Mass היסטולוגיה לכמת מוחיים ב Published: December 15, 2016 doi: 10.3791/54809

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Elizabeth R. Sunderhaus¹, Doris Kretzschmar¹

¹Oregon Institute of Occupational Health Sciences, Oregon Health & Sciences University

Summary

תסיסנית נעשה שימוש נרחב כמערכת מודל ללמוד ניווניות של מערכת העצבים. פרוטוקול זה מתאר שיטה שבאמצעותה ניוון, כפי שנקבע על ידי היווצרות vacuole במוח, ניתן לכמת. הוא גם מפחית תופעות עקב ההליך הניסיון על ידי עיבוד ובקרת חתך וזבובים הניסיונות כמו דגימה אחת.

Abstract

מחלות ניווניות מתקדמות כמו מחלת אלצהיימר (AD) או מחלת פרקינסון (PD) מהוות איום הולך וגובר על בריאות אדם ברחבי העולם. למרות מודלים יונקים סיפקו תובנות חשובות המנגנונים של פתוגניות, את המורכבות של מערכות יונקים יחד עם העלויות הגבוהות שלהם הם מגבילים את השימוש בהם. לכן, תסיסנית פשוט אך ומבוססת מודל המערכת מספקת אלטרנטיבה לחקירת מסלולים מולקולריים המושפעות במחלות אלה. מלבד גירעונות התנהגותי, מחלות ניווניות המאופיינות פנוטיפים היסטולוגית כגון מוות עצב axonopathy. כדי לכמת ניוון עצבי ולקבוע כיצד הוא מושפע מגורמים גנטיים וסביבתיים, אנו משתמשים בגישה היסטולוגית המבוססת על מדידת vacuoles במוחות הזבוב הבוגר. כדי למזער את ההשפעות של טעות שיטתית ולהשוות חלקים ישירות מלא expזבובים erimental כהכנה אחד, אנו משתמשים בשיטת "צווארון" עבור חלקים פרפין. מוחייה אז נבחן על ידי מדידת הגודל ו / או מספר vacuoles שהתפתח במוח הזבוב. זה יכול להיעשות גם על ידי התמקדות באזור מסוים של עניין או על ידי ניתוח כל המוח על ידי קבלת קטעים סדרו כי היקף הראש המלא. לכן, שיטה זו מאפשרת למדוד לא רק ניוון חמור, אלא גם יחסית פנוטיפים קל כי ניתנים לזיהוי רק בעוד כמה סעיפים, כפי שקורה במהלך הזדקנות נורמלית.

Introduction

עם העלייה בתוחלת החיים, מחלות ניווניות כמו אלצהיימר או פרקינסון הפכו איום בריאותי הגובר באוכלוסיה הכללית. על פי המכון הלאומי לבריאות בארה"ב, 115 מיליון אנשים ברחבי העולם הם חזו להיות מושפעים דמנציה בשנת 2050. למרות התקדמות משמעותית נעשתה בזיהוי גנים וגורמי סיכון מעורבים לפחות חלק ממחלות אלה, עבור רבים מהם, נכס הבסיס מנגנונים מולקולריים עדיין אינם ידועים או לא הבין היטב.

אורגניזמים מודל חסרי חוליות פשוטות כמו elegans Caenorhabditis ו תסיסנית מציעים מגוון רחב של יתרונות הניסיונות כדי לחקור את המנגנונים של מחלות ניווניות, כוללים מחזור חיים קצר, מספר רב של צאצאים, ואת הזמינות של ומבוססת ולפעמים ייחודי שיטות גנטיות ומולקולריות ^{1 -12.} יתר על כן, אורגניזמים אלה ניתנים משוחדיםמסכי אינטראקציה שיכול לזהות גורמי תורמי מחלות אלה על ידי ההשפעות המחמירות או ממתן שלהם על פנוטיפים ניווניות.

