fpub%2Fusers%2Flhund%2FMMP%2FBlurWin2012%2FHelpful Docs%2FTiling_and_Stitching in Zen.pdf&usg=AFQjCNH4C6dv8bdmKC651sp_CFz4C1Rq3g (2010).
  17. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature methods. 9, (7), 676-682 (2012).
  18. Tian, X., Pu, W. T., Zhou, B. Cellular origin and developmental program of coronary angiogenesis. Circ. Res. 116, (3), 515-530 (2015).
  19. Ivins, S., et al. The CXCL12/CXCR4 Axis Plays a Critical Role in Coronary Artery Development. Dev. Cell. 33, (4), 455-468 (2015).
  20. Theveniau-Ruissy, M., et al. Coronary stem development in wild-type and Tbx1 null mouse hearts. Dev. Dyn : an official publication of the American Association of Anatomists. 245, (4), 445-459 (2016).
  21. Tomanek, R. J. Formation of the coronary vasculature during development. Angiogenesis. 8, (3), 273-284 (2005).
  22. Chen, H. I., et al. VEGF-C and aortic cardiomyocytes guide coronary artery stem development. J. Clin.Iinvest. 124, (11), 4899-4914 (2014).
  23. Tian, X., et al. Vessel formation. De novo formation of a distinct coronary vascular population in neonatal heart. Science. 345, (6192), 90-94 (2014).
Analyse av koronarkar i Slettet embryonale Hearts
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ivins, S., Roberts, C., Vernay, B., Scambler, P. J. Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts. J. Vis. Exp. (118), e54800, doi:10.3791/54800 (2016).More

Ivins, S., Roberts, C., Vernay, B., Scambler, P. J. Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts. J. Vis. Exp. (118), e54800, doi:10.3791/54800 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter