Summary
Vi presenterar ett protokoll för analys av kranskärlen i hela embryonala murina hjärtan upp till E15.5, användning av standardimmunologiska färgningsmetoder följt av optisk clearance och konfokalmikroskopi. Denna teknik möjliggör visualisering av blodkärl i hela hjärtat utan behov av tidsödande analys av seriella sektioner.
Introduction
Inrättande av ett fungerande koronar nätverk är avgörande för hjärtats funktion och embryonal utveckling och analys av genetiska mutanter mus kan ge värdefull insikt i de molekylära signaler som ligger bakom denna utvecklingsprocess. Förmågan att visualisera embryonala hjärt plexus som en helhet, snarare än presenteras i en serie av histologiska sektioner, är nödvändig för att underlätta analysen av fartygets mönstring i genetiska mutanter, och undviker den potentiella förlusten av information som kan uppstå som en följd av mekanisk skivning av vävnaden. Fartyg ödesbestämd att bilda artärer och kapillärer är lokaliserade djupt inom väggarna i både kamrarna och aorta 1-3. Men medan fluorescensmärkning av celler i kombination med laserskanning konfokalmikroskopi kan ge högupplösta bilder av wholemount-märkt ytliga venösa / lymfkärl 4,5, är djupet av avbildning begränsas genom optisk penetration. Högupplöst avbildning av locketillaries och artärer under hela djupet av hjärtat är därför inte möjlig utan någon form av vävnad clearing.
Dålig optisk penetrering orsakas av högt brytningsindex av den multipla cellulära och extracellulära (t.ex. kollagen och elastiska fibrer) komponenter av tjocka vävnader. Detta sprider bild ljus, vilket oskärpa och minskad kontrast. Clearinginstitut matcha typiskt högt brytningsindex av sådana vävnader, vilket innebär att ljuset kan färdas genom provet obehindrad och tränga djupare in i vävnaden. Innan clearing, vävnader i allmänhet uttorkad som vatten har en relativt lågt brytningsindex. En uppsjö av nya clearing metoder har utvecklats nyligen, men beroende på den teknik som används, kan clearingprocessen ta dagar eller veckor och kan kräva kostsamma reagens 6-9. BABB (en 1: 2 blandning av bensylalkohol och bensylbensoat) är ett billigt, som vanligen används renande ämne, som har denFördelen med att rensa prover extremt snabbt. BABB-baserade clearing och avbildningstekniker har beskrivits tidigare för neurologiska prover och olika organ 10-13. Här beskriver vi en robust och enkel teknik för BABB clearance av immun prover följt av konfokalmikroskopi, med särskild hänvisning till en undersökning av blodkärl i murina hjärtan från E (embryonal dag) 11,5-15,5. Emellertid, såsom har även visats, tekniken kan lika väl tillämpas på analys av hela embryon, såväl som andra celltyper, så länge som högkvalitativa antikroppar mot markörerna av intresse föreligger.
Protocol
Alla djurförsök utfördes i enlighet med institutionella riktlinjer under licens från den brittiska inrikesdepartementet.
1. Dissekering och Fixering av embryonala hjärtan
- Avliva en tidsinställd-gravid musen på önskad dag med användning av en etiskt godkänd culling-teknik, t.ex, CO 2 narkos följt av cervikal dislokation, och ta bort de embryonala säckar 14, placera dem i en 10 cm petriskål fylld med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) .
- Med hjälp av en dissekera mikroskop och pincett, försiktigt öppna upp livmoder säckarna och ta bort varje embryo, bryta navelsträngen och ta bort gulesäcken.
- För genotypning syften, avlägsna den embryonala svansen och plats i en 1,5 ml mikrocentrifugrör för lys / DNA extraktion senare.
- I syfte att avlägsna hjärtat, stift varje embryo ut på rygg i en PBS-fyllda silikonelastomerbelagt 35 mm petriskål, med användning av rostfritt stål minutien stift. Med fin pincett, carefully öppna kistan och kapa de stora kärlen, anterior till hjärtat. Då når bakom hjärtat med pincett, ta tag kärlen bakom hjärtat och dra försiktigt bort hjärtat; lungorna kan också komma bort på samma gång.
- Överföra hjärtat till en färsk 35 mm petriskål med PBS och använda fin pincett för att trimma bort lungvävnaden, om så är nödvändigt. Sedan överföra hjärtat till en brunn i en 48-brunnars platta fylld med kall PBS.
