Summary
Drosophila é amplamente usado como um sistema modelo para estudar a neurodegeneração. Este protocolo descreve um método pelo qual a degeneração, como determinado pela formação de vacúolo no cérebro, podem ser quantificados. Ela também minimiza os efeitos devido ao procedimento experimental por meio de processamento e controlo de moscas e de seccionamento experimentais como uma amostra.
Abstract
doenças neurodegenerativas progressivas como a doença de Alzheimer (AD) ou a doença de Parkinson (DP) é uma ameaça crescente para a saúde humana em todo o mundo. Embora os modelos de mamíferos forneceram importantes insights sobre os mecanismos subjacentes da patogenicidade, a complexidade dos sistemas de mamíferos, juntamente com seus altos custos estão limitando a sua utilização. Portanto, o simples, mas bem estabelecida modelo de sistema de Drosophila fornece uma alternativa para investigar as vias moleculares que são afetados nessas doenças. Além défices comportamentais, doenças neurodegenerativas são caracterizadas por fenótipos histológicos, tais como a morte neuronal e axonopatia. Para quantificar a degeneração neuronal e determinar como ela é afetada por fatores genéticos e ambientais, usamos uma abordagem histológica que é baseado na medição dos vacúolos no cérebro mosca adulta. Para minimizar os efeitos do erro sistemático e comparar diretamente as seções de controle e expmoscas erimental em uma preparação, usamos o método "colar" para cortes de parafina. A neurodegeneração é então avaliada medindo o tamanho e / ou o número de vacúolos que se desenvolveram no cérebro da mosca. Isto pode ser feito concentrando-se em uma região específica de interesse ou analisando todo o cérebro através da obtenção de cortes seriados que se estendem da cabeça completa. Por conseguinte, este método permite um para medir não só a degeneração severa mas também fenótipos relativamente suaves que só são detectáveis em algumas secções, como ocorre durante o envelhecimento normal.
Introduction
Com o aumento da expectativa de vida, doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer ou de Parkinson tornaram-se uma ameaça crescente de saúde para a população em geral. De acordo com os Institutos Nacionais de Saúde, 115 milhões de pessoas em todo o mundo estão previstos para ser afetada pela demência em 2050. Embora um progresso significativo tem sido feito na identificação de genes e fatores de risco envolvidos em pelo menos algumas dessas doenças, para muitos deles, o subjacente mecanismos moleculares ainda são desconhecidos ou não bem compreendida.
Simples organismos modelo de invertebrados como Caenorhabditis elegans e Drosophila melanogaster oferecem uma variedade de vantagens experimentais para estudar os mecanismos de doenças neurodegenerativas, incluindo um ciclo de vida curta, grande número de descendentes, e da disponibilidade de métodos genéticos e moleculares bem estabelecidas e, por vezes únicas 1 -12. Além disso, estes organismos são passíveis de imparcialtelas de interação que podem identificar fatores que contribuem para estas doenças por seus efeitos agravantes ou melhorar em fenótipos neurodegenerativas.
Analisar tais interações genéticas e avaliar os efeitos do envelhecimento requer protocolos quantitativos para detectar neurodegeneração e medir a sua gravidade. Esta avaliação pode ser feita de forma relativamente fácil quando se mede aspectos comportamentais em Drosophila, como a aprendizagem olfactiva, geotaxis negativos, ou fototaxia rápido, que fornecem um valor de desempenho numérico 13-21. É também possível determinar os efeitos sobre a sobrevivência neuronal contando os neurónios. No entanto, isso só é possível quando o foco em uma população específica que é claramente identificável, como os neurónios dopaminérgicos que são afectados na doença de Parkinson, e mesmo assim, os resultados têm sido controversos 22-24.