ניתוח אינטראקציות גנטיות כאלה והערכת השפעות ההזדקנות דורש פרוטוקולים כמותיים לזהות ניוון מוחיים, למדוד חומרתה. הערכה זו יכולה להיעשות בקלות יחסית כאשר מודדים היבטים התנהגותיים תסיסנית, כגון למידת חוש ריח, geotaxis השלילי, או מהר phototaxis, המספקים ערך ביצועים מספרי ^13-21. כמו כן ניתן לקבוע את ההשפעות על הישרדות עצבית על ידי ספירת תאי עצב. עם זאת, זה אפשרי רק כאשר התמקדות אוכלוסייה מסוימת כי הוא שקל לזהות, כמו נוירונים דופאמינרגיים המושפעות במחלת פרקינסון, וגם אז, והתוצאות היו במחלוקת ^22-24.

הפרוטוקול המתואר כאן משתמש בשיטת הצווארון לבצע קטעי סדר פרפין, שיטהאשר פותחה במקור על ידי הייזנברג Bohl, שהשתמשו בו כדי לבודד מוטנטים המוח האנטומי תסיסנית ^25. השימוש בשיטת הצווארון מכן הותאם, לרבות cryosections, חלקי vibratome, וחתכי פלסטיק ^26-28. כאן, זוהי שיטה המופעלת להשיג חלקי סדרה של ראש הזבוב כולו, אשר לאחר מכן ניתן להשתמש כדי למדוד את vacuoles המתפתח זבובים עם פנוטיפים ניווניות ^16,21,29-32. מדידות אלה ניתן לעשות זאת באזורים ספציפיים במוח או יכולות לכסות את כל המוח; הגישה השנייה מאפשרת לזהות פנוטיפים ניווניות אפילו חלש, כפי שנצפה במהלך ההזדקנות. לבסוף, בעת שימוש הצווארונים, עד 20 זבובים ניתן לעבד כהכנה אחד, וזה לא רק פחות זמן רב, אלא גם מאפשר לניתוח מלא זבובים הניסיונות באותה ההכנה, מזעור חפצים בשל שינויים קלים ההכנה.

Protocol

1. תיקון הראש על כלב והטבעת פרפין

הערה: כל אחד מהשלבים בתהליך הקיבוע צריך להיעשות במנדף. Methylbenzoate, ואילו לא המהווים סיכון בריאותי, יש שהריח מן המעלה הראשונה, יכול להיות מכריע אם לא מטופלים במנדף.

1. לפני הרדמה זבובים, לפצות 50 מ"ל של תמיסת Carnoy על ידי הוספת 15 מ"ל של כלורופורם 5 מ"ל של חומצה אצטית קרחונית 30 מ"ל של 99% אתנול (לא לערבב את כלורופורם וחומצה אצטית). יוצקים אותו במיכל זכוכית עם תחתית שטוחה, כגון צלחת crystalizing, על מנת להבטיח כי צווארונים יכול להניח שטוח מכוסים לחלוטין על ידי פתרון.
2. להרדים את הזבובים עם CO ₂ או אתר.
3. זבובי נושא (עד 20 עם רוב הצווארונים) בצווארם ​​לתוך הצווארונים באמצעות מלקחיים. זכור כדי ליישר את כל הראשים באותו הכיוון, כפי שניתן לראות באיור 1 א, ו להיות עדין כדי לוודא ששום הנזק עולה על הראש או העיניים.
4. כלול זבובי oculis סינוס (חיצים, איור 1 א) על עמדות אקראיות כך שההסדר של הזבובים ניתן לזהות בקלות בסעיפים. בנוסף, אם הזבובים הניסיונות יש צבע עיניים בהיר או לבן, חוט כמה זבובים עם עיניים אדומות, כגון סוג בר, ביניהם כדי להבטיח פיגמנט מספיק נוכחת להכתים את השקופית. רשמו את סדר הזבובים על גיליון פרוטוקול יחד עם מספר צווארון אם משתמשים בכמות גדולה ממנת צווארון אחד.
5. לאחר צווארון כבר סיימתי, למקם אותו פתרון Carnoy המוכן תמורת 3.5 - 4 h.
6. Dump את הפתרון Carnoy לתוך הגליל לרשות המתאימה ולהתחיל שוטף אתנול. ודא לשפוך לאט כדי לא להפריע את המיקום של הצווארונים בתוך המכל.
7. שטוף את הצווארונים למשך 30 דקות באתנול 99% פעמים.
8. שטפו את צווארונים באתנול 100% במשך 1 שעה. הקפד להחליף את הכביסות בזמן כדי למנוע overdehydration.
9. שים את צווארוני methylbenzoateO / N ב RT. חותם את המיכל עם parafilm כדי למנוע אידוי של methylbenzoate.
10. יוצק את methylbenozate לתוך המכל הפנוי הנאה במנדף. להוסיף תערובת בעבר הכנה של 1: 1 נקודת התכה נמוכה (56 - 57 ° C) פרפין שעווה methylbenzoate. מנקודה זו ואילך, הצווארונים צריכים להישמר באינקובטור ב 65 מעלות צלזיוס כדי לוודא כי פרפין אינו להקשיח.
11. יוצקים את תערובת methylbenozate פרפין לתוך המכל הפנוי הנכון, ויוצקי פראפין טהור מותך, שמור על 65 מעלות צלזיוס, על הצווארונים.
12. שנה את פרפין לאחר 30 דקות וחזרו לפחות 5 פעמים זה. לפחות 6 - 8 שוטף צריכה להתבצע.
13. לאחר הכביסות הושלמו, למקם את הצווארונים לתוך מגש קוביות קרח גומי עם חריצים בערך בגודל של הצווארונים. יוצקים פרפין מותך מעליהם עד מכוסה לחלוטין ולאפשר לו להקשיח O / N (מנסה למנוע בועות אוויר).
14. הסר את אבני פרפין contaiנינג הקולרים ממגש קוביית קרח. הפרד את בלוק פרפין מן הצווארון באמצעות סכין גילוח, בעדינות לנתק איתם את הצווארון. הראשי יהיה בבלוק פרפין ואילו הגופים יישארו הצווארון. אבני יכולים להישמר בטמפרטורת החדר.
15. כדי לנקות את צווארונים, להשרות אותם סוכן deparafinization על 65 מעלות צלזיוס להסיר את פרפין, נקי עם קרצוף אור, ולשטוף באתנול לפני שימוש חוזר.