- Efter att samla alla hjärtan i 48-brunnar, aspirera PBS med en spetsig plast pasteurpipett och ersätta med 0,5 ml 4% paraformaldehyd (PFA).
VARNING: PFA är en känd för att vara allergiframkallande, cancerframkallande, och giftiga.- Fix E11.5 - 12,5 hjärtan för 15 min, E13.5 hjärtan för 20 min och E14.5 - 15,5 hjärtan för 30 min, i fyra% PFA vid rumstemperatur.
- Aspirera PFA med en spetsig plast pasteurpipett och skölj hjärtan 2x i kall PBS.
förs kt gION: PFA är farligt och måste kasseras i enlighet med de institutionella bestämmelser. - Om inte omedelbart använder för hela berget immunfärgning (se avsnitt 2), torka hjärtan genom att utföra successiva 5 min tvättar i följande lösningar: 25% metanol / 75% PBS, 50% metanol / 50% PBS, 75% metanol / 25 % PBS.
VARNING: Metanol är giftigt, handskar. Lagra hjärtan vid -20 ° C i 100% metanol.
2. Hela Mount immunfärgning av embryonala hjärtan med anti-PECAM1 antikropp
OBS: Anti-PECAM1 antikroppar fungerar bra för färgning av kranskärl (se steg 2.4), men någon pan-endotel markör som ger en robust signal skulle vara lämplig.
- Om du använder hjärtan som har lagrats i 100% metanol, överföra till 1,5 ml mikrocentrifugrör och återfuktar genom att utföra successiva 5 min tvättar i följande lösningar: 75% metanol / 25% PBS, 50% metanol / 50% PBS och 25% metanol / 75% PBS. Permeabilize hjärtan genom att utföra 3 x 10 minuterstvättar i 0,5 till 1,0 ml PBST (PBS / 0,1% Tween-20), som roterar vid rumstemperatur.
- Blockera hjärtan genom att rotera under 1 timme vid rumstemperatur i 1,0 ml 10% getserum i PBST.
- Ta bort blockerande buffert med en spetsig plast pasteurpipett eller 1000 mikroliter pipettspets och ersätt med 400 - 500 l färska block som innehåller anti-PECAM1 primär antikropp utspädd 1:50. Rotera rören över natten vid 4 ° C.
- Nästa dag, aspirera blocket / primära antikroppen med en spetsig plast pasteurpipett eller 1000 mikroliter pipettspets och genomföra åtminstone 6x 1 h tvättar i 1,0 ml PBST, roterande rören vid rumstemperatur.
- Ersätta den sista tvättningen med färsk blockerande buffert innehållande fluoroforen-konjugerad sekundär antikropp utspädd 1: 500, och inkubera över natten vid 4 ° C, med rotation. Skyddas från ljus genom att linda rören i folie.
- Följande dag, aspirera blocket / sekhands antikropp med en spetsig plast pasteurpipett och genomföra åtminstone 6x 1 h tvättar i 1,0 ml PBST, roterande rören vid rumstemperatur.
- Lagra hjärtan vid 4 ° C (skyddat från ljus) tills det behövs.
3. Beredning av Clearing Solutions och mikroskopi rätter
OBS: När avbildning hjärtan i BABB är det viktigt att ingen av BABB lösning kommer i kontakt med komponenterna i mikroskop. För detta ändamål följande protokoll innehåller instruktioner för framställning av silikonelastomer förslutna rätter lämpliga för fluorescensmikroskopi, som kan framställas i god tid. Silikonelastomeren tillhandahåller en barriär för att innehålla den BABB och hindra den från potentiellt sipprar mellan glaset botten och polykarbonatet sidorna av skålen.
- För att förbereda silikonelastomeren belagda rätter, ta optiska glasbottnad odlingsskålar och placera ett lock från en 4 ml skruvlock injektionsflaska (ca 1,5 cm i diameter) I mitten av varje maträtt.
OBS: Detta kommer att utgöra en bra för provet när elastomeren läggs till skålen. - Fylla skålarna med silikonelastomer till ett djup av ca 0,5 cm, med användning av en applikator patron för att blanda de två komponenterna när de appliceras, i enlighet med tillverkarnas instruktioner. Låt härda i minst 24 timmar, och se till att flaskan locket kvar i mitten av varje maträtt.