O protocolo aqui descrito utiliza o método de colar para realizar cortes seriados de parafina, um métodoque foi originalmente desenvolvido por Heisenberg e Böhl, que o usou para isolar mutantes cerebrais anatômicas em Drosophila 25. A utilização do método de colar foi subsequentemente adaptado, incluindo em criocortes, vibratome secções, e secções de plástico 26-28. Aqui, este método é empregue para obter secções em série de toda a cabeça da mosca, que pode então ser utilizado para medir os vacúolos que se desenvolvem em moscas com fenótipos 16,21,29-32 neurodegenerativas. Estas medições podem ser feitas em regiões específicas do cérebro, ou pode cobrir todo o cérebro; esta última abordagem permite um para identificar os fenótipos fracos mesmo degenerativas, como observado durante o envelhecimento. Finalmente, quando se utiliza os colares, até 20 moscas pode ser processada como uma preparação, que não só é menos demorado, mas também permite a análise de controlo e as moscas experimentais na mesma preparação, minimizando artefactos devido a ligeiras alterações na a preparação.
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Protocol
1. Fixação da cabeça em coleiras e inclusão em parafina
Nota: Todos os passos no processo de fixação deve ser feito numa hotte. Metilbenzoato, embora não representam um risco para a saúde, tem um odor altamente distinta, que pode ser avassaladora se não for tratado em um exaustor.
- Antes de anestesiar as moscas, fazem-se 50 ml de solução de Carnoy por adição de 15 ml de clorofórmio e 5 ml de ácido acético glacial e 30 mL de etanol a 99% (não se misturam o clorofórmio e ácido acético). Derramá-lo num recipiente de vidro com um fundo plano, tal como um prato cristalizadas, para garantir que os colares podem estabelecer plana e são completamente cobertas com a solução.
- Anestesiar as moscas com CO 2 ou éter.
- moscas de rosca (até 20 com a maioria dos colares) por seus pescoços para os colares usando uma pinça. Recorde para alinhar todos os cabeças com a mesma orientação, como pode ser visto na Figura 1A, e ser suave para assegurar que não se verifiquem danos na cabeça ou olhos.
- Incluir moscas seno Oculis (setas, Figura 1A) em posições aleatórias para que a ordem das moscas podem ser facilmente identificados nas secções. Além disso, se as moscas experimentais têm uma cor branca ou clara do olho, passe algumas moscas de olhos vermelhos, tais como o tipo selvagem, entre elas para assegurar que o pigmento está presente suficiente para corar a corrediça. Grave a ordem das moscas sobre a folha de protocolo em conjunto com o número colar se utilizar mais do que um anel.
- Uma vez que um colar foi terminado, colocá-lo em solução de Carnoy preparado para 3,5-4 h.
- Despejar a solução Carnoy dentro do recipiente eliminação adequada e começar as lavagens de etanol. Certifique-se lentamente para derramar, de modo a não perturbar a colocação dos colares no recipiente.
- Lavar os colares durante 30 min em 99% de etanol duas vezes.
- Lavar os colares em 100% de etanol durante 1 h. Certifique-se de alterar as lavagens a tempo para evitar overdehydration.
- Coloque os colares em metilbenzoatoO / N à temperatura ambiente. Fecha-se o recipiente com parafilme para evitar a evaporação do metilbenzoato.
- Verter a methylbenozate para dentro do recipiente descartável adequado na hotte. Adicionar uma mistura previamente preparada de 1: 1 de baixo ponto de fusão (56-57 ° C), cera de parafina e metilbenzoato de metilo. A partir deste ponto, os colares devem ser mantidas numa incubadora a 65 ° C para se certificar de que a parafina não endurece.
- Deite a mistura de parafina e methylbenozate para dentro do recipiente descartável adequado, e derramar a cera de parafina puro fundido, mantido a 65 ° C, para os colares.
- Alterar a parafina depois de 30 min e repita este pelo menos 5 vezes. Pelo menos 6 - 8 lavagens devem ser executadas.
- Uma vez que as lavagens são completos, coloque os colares em uma bandeja de cubos de gelo de borracha com ranhuras de aproximadamente o tamanho dos colares. Despeje parafina derretida sobre eles até que esteja completamente coberto e deixe-a endurecer O / N (tentar evitar bolhas de ar).