2. חתך השמה

1. לחמם צלחת חימום עד 50 מעלות צלזיוס. מניח את מחזיקי אובייקט (או בלוקי הרכבת מתכת) ו סכיני גילוח על הצלחת ולתת להם להתחמם.
2. בהתאם לכיוון הרצוי עבור חתך, לצרף את בלוק פרפין או עם הראשים כלפי הצד (סעיפים אופקיים) או כלפי מעלה (סעיפים חזיתית) כדי לחסום הרכבה מחוממת (בקצרה המסת הבלוק בצד המגע). הסר את הבלוק מן צלחת החימום ולאפשר לו להתקרר במשך לפחות 10 מייליםn על מנת להבטיח כי פרפין הוא קשוח מספיק עבור הדפסה נאותה על לחסום את ההרכבה. שמור על השורה של הראשים מיושרים במקביל פני השטח של הגוש ככל האפשר כדי למנוע חלקים אחידים.
3. קח סכין גילוח וקוצץ את פרפין לנזול החוצה מהראשים לטוס כך שורה קטנה רק עם ראשי המוטבע נשארת (סכין הגילוח ניתן התחמם עבור זמירה קלה). ודא שלא לקצץ יותר מדי כך פרפין לא לשבור במהלך חתך (יותר זמירה יכול להיעשות במהלך חתך).
4. מניחים את גוש הרכבה לתוך מחזיק אובייקט של microtome ולהבטיח כי היישור של שורת ראשי מקביל ככל האפשר אל קצה הלהב.
5. כן שקופיות מיקרוסקופ על ידי מכסה אותם עם שכבה דקה של פתרון poly-L- ליזין (PLL) ולתת להם להתייבש במשך 5 דקות. מכסים אותם במים זמן קצר לפני השימוש.
6. חותכים 7 סעיפים מיקרומטר ולהעביר את סרט סעיפים לשקופית צף על פני המים. <br /> הערה: כדי להשיג את המוח כולו לחלקים אופקיים, אנו אוספים את הסרט מתוך כאשר מתחילים לחתוך לתוך העין עד הראש נחתך לחלוטין (חיתוך מן החוטם לתוך המוח). יותר משקופית אחת עשויה להיות נחוצה עבור כל הראש.
7. מניחים את השקף על צלחת חום על 37 מעלות צלזיוס ולאפשר סרט להרחיב בערך 1 דקות.
8. הסרה של עודפי מים (על ידי שפיכת אותו או באמצעות רקמות) ומייבשים את השקופיות O / N.
9. הסר את שעוות פרפין משקופית ידי צבת את השקופיות בצנצנת שקופיות מכתימות גבוהה, אנכית מלאה סוכן deparafinization (לגמרי מכסה את הסעיפים). בצע 3 שוטף של 30 דק '- 60 דקות כל אחד.
10. להסיר את השקופית מן לשטוף הסופי. מניחים 2 טיפות של התקשורת הטבעה לשקופית ולכסות אותו עם coverslip גדול.