OBS: Använd skyddsglasögon för att undvika oavsiktlig kontakt mellan silikonelastomeren med ögonen. - Efter härdning av elastomeren, ta bort flaskan locket från varje skål, Detta kommer att lämna en central brunn där provet som skall avbildas kan placeras i direkt kontakt med glaset botten av skålen.
OBS: när de är härdade elasten bör vara fast och torr vid beröring. - Förbered BABB lösning (en del bensylalkohol till 2 delar bensylbensoat). Detta bör förvaras i en glasflaska och skyddas från ljus.
VARNING: BABB är en giftig, frätande lösning. Handtag i ett dragskåp medan bära lämpliga skyddskläder. - Mix BABB och metanol för att göra en 50:50 lösning (1 - 5 ml) i en glasflaska. Skyddas mot ljus, till exempel genom att linda flaskan i folie.
4. Uttorkning, Clearing och montering av Hearts för konfokalmikroskopi
OBS: Större prover kan tas bort i 4 ml glasflaskor, men för små prover (t.ex. hjärtan upp till E13.5) är det bättre att utföra clearingprocessen direkt i mikroskopi skålen. Detta hjälper till att förhindra "förlora" proverna som hjärtan blir mycket öppet en gång raderas. För dessa små prover clearing är mycket snabb, inträffar inom några minuter.
OBS: Skydda proverna från ljus under alla följande steg genom att linda / täcker rör och rätter med folie.
- Innan du rensar, torkar de immun-hjärtan genom en metanol serie genom att vrida hjärtan på rummet tempeperatur i en 1,5 ml mikrocentrifugrör i successiva byten av följande lösningar: 25% metanol / 75% PBS, 50% metanol / 50% PBS och 75% metanol / 25% PBS (5 min i vardera). Slutligen, rotera för 3 x 5 min i 100% metanol.
- För hjärtan upp till E13.5, plats i mitten av mikroskopi skålen; under mikroskop se till hjärtat är orienterad med sin dorsala sidan överst. Ta bort eventuella metanol från runt hjärtat med en spetsig plast pasteurpipett.
- Med hjälp av en ren spetsig plast pasteurpipett, lägga BABB: metanol 50:50 lösning i en tillräcklig volym för att fördjupa hjärtat (cirka 300-400 l). Som hjärtan ibland kan slå över i lösningen, kontrollera orienteringen igen medan hjärtan är fortfarande ogenomskinlig. Låt i lösningen under 5 minuter.
- Avlägsna 50:50 lösningen till en glasavfall flaska i dragskåp och ersätta med BABB, återigen med en fin spets plast pasteurpipett.
OBS: En stor volym behövs inte, lägga sufficient så att hjärtat sitter inom en droppe av lösning. Hjärtat bör klara inom fem minuter. - För större hjärtan, rensa prover i glasflaskor.
OBS: En E15.5 hjärta bör klara inom 30 min-1 h, men kan lämnas över natten om det behövs. - Efter provet är klart, ta bort lösningen och ersätta med en minimal volym av BABB. Eventuellt, täck över provet med ett täckglas, för att hjälpa till att hålla den på plats, men detta är inte absolut nödvändigt. Använd hjärtat för avbildning.
5. Imaging Cleared Hearts av konfokalmikroskopi
OBS: Bilder fångades på ett inverterat konfokalmikroskop använder 10X eller 20X torra mål. Även om det är möjligt att använda rätter på en upprätt konfokala, måste extra försiktighet iakttas för att undvika kontakt av målet med BABB lösning.
- Samla en z-scan av hjärtat 15. Beroende på storleken av hjärtat, kan en bricka scan krävas för att avbilda hela hjärtat 16.
VARNING: BABB är en frätande lösning, använd rena handskar och säkerställa utsidan av mikroskopi skålen är fri från BABB. Hantera skålen noga och hålla locket på skålen för att minimera risken för oavsiktligt spill på mikroskopet. - Om målet arbetsavståndet tillåter, använda en högre förstoring att uppnå högre upplösning bilder av regioner av intresse.
6. Data Analysis Använda Fiji Software
- Öppna z bunt bilder i Fiji 17.
- För att göra az projektion av hela stapeln eller delar av den, klicka på bilden och välj Stack, följt av Z-projektet. Ange start och stopp skiva nummer och välj vilken typ av z projektion, t.ex. genomsnittlig intensitet, max intensitet.