- Remova os blocos de parafina containing os colares da bandeja de cubos de gelo. Separa-se o bloco de parafina a partir da gola utilizando uma lâmina de barbear, suavemente romper o colar. As cabeças estará no bloco de parafina ao passo que os corpos vão ficar na gola. Os blocos podem ser mantidos à temperatura ambiente.
- Para limpar os colares, mergulhe-os em um agente desparafinização a 65 ° C para remover a parafina, limpo esfregando-se ligeiramente, e lave em etanol antes de reutilizar.
2. corte e montagem
- Aquecer uma placa de aquecimento a 50 ° C. Coloque os titulares objeto (ou blocos de montagem de metal) e lâminas de barbear sobre a placa e deixá-los aquecer.
- Dependendo da orientação desejada para a secção transversal, e anexar o bloco de parafina, quer com as cabeças para o lado (para secções horizontais) ou virada para cima (para secções frontais) a um bloco de montagem aquecida (derretendo brevemente o bloco no lado do contacto). Remover o bloco da placa de aquecimento e deixe-o esfriar por pelo menos 10 min para assegurar que a parafina é endurecido o suficiente para uma vedação adequada para o bloco de montagem. Manter a fila de cabeças alinhadas em paralelo com a superfície do bloco, tanto quanto possível para evitar desnivelamentos.
- Pegue uma lâmina de barbear e aparar o excesso de parafina longe das cabeças de mosca de modo que apenas uma pequena fila com os chefes incorporados permanece (a lâmina de barbear pode ser aquecido para corte mais fácil). Certifique-se de não cortar muito para que a parafina não quebra durante o corte (mais corte pode ser feito durante o corte).
- Colocar o bloco de montagem no suporte do objecto do micrótomo e assegurar que o alinhamento da fila de cabeças é tão paralela quanto possível da aresta da lâmina.
- Preparar lâminas de microscópio, cobrindo-os com uma camada fina de-L-lisina de poli (PLL) solução e deixar secar durante 5 min. Cubra-os com água imediatamente antes da utilização.
- Cortar 7 uM secções e transferir a fita de secções para a corrediça que flutua na água. <br /> NOTA: Para obter o cérebro inteiro para seções horizontais, recolhemos a fita de quando iniciar o corte no olho até que a cabeça foi completamente cortado (corte a partir a tromba para dentro do cérebro). Mais de um slide pode ser necessário para toda a cabeça.
- Colocar a lâmina numa placa de calor a 37 ° C e permitir que a fita para expandir durante cerca de 1 min.
- Retire o excesso de água (por vazamento-lo ou usando um tecido) e secar a diapositivos O / N.
- Remover a cera de parafina a partir do slide, colocando os diapositivos numa altura, vertical frasco deslizante de coloração com um agente desparafinização (cobrindo completamente as secções). Realizar 3 lavagens de 30 min - 60 min cada.
- Remover o slide da lavagem final. Coloque 2 gotas de meios de incorporação para o slide e cobri-lo com uma lamela grande.
3. fotografando e analisando as Secções
- Permitir que as lâminas preparadas para secar por 1-2 d. Em seguida, examiná-los em um microsc fluorescênciaope sob a luz azul.
- Utilize uma ampliação menor para determinar a orientação das moscas e para encontrar a região de interesse se concentrando-se em uma região específica.
NOTA: Para as moscas SWS (ver Figura 2), encontramos a seção que contém a grande comissura e tomar uma imagem (geralmente em 40X). Ao analisar todo o cérebro (como na Figura 3), que percorrer todas as secções de uma cabeça e quer fotografar a secção com o fenótipo mais grave ou todas as secções que mostram vacúolos. - Para uma análise duplo-cego, tomar e imagens numéricas sem saber o genótipo e anote o número colarinho e posição da cabeça na linha de identificá-los mais tarde.
- Depois que as imagens foram tomadas, analisá-los usando um software de imagem.
- Contar o número de vacúolos por secção ou por cabeça. Para medir o tamanho vacúolo, abrir as imagens em um programa de software e selecionar os vacúolos com uma seleção muitoeu. Determinar a quantidade de pixels nos vacúolos seleccionados.