3. לצלם וניתוח סעיפים

1. אפשר השקופיות המוכנות להתייבש במשך 1 - 2 ד. לאחר מכן בחן אותם על microsc הקרינהאופ תחת אור כחול.
2. השתמש בהגדלה נמוכה כדי לקבוע את הכיוון של זבובים כדי למצוא את האזור של עניין אם מתמקדים באזור מסוים.
   הערה: לקבלת זבובי SWS (ראה איור 2), אנו מוצאים את החלק המכיל השליך הגדול ולקחת תמונה (בדרך כלל 40X גדלה). כאשר מנתחים את המוח כולו (כמו באיור 3), אנו לגלול בין כל הקטעים מתוך ראש או לצלם את החלק עם פנוטיפ החמור ביותר או כל החלקים שמראים vacuoles.
3. לניתוח כפול סמיות, לקחת ותמונות מספר בלי לדעת את הגנוטיפ ולהקליט את מספר צווארון המיקום של הראש בשורה לזהות אותם מאוחר יותר.
4. לאחר התמונות ננקטו, ולנתח אותם באמצעות תוכנת הדמיה.
5. ספירת vacuoles לכל סעיף או לנפש. כדי למדוד את גודל vacuole, לפתוח את התמונות מתוך התוכנה ובחר את vacuoles עם מבחר מדיl. לקבוע את כמות הפיקסלים vacuoles שנבחר.
6. להמרת מיקרומטר ^2, לצלם תמונה של שקופית כיול מיקרומטר הבמה בהגדלה משמשת עבור רכישת תמונות. לקבוע את כמות הפיקסלים 100 מיקרומטר ² כדי לחשב את מקדם המרה.
7. המר את מספר הפיקסלים הכולל לתוך מיקרומטר ² על ידי חלוקת מספר הפיקסלים במקדם ההמרה מחושב בשלב לעיל.

Representative Results

באמצעות תוצאות השיטה המתוארת בסעיפים סדרתי יוכתמו הפיגמנט בעין ³³ המקיפים את ראש זבוב כולו. חלק זה מוצג באיור 1B, שבו קטעים מתוך ראש הפרט מוצגים מלמעלה למטה. הסעיפים מפני זבובים שונים נראים משמאל לימין בדוגמה זו. כדי להקל על ההתמצאות זיהוי של זבובים, זבוב חסר עיניים (oculis סינוס) מוכנס כסמן במיקום 3 (חץ, איור 1B).