- För att belysa enskilda fartyg inom en bunt med bildskivor använder Blow verktyget (från Plugins-menyn väljer segmentering, och sedan blåsa / Lasso verktyg) och klicka på de områden av bilden som skall fyllas i each skiva. Använd kommandot Fill (klicka på Redigera, välj sedan Fill) att fylla i de markerade områdena med förgrundsfärgen val (klicka på Redigera, sedan väljer Val, följt av färger och förgrunds).
- Z projektet bildstapel som tidigare.
7. 3D Surface Volym rendering av kranskärl genereras med hjälp Imaris
- Klicka på ikonen Surpass högst upp på skärmen och dra och släppa bildfilen i datafönstret. Klicka på ikonen 3D högst upp på skärmen.
- Välj ikonen ytor (blå ikon) och klicka sedan på fliken Skapa. Klicka på "Hoppa skapas automatiskt, manuellt redigera" dialogrutan och klicka på ikonen Rita (tunn pennikonen).
- Välj fliken Contour, och sedan fliken Läge. I läget, klicka på trollspöt eller isolinje ikoner. Välj pekaren läget i Pointer val på höger sida av skärmen genom att klicka bredvid "Välj" och klicka sedan på "Rita9; box (i det nedre vänstra hörnet av skärmen).
- Använd isolinje eller trollspö för att markera konturerna av artärerna i successiva skivor. Navigera från skiva till skiva med reglaget snittpositionen.
- När alla konturer har valts ut, klicka på rutan Skapa Surface. Det omgivande volym kan göras osynlig, eller göras mer eller mindre genomskinliga genom att använda blandningsläget; klicka på volym för att markera den och välj sedan fliken Inställningar, följt av fliken Läge. Välj Blend och använd reglaget för att ändra opaciteten.
- Fånga bilder med Snapshot-funktionen.
Representative Results
Som hjärtat utvecklas, är kammarhjärtmuskeln invaderades av endotelceller (EC) från olika källor, och en vaskulär plexus bildas. Fartyg som utvecklas inom det ventrikulära myokardiet kommer att fortsätta att bilda kapillära och arteriella nätverk som levererar syresatt blod till hjärtvävnaden 18. Samtidigt (cirka E11.5) koronar stjälkar börja utveckla oberoende från en separat kapillärt nätverk (känt som peritruncal plexus) som omger lumen i aorta 14,19,20. Peritruncal plexus EC bildar initialt flera anslutningar med lumen i aorta i nivå med ventil bihålor, men i slutändan bara ett fartyg kommer att bestå på varje sida av aorta, som pågår för att bilda rötter vänstra och högra kransartärerna 21. Från omkring E13.5 den peritruncal och ventrikulära hjärt fartyg gå upp för att bilda ett sammanhängande nätverk, vilket gör att blodflödet från enorta i kranskärlen 14,22. Färgning av EC med anti-PECAM-1-antikropp, i kombination med BABB avslut av intakta hjärtan, medger analys av utvecklingskrans nätverk från tidigt skede som möjligt. Vid senare utvecklingsstadier kan också undersökas mönstringen av förfallande kranskärlen. Denna metod kan också användas för att färga kärlsystemet i hela embryon (upp till E11.5 åtminstone), och med olika antikroppar, t ex, anti-alpha glattmuskelaktin (Sm22α) och Endomucin.
Figur 1 visar maximal intensitet z-projektioner av en E11.5 hjärta genereras med hjälp av Fiji programvara. Tile-funktionen användes för att samla flera partiella bilder av hjärtat och sy ihop dem till en komplett bild; detta är användbart för att ge en överblick av färgning i hela provet. I detta skede PECAM1 antikropp fläckar huvudsakligen den endokardiala slemhinnan i hjärtat och utflödet vessels, men några EC kan också iakttas i den vänstra ventrikulära väggen (boxed regionen i figur 1A, visas förstorad i 1A). Dessutom kan de peritruncal plexus tydligt observeras i väggen i utflödesområdet (GT) (boxed region i Figur 1B). I det senare fallet, att minska antalet segment i z-stack används för att generera den utskjutande förbättrade klarheten hos den bild, vilket gör att de anslutningar med lumen i aorta som skall visualiseras tydligare (Figur 1B). I figur 2, kan observeras den ökade vaskulaturen proximalt till aorta i en E12.5 hjärta. Figur 3 visar den peritruncal plexus i en E12.5 hjärta. Den 12-slice z projektion i figur 3A visar hela plexus, men som en del fartyg är lokaliserade ventralt till lumen i aorta (som också är kraftigt färgas av anti-PECAM1 antikropp), dela upp den z-stack into ett antal understaplar (Figur 3B-D) ger mer visuell information. Exempelvis sub-stack projicerad i fig 3B visar en peritruncal kärl ansluter till den ventrala ytan av aortalumen, som inte syns i den fullständiga projektion. Figur 4 visar en del av en E15.5 hjärta; kranskärlen är klart synliga i detta skede (figur 4A, 30-slice projektion). I 5-slice z prognoser som visas i figurerna 4B och C aorta och lung ventiler också kan visualiseras genom PECAM1 färgning; grenar och sammankoppling av kranskapillära nätverket också tydligare i dessa mindre sub-stack prognoser. Manuella segmente tekniker har använts för att belysa hjärtats kranskärl med hjälp av Fiji (Figur 4D) eller Imaris (Figur 4D och E). 3D-yta volym rendering av kranskärl / aorta lumen genererade uSing Imaris kan ses med eller utan den omgivande kärl (figur 4E och F).