כדי לכמת ניוון מוחיים, אנו מודדים את היווצרות של vacuoles כי ניתן לאתר בקטעים אלה. Vacuoles מוגדרים עגול, כתמים כהים כי הם בתוך neuropil פלואורסצנטי ירוק (ראשי חץ באיור 2 ו -3) או קליפת הנראים 2 סעיפים רצופים לפחות של המוח זבוב. כימות ניווניות של מערכת העצבים על ידיvacuoles מדידה יכול להיעשות גם על ידי התמקדות באזור מסוים במוח או על ידי ניתוח המוח כולו. הגבלת ניתוח לאזור מסוים של המוח הוא שימושי במקרים בהם מוטציה משפיע רק על אזור מסוים, כמו האונות חוש הריח של futsch ^'olk מוטציה ^34, אבל זה יכול גם לשמש כשיש ניוון חמור בכל או רבים אזורים במוח. דוגמה האחרון הוא גבינה שוויצרית (SWS) מוטציה (איור 2), שבו מודדים את כל vacuoles יהיה יותר מדי זמן רב. לפיכך, אנו לקחנו רק תמונה אחת, על מנת להבטיח כי המדידות תמיד נעשו באותה הרמה, לקחנו את כל התמונות ברמה של השליכה הגדולה (GC, איור 2 א), אשר הכילה רק סעיף אחד או שתיים. הואיל ואנו לא לזהות היווצרות vacuole ב 1 יום בן SWS ^'1 זבובים (מידע לא מוצג), אלל הפסד של פונקציה ^35, כמה vacuoles היו i לזיהויn 7 ימים בת SWS ^'1 זבובים (ראשי חץ, איור 2 א). הזדקנות הזבובים עד 14 ד (תרשים 2B) ו -21 ד (איור 2 ג) ובנוסף הרחיבו פנוטיפ זה, מראה הפרוגרסיביות שלה. ספירת מספר vacuoles ב neuropil deutocerebral (DN) בשיטה המתוארת אישר עלייה משמעותית במספר של vacuoles עם הגיל. כמו כן, השטח המשותף הקיף ידי vacuoles הוגדל באופן משמעותי עם ההזדקנות (איור 2 ד).

עם זאת, לא כל המוטציות להראות כזה פנוטיפ חמור כמו SWS, ובמקרים אלו, הבדלי ניוון קשים לקבוע מתי התמקדות על שטח קטן. באופן דומה, ניוון המתרחשת במהלך ההזדקנות הוא די מתון (איור 3 א - ג) ולכן, ניתחנו את כל המוח כאשר לכימות פנוטיפ זה. קביעת הסכום של כל vacuoles במוח גילהעלייה משמעותית עם הגיל, וזה היה גם במקרה כאשר מודדים השטח המשותף של vacuoles אלה (איור 3D).

איור 1. סעיפים סידוריים פרפין. א) שימוש בשיטת הצווארון, זבובים הניסיונות ושליטה יכולים להיות מעובד כמו דגימה אחת על ידי משחיל אותם אל תוך צווארון אחד. זבובי oculis סינוס חסרי עיניים מוכנסים להתמצאות (חיצים). B) סכמטי המציג את הכיוון של ראשי זבוב בצווארון. C) בתמונה זו, קטעים מתוך ראשי זבוב שונים מכוונים משמאל לימין בשקופית. מלמעלה למטה בשקופית, קטעים סדרו מאותו ראש הזבוב ניתן לראות. במקרה זה, זבוב oculis סינוס הוכנס במיקום שלוש (חץ). הסעיפים הם מוכתמים על ידי הפיגמנט בעין ניאון שוטף על סעיפים לאחר החיתוך. בר סולם ב A = 5 מ"מ וב C = 0.5 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2. מוחיים מתקדמים מוטצית Swiss-הגבינה. סעיף הראש פרפין מ -7-דיי (א), 14-דיי (ב) ו -21-דיי (C) בן SWS ^'1 זבובים. ראשי החץ להצביע על vacuoles שהתפתח עם הזדקנות. ההתנוונות הקשורה לגיל היא לכמת ידי ספירת מספר vacuoles ומדידת האזור המשולב שלהם (D). את SEM ומספר הזבובים נתחו מותווה. סרגל סולם = 25 מיקרומטר. *** P <0.001.csource.jove.com/files/ftp_upload/54809/54809fig2large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3. מוחיים מתרחשים עם גיל. סעיף ראש פרפין מ -10 דיי (א), 30-דיי (ב) ו -60-דיי (C) ישן זבובי wild-type. ראשי החץ להצביע על vacuoles שהתפתח אצל זבובים בגילים. ההתנוונות הקשורה לגיל היא לכמת ידי ספירת מספר vacuoles ומדידת האזור המשולב שלהם (D). את SEM ומספר הזבובים נתחו מותווה. סרגל סולם = 25 מיקרומטר. *** P <0.001. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. </ A>

Discussion

השיטה המתוארת מספק אמצעי לכמת ניוון מוחיים במוח של דרוזופילה. בעוד שיטות אחרות, כמו לספור לסוג תא מסוים, שניתן להשתמש בהם כדי לזהות ניווניות של מערכת העצבים, את היתרון של שיטה זו הוא כי זה יכול להיות מיושם באופן כללי יותר. ספירת תאים דורשת כי תאים אלה יכולים להיות מזוהים באופן מהימן או באמצעות נוגדן ספציפי או הביטוי של סמן תא ספציפי, וזה לא תמיד זמין. יתר על כן, הוכח כי תוצאות שונות באופן דרמטי ניתן להשיג את השיטה ^24, ככל הנראה בשל תנאי המשמש תיוג לצורך זיהוי. שיטה נוספת כדי לזהות תאי מתנוונת היא השימוש סמני מוות של תאים, כמו caspase אנטי מופעל 3. עם זאת, זה רק מזהה תאים העוברים מוות תאי פעיל ופעם התאים מתו, הם כבר לא ניתן לגילוי. יתרון נוסף של השיטה המוצעת כאן הוא שאף מכתים נדרש בשל autofluorescence הנגרם על ידי הפיגמנט בעין, אשר חוסך זמן וממזער חפצים הנגרמים על ידי שינויים בתנאים המכתימים. חשוב לציין כי, בעת שימוש בשיטה זו, בעיני זבובים יש מספיק פיגמנט להכתים את השקופית. אם צבע העיניים בהיר מדי, הוסיף כמה wild-type זבובים אל הצווארון יהיה רצוי להבטיח מספיק ואפילו מכתים פני השקופיות. יתרון נוסף של שיטה זו הוא כי באזורים מרובים יכולים להיבחן, אפילו באותו הראש. למרות שאנו לא מראים הנתונים, השתמשנו סעיפים אלה לבחון ניווניות של מערכת העצבים בהפסד תא הרשתית גליה בקליפת lamina ^30,36. כפי שתואר כאן, שיטה זו מספקת סעיפים אופקיים, אלא על ידי הפיכת בלוק פרפין ב -90 ° כאשר נמס אותו על החזיק החפץ, אפשר גם להשיג חלקים חזיתיים. לכן, שיטה זו היא הליך צדדי המאפשר למדידה לקבלה המהירה והיעילה של ניוון עצבי במוח הזבוב. בגלל היווצרות של VACuoles נצפתה מודלים לטוס רבים של מחלות ניווניות אנושיות, כולל דגמים למחלת אלצהיימר, פרקינסון, טרשת לרוחב amyotrophic (ALS), ומחלות כתוצאה polyglutamine-חזרות ^16,37-40, שיטה זו יכולה לשמש כדי לכמת פנוטיפים ניווניות מגוון של מודלי מחלה.

בסך הכל, פרוטוקול זה הוא פשוט השלים בקלות ברגע ההתקנה הראשונית של הציוד מתבצעת. כמה הערות לזכור הם לעת את שטיפות אתנול בזהירות כדי למנוע יתר התייבשות של ראשים, לקצץ את אבני פרפין בזהירות כדי לא לאבד חלקים או ראשים, ולא overexpand את הסרט על פני המים כאשר הסליידר הוא על הגוש החום. אם הסרט מותר להרחיב יותר מדי, קורע מראשי הזבוב יכול לגרום ומסדר הראשים ברצועת הכלים יכול ללכת לאיבוד. בנוסף, להיות עיוור כדי גנוטיפ בזמן ביצוע הניתוחים חיוני כדי למנוע הטיה. זו מושגת הטובה ביותר על ידי בעל אדם אחד בהכנת SLIdes ושמירה על רשומות בעוד אדם אחר לוקח את התמונות ואת עושה את המדידות. אחת המגבלות של שיטה זו היא כי הניוון של כמה תאים בלבד יהיה מאוד קשה לזהות. במקרה כזה, כתם מסוים של אוכלוסיית התא המושפעת יהיה אינפורמטיבי יותר. בנוסף, שיטה זו אינה מאפשרת אחד להבחין בין סוגים שונים של מוות של תאים, אשר דורש שיטות ספציפיות יותר, כגון מכתים TUNEL לקבוע מוות של תאים אפופטוטיים. לבסוף, שיטה זו לא ניתן להבדיל בין מוות של תאים וניוון axonal, אשר גם יהיה גלוי כמו vacuoles ב neuropil.