Kärl av hela embryon kan också undersökas med hjälp av PECAM1 färgning / BABB avslut. Figur 4A och A ', visar z prognoser genereras från under staplar från den högra sidan (z skivor 11 - 65) och vänster (z skivor 66-110) av embryot respektive. Jämförelse av de två bilderna visar att intensiteten av den fluorescerande signalen inte signifikant minskar med djupare penetration in i vävnaden. I figur 4B, PECAM1 (röd signal) och Endomucin (grön signal) antikroppar kombinerades för att märka intersomitic artärer (ISA) och vener respektive, av en E11.5 embryo. Figur 4C visar SM22α (röd signal) och PECAM1 färgning (grön signal) av ISA i en E11.5 embryo. I figur 6, E11.5 embryonfärgades med PECAM en avbildades omedelbart efter BABB clearance (Figur 4A), eller efter ett intervall på ungefär två månader (Figur 4B). Fluorescenssignalen var fortfarande stark nog att bilden framgångsrikt efter långvarig förvaring av provet i BABB.
Figur 1. Immunfärgning av en E11.5 Hjärta med anti-PECAM1 antikropp (detekterad med anti-rått-IgG konjugerad till Alexa 594). (A, B) en 2 x 2 kaklade bild uppsamlades med användning av 10X målet med ett inverterat konfokalmikroskop. PECAM1 fläckar antikropps både endokardiala och vaskulär ECS. Utsprång (maximal intensitet) genererades från 22 (A) eller 5 (B) z skivor vardera av 4 | j, m tjocklek, med användning av Fiji mjukvara. A 'och B' är UTVIDGNINGts av de inramade områdena i A och B respektive. Pilar i A 'indikerar blodkärl i ventrikelväggen; i B "indikerar fästet peritruncal plexus. OT, utflöde; LV, vänster ventrikel, RV höger kammare. Alla bilder är frontvyer. Skala barer i A och B = 200 pm; skala barer i A 'och B' = 100 ^ m. Panel 1B 'anpassades från Ivins et al., 2015 19. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Immunfärgning av en E12.5 Hjärta med anti-PECAM1 antikropp. Panel A visar az projektion (maximal intensitet) av en 2x2 kaklade scan. Den inramade regionen i A visas Utvidgninged i A '; pilar indikerar kärlen flera blod proximalt aorta (Ao). LV, vänster ventrikel, RV höger kammare. Alla bilder är frontvyer. Skalstrecket i A = 200 pm; Skalstrecket i A '= 100 ^ m. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. avbildning av Peritruncal Plexus i en E12.5 Heart. Konfokala bilder av en E12.5 aorta (Ao) färgades med anti-PECAM1 antikropp samlades med hjälp av 10X objektivet. Z projektion (maximal intensitet) i A genererades från 12 z skivor (4 um tjocklek); Pilarna indikerar peritruncal plexus kärlen. BD 12 z skivor delades in i tre under staplar som anges och används för att generera separat projections; pilspetsar indikerar anslutningar som bildas av peritruncal plexus till lumen i aorta. Peritruncal fartyg lokaliserade ventralt till lumen i aorta är synliga i B och C. Alla bilder är frontvyer. Skalstreck = 50 | im. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. kransartärer och Kapillär Plexus i en E15.5 Heart. Konfokala bilder av en E15.5 hjärta färgades med anti-PECAM1 antikropp samlades med hjälp av 10X objektivet. Panel A visar en maximal intensitet z projektion genereras från 30 z skivor (4 um tjocklek); Pilarna indikerar vänster och höger kransartärer (LCA och RCA) som kan ses ansluter till aorta (Ao). med användning av different 5 z skiva sub-stackar aorta och lung ventiler (AOV och PV) kan ses i B och C respektive (blå parentes). Den ventrikulära kapillär plexus är också tydligare i dessa mindre sub-stack prognoser; blodkärl proximala till lungventilen (liten låda) visas förstorade i det nedre högra hörnet av panelen C (stor låda). Fiji användes för att lyfta fram enskilda blodkärl, t.ex. för panel D Blow / lassoverktyget användes för att fylla hjärtats kranskärl med röd färg manuellt i varje z skiva före projektion. Imaris programvara användes för att skapa 3D-bilder av artärerna (röd) och aorta lumen (grön) i E och F; igen detta skedde manuellt med trollstaven för att skapa objektkonturer i varje z skiva. Opaciteten hos den omgivande volymen kan ändras i blandningsläge, som i E. Alternativt, kan 3D-bilden extraheras, som visas i F kammare. Alla bilder är frontvyer. Skalstrecket i A = 100 ^ m. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Imaging av embryonala kärl. Paneler A och A 'visar konfokala bilder av en E10.5 vildtyp embryo färgas med anti-PECAM1 antikropp som samlats med hjälp av 10X objektivet (kaklade scan). Genomsnittlig intensitet z prognoser genererades från z skivor 11-65 (A) och 66-110 (A) i en 120 z skiva scan (4 pm tjocka skivor), som visar endast en liten förlust av fluorescensintensiteten över tjockleken av embryot . Panel B visar intersomitic fartyg med en E11.5 embryo färgade med Antibod talet mot PECAM1 (röd signal från 594-konjugerad sekundär antikropp) och Endomucin (EMCN, grön signal från 488-konjugerad sekundär antikropp), som färgas de intersomitic artärer (pil) och vener (pilspets) respektive (genomsnittlig intensitet z projektion från ett kaklat skanna). Fält C visar intersomitic artärer (ISA) från en E11.5 vildtyp embryo färgades med antikroppar mot PECAM1 (grön signal från 488-konjugerad sekundär antikropp) och SM22α (röd signal från 594-konjugerad sekundär antikropp). Konfokala bilder samlades med hjälp av 20X torr målet och används för att generera maximal intensitet z prognoser. Alla bilder är sagittala vyer. Skala barer i A och B = 250 um, skala bar i C = 100 um. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
d / 54800 / 54800fig6.jpg "/>
Figur 6. immun Prover godkännas i BABB Behåll fluorescerande signal för minst två månader. E11.5 embryon färgades med PECAM1 antikropp och rensas med BABB; embryon från samma sats avbildades omedelbart eller efter ett intervall på två månader. Panel A visar de intersomitic artärerna i embryot avbildade omedelbart och panel B visar embryot avbildas två månader senare. Konfokala bilder samlades med hjälp av 10X torr målet och används för att generera maximal intensitet z prognoser. dAO, bröst- aorta. Bilderna visar sagittala vyer. Skala barer i A och B = 100 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Kranskärlen i hela embryonala hjärtan avbildades av wholemount immunfärgning med anti-PECAM1 antikropp följt av optisk clearance och konfokalmikroskopi. Den enkla metod som beskrivs här, för avslutande av embryonala mus hjärtan med BABB ökar optisk penetration och möjliggör fångst av högupplösta bilder av blodkärl lokaliserade i aorta och ventrikulära väggarna. Glycerolbaserat monterings reagens såsom Vectashield (brytningsindex 1,45) har också använts för avbildning av kranskärlen 22 dock det högre brytningsindexet för BABB (1,56) minskar ljusspridning ytterligare, vilket möjliggör djupare vävnadspenetrering. Vävnads clearance undanröjer behovet av mer komplexa och dyra former av mikroskopi såsom multifoton och ljus ark mikroskop som kan vara mindre lätt tillgängliga för forskare. Clearingprocessen är extremt snabb jämfört med andra metoder 6-9 och för små prover kan vara carried med användning av små volymer av reagens direkt på mikroskopi skålen. Robust färgning av vaskulaturen krävs för att uppnå bilder med hög kvalitet; anti-PECAM1 antikropp valdes eftersom det markerar alla typer av koronar EC och ett antal kommersiella antikroppar befanns ge lämpligt höga nivåer av färgning. Dessutom förefaller den fluorescerande färgning för att vara extremt stabila i BABB; prov lagrade vid rumstemperatur i BABB (skyddade från ljus) behöll sin fluorescerande signal i flera månader. Det faktum att PECAM1 Antikroppen märker effektivt krans endokardiet liksom kärl var ibland problematiskt, särskilt när du tar bilder av peritruncal plexus. Starkare färgning av aorta lumen jämfört med peritruncal EC resulterade i en risk för övermättnad i vissa delar av bilderna, vilket innebär att noggrann justering av bildparametrar krävdes. Helst en antikropp färgning endast kärl EC skulle användas; i praktiken,emellertid kan finna lämpliga antikroppar som ger den erfordrade nivån av wholemount färgning vara svårt. Nyligen har fettsyrabindande protein 4 (FABP4) visat sig vara en markör för kranskärls EC 23 och kan därför utgöra ett alternativ till PECAM1.
För att behålla den 3D morfologin av aorta och hjärtkamrar proverna var inte platt-monterade, men var istället avbildas i glas botten rätter. Djupet av proven som skall avbildas förhindrade användningen av höga mål förstoring, på grund av deras korta arbetsavstånd. Men högupplösta bilder fortfarande kan uppnås med hjälp av en 10X mål genom att öka pixel uppehållstid och med hjälp av en pixelmatrisstorlek på minst 1024 x 1024 för bildfångst. Detta var tillräckligt för analys av struktur och fördelning av kranskärlen, men finare analys av cellstruktur kan kräva platt-montering av proverna. Dissektion av enskilda delar av hjärtat för montering,t.ex. ventrikeln väggar, eller aorta, kan också vara nödvändigt. Alternativt översampling av bilden följt av avfaltning kan utföras för att öka upplösning och känslighet; Detta kräver dock betydligt längre skanning gånger och skapar mycket stora bildfiler som kräver en hel del datorkraft för att bearbeta.
Hjärtan upp till E15.5 styrde avbildas med den här metoden, och det är också möjligt att analysera kärlsystemet i hela embryon (upp till minst E11.5) med användning av samma protokoll. Andra celltyper, t.ex., glatta muskelceller har också avbildats i vårt laboratorium med användning av denna teknik. För tjockare vävnader, till exempel, hjärtan äldre än E15.5, kan penetrationsantikroppen vara en begränsande faktor; längre inkubationer och / eller ökad rengöringsmedel kan behövas. Dessutom, när du samlar en stor z bunt bilder signalstyrka kan minskas lasrarna penetrera längst delar av vävnad; men confocal inställningar kan justeras för att öka lasereffekt med ökande z avstånd.
Denna metod underlättar konfokala mikroskopisk analys av både de tidigaste stadierna av kranskärlbildning och mönstring av kranskärlen på senare utvecklingsstadier. Detaljerad information om distribution, förgrening och struktur av blodkärl kan förvärvas på kort tid, vilket gör detta ett värdefullt verktyg för att studera genetiska mus mutanter med specifika defekter i angiogenes vägar.