כפי שניתן לראות בתוצאות שלנו, שיטה זו יכולה לשמש כדי לענות על ניוון באזורי מוח ספציפיים או במוח כולו. מניסיוננו, כדאי לנתח אזור מסוים רק כאשר הפנוטיפ הוא די חזק, גם כאשר כל האזורים במוח מושפעים. זה מפחית באופן משמעותי את עומס העבודה אינו משפיע עלתוֹצָאָה. אנחנו במקור ניתחו בכמה תחומים של מוטציה SWS וצפו תוצאות דומות מאוד בהתקדמות של פנוטיפ כאשר משווים רק בתחום אחד בעת ניתוח בכל התחומים (מידע לא מוצג). עם זאת, יש לציין כי אזור בבירור ניתן לזיהוי צריך להיבחר כדי למנוע חפצים בשל הניתוח של אזורים או באזורים שונים ברמות שונות.

לעומת זאת, במקרים בהם פנוטיפ היא מתונה יחסית, עדיף לנתח את המוח כולו, כי הסבירות למצוא vacuoles באזור מסוים הוא נמוך. לדוגמה, זה המקרה בעת קביעת ניווניות של מערכת העצבים הקשורות לגיל, כפי שמוצג באיור 3, שתוצאתה רק 4 - 5 vacuoles במוח כולו בזבובי בן 60 ימים. בספירת vacuoles במוח כולו, יש לקחת בחשבון כי vacuoles הקטן יופיע רק בסעיף אחד, ואילו גדולים יותר ישתרעו על מספר סעיפים. בדבר האחרון, בסמיכות של adjסעיפי acent בעת השימוש בשיטה זו (איור 1) מספקים יתרון נוסף, כי זה בקלות יחסית כדי לקבוע אם אותן vacuole שוהה מספר קטעים.

לסיכום, פרוטוקול זה יכול להיות שימושי עבור לימוד מודלים תסיסנית רבים של מחלות ניווניות שונות. זיהוי חלבוני אינטראקציה כי לשפר או להחמיר את הפנוטיפ ניווניות יכול לספק תובנות חיוניים על המנגנונים שגורמים או לשנות מחלות כגון אלצהיימר ופרקינסון. בפרסום זה, אנו משתמשים בשיטה זו כדי לזהות ניוון כי הוא פרוגרסיבי, שבו החיות להתפתח בצורה תקינה אבל להראות הגדלת ניוון במהלך ההזדקנות. בנוסף, שיטה זו יכולה גם להיות מותאמת כדי לקבוע ניוון אשר נגרם על ידי ליקויים התפתחותיים, אשר אמור להימצא בו בזבובים חדשים eclosed.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the Reagent/Equipment	Company	Catalog Number
Collar	Genesee Scientific	TS 48-100	We are using custom made collars that are made from one piece of metal instead of layers as the ones by Genesee. A description on how to make collars can be found at http://flybrain.neurobio.arizona.edu/Flybrain/html/atlas/fluorescent/index.html
Rubber ice cube tray for embedding	Household store		The size can be made-to-fit by glueing in additional walls
Crystallizing dish	Fisher Scientific company	08-762-3
Ether	Fisher Scientific Company	E138-1
Ethanol	Decon Laboratories Inc.	2701
Choloroform	Fisher Scientific Company	C298-500
Glacial Acetic Acid	Fisher Scientific Company	A38-212
Methylbenzoate	Fisher Scientific Company	M205-500	Distinct Odor - Use in fume hood!
Low Melting Point Paraffin Wax	Fisher Scientific Company	T565	Make sure to keep extra melted in a 65°C waterbath
Microtome	Leica Biosystems	Reichert Jung 2040 Autocut
Microscope Slide	Fisher Scientific Company	12-550D
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific Company	12-545-M
SafeClear	Fisher Scientific Company	314-629	Three different containers for washes
Vertical Staining Jar with Cover	Ted Pella Inc.	432-1
Permount	Fisher Scientific Company	SP15-500
Poly-L-Lysine Solution (PLL)	Sigma Life Science	P8290-500