Acknowledgments
Arbetet har finansierats av British Heart Foundation'and stöds av National Institute for Health Research Biomedical Research Centre vid Great Ormond Street Hospital for Children NHS Foundation Trust och University College London.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | Life Technologies | 14190-094 | |
| Forceps | FST | 11251-30 | |
| 10 cm Petri dishes | Falcon | 351029 | |
| 35 mm Petri dishes | Sigma | P5112 | |
| Stainless steel minutien pins 0.2 mm diameter | FST | 26002-20 | |
| Fine tip pastettes | Alpha Laboratories | LW4061 | |
| 1,000 ml pipette tips | Sorenson | 34000 | |
| 48-well plate | Falcon | 353078 | |
| Kwik-Gard | World Precision Instrument | KWIKGARD | Silicone elastomer Sylgard184 packaged in a cartridge for mixing and dispensing |
| Kwik-Gard refill | World Precision Instrument | KWIKGLUE | Refill cartridges and dispensing tips |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Make up in PBS and store at -20 °C |
| 100% methanol | VWR | 20847307 | |
| Tween®20 | Sigma | P1379 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Anti-PECAM1 antibody, rat anti-mouse | BD Pharmingen | 553370 | Primary antibody, dilute 1 in 50 |
| Anti-CD31 polyclonal, rabbit polyclonal | Abcam | ab28364 | Primary antibody, dilute 1 in 50 |
| Anti-CD31/PECAM1 clone 2H8, armenian hamster monoclonal | Thermo Fisher Scientific | MA3105 | Primary antibody, dilute 1 in 400 |
| Endomucin antibody (V.7C7), rat monoclonal | Santa Cruz Biotechnology | sc-65495 | Primary antibody, dilute 1 in 50 |
| Anti-SM22 alpha antibody, rabbit polyclonal | Abcam | ab14106 | Primary antibody, dilute 1 in 250 |
| Goat anti-rat IgG (H+L)Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A11007 | Secondary antibody, dilute 1 in 500 |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L)Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | Secondary antibody, dilute 1 in 500 | |
| Goat anti-Armenian Hamster IgG (H+L)Alexa Fluor 488 | Abcam | ab173003 | |
| Goat anti-rat IgG (H+L)Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A21208 | Secondary antibody, dilute 1 in 500 |
| Phenolic screw cap | Wheaton | 240408 | |
| Benzyl alcohol | Sigma | 402834 | |
| Benzyl benzoate | Sigma | B6630 | |
| Imaris | Bitplane Imaging | image analysis software | |
| ImageJ software | NIH | Freeware |
References
- Red-Horse, K., Ueno, H., Weissman, I. L., Krasnow, M. A. Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells. Nature. 464 (7288), 549-553 (2010).
- Tian, X., et al. Subepicardial endothelial cells invade the embryonic ventricle wall to form coronary arteries. Cell Res. 23 (9), 1075-1090 (2013).
- Wu, B., et al. Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling. Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).
- Klotz, L., et al. Cardiac lymphatics are heterogeneous in origin and respond to injury. Nature. 522 (7554), 62-67 (2015).
- Nam, J., et al. Coronary veins determine the pattern of sympathetic innervation in the developing heart. Development. 140 (7), 1475-1485 (2013).
- Zhu, D., Larin, K. V., Luo, Q., Tuchin, V. V. Recent progress in tissue optical clearing. Laser Photon. Rev. 7 (5), 732-757 (2013).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat. Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat. Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat. Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
- Zucker, R. M., Hunter, E. S., Rogers, J. M. Confocal laser scanning microscopy of morphology and apoptosis in organogenesis-stage mouse embryos. Methods Mol. Biol. 135, 191-202 (2000).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat. Protoc. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Erturk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO. J. Vis.Exp : JoVE. (89), (2014).
- Dyer, L. A., Wu, Y., Patterson, C. Protein isolation from the developing embryonic mouse heart valve region. J. Vis.Exp s : JoVE. (91), e51911 (2014).
- Wilsbacher, L. D., Coughlin, S. R. Analysis of cardiomyocyte development using immunofluorescence in embryonic mouse heart. J. Vis.Exp : JoVE. (97), (2015).
- StitchArt Guide for Zen 2010. , Zeiss. Available from: http://www.google.co.uk/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=1&ved=0ahUKEwjC6OPVnO7NAhVD7RQKHQzqALkQFggcMAA&url=ftp%3A%2F%2Fftp.sonic.net%2Fpub%2Fusers%2Flhund%2FMMP%2FBlurWin2012%2FHelpful Docs%2FTiling_and_Stitching in Zen.pdf&usg=AFQjCNH4C6dv8bdmKC651sp_CFz4C1Rq3g (2010).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Tian, X., Pu, W. T., Zhou, B. Cellular origin and developmental program of coronary angiogenesis. Circ. Res. 116 (3), 515-530 (2015).
- Ivins, S., et al. The CXCL12/CXCR4 Axis Plays a Critical Role in Coronary Artery Development. Dev. Cell. 33 (4), 455-468 (2015).
- Theveniau-Ruissy, M., et al. Coronary stem development in wild-type and Tbx1 null mouse hearts. Dev. Dyn : an official publication of the American Association of Anatomists. 245 (4), 445-459 (2016).
- Tomanek, R. J. Formation of the coronary vasculature during development. Angiogenesis. 8 (3), 273-284 (2005).
- Chen, H. I., et al. VEGF-C and aortic cardiomyocytes guide coronary artery stem development. J. Clin.Iinvest. 124 (11), 4899-4914 (2014).
- Tian, X., et al. Vessel formation. De novo formation of a distinct coronary vascular population in neonatal heart. Science. 345 (6192), 90-94 (2014).