- Para a conversão para mm 2, tirar uma foto de um slide de calibração estágio micrômetro na ampliação usada para a aquisição de fotos. Determinar a quantidade de pixels em 100 uM 2 para calcular um factor de conversão.
- Converter o número total de pixels em 2 uM dividindo o número de pixels de acordo com o factor de conversão calculado no passo acima.
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Representative Results
Usando os resultados do método descrito em cortes seriados corados pelo pigmento do olho 33, que abrangem toda a cabeça da mosca. Uma parte desta é mostrado na Figura 1B, em que as secções de uma cabeça individual são mostrados de cima para baixo. As secções de diferentes moscas são vistos esquerda para a direita neste exemplo. Para facilitar a orientação e a identificação das moscas, de uma mosca sem olhos (oculis seno) é inserido como um marcador na posição 3 (seta, Figura 1B).
Para quantificar a neurodegeneração, medimos a formação de vacúolos, que podem ser detectadas nestas secções. Vacúolos são definidos como redonda, manchas escuras que estão dentro do neuropil fluorescente verde (pontas de seta na figura 2 e 3) ou córtex e que são visíveis em pelo menos 2 secções consecutivas do cérebro da mosca. Quantificar neurodegeneração porvacúolos de medição pode ser feito concentrando-se em uma região específica do cérebro ou analisando o cérebro inteiro. Limitando a análise para uma região específica do cérebro é útil nos casos em que uma mutação só afecta uma região específica, como os lóbulos olfactivas na futsch 'OLK mutante 34, mas também pode ser utilizado quando há degeneração severa em todos ou muitos regiões do cérebro. Um exemplo para o último é o mutante de queijo suíço (SWS) (Figura 2), em que todos os vacúolos de medição seria muito demorado. Por isso, teve apenas uma imagem e, para garantir que as medições foram realizadas sempre ao mesmo nível, tomámos todas as imagens ao nível do grande comissura (GC, Figura 2A), que só está contido em uma ou duas secções. Considerando que não se detectou a formação de vacúolo em 1 moscas 'SWS 1 dia de idade (dados não mostrados), um alelo 35 por perda de função, alguns vacúolos estavam i detectável1 moscas n 'SWS 7 dias de idade (setas, Figura 2A). Envelhecimento as moscas a 14 d (Figura 2B) e 21 d (Figura 2C) aumentou ainda mais esse fenótipo, mostrando sua natureza progressiva. Contar o número de vacúolos na neurópilo deutocerebral (DN) usando o método descrito confirmou um aumento significativo no número de vacúolos com a idade. Além disso, a área combinada englobados pela formação de vacúolos foi aumentada significativamente com o envelhecimento (Figura 2D).
No entanto, nem todos os mutantes mostram um fenótipo tão grave como SWS, e nesses casos, as diferenças na degeneração são difíceis de determinar quando o foco sobre uma pequena área. Da mesma forma, a degeneração que ocorre durante o envelhecimento é muito leve (Figura 3A - C) e, por conseguinte, analisamos o cérebro inteiro ao quantificar este fenótipo. Determinando a soma de todos os vacúolos no cérebro revelaramum aumento significativo com a idade, e este foi também o caso quando se mede a área combinada desses vacúolos (Figura 3D).
Figura 1. parafina cortes seriados. A) Usando o método colarinho, moscas experimentais e de controle pode ser processado como uma amostra enfiando-os em um colar. São inseridos sem olhos moscas Oculis seno para orientação (setas). B) Esquema mostrando a orientação das cabeças de mosca no colar. C) Nesta imagem, as secções de diferentes cabeças de mosca são orientados esquerda para a direita no slide. De cima para baixo no slide, cortes seriados da mesma cabeça mosca pode ser visto. Neste caso, uma mosca oculis seno foi inserido na posição três (seta). As secções são coradas pelo pigmento olho fluorescente que lava sobre a seções após o corte. A barra de escala em A = 5 mm e em C = 0,5 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Progressive neurodegeneração no mutante Swiss-queijo. Secção da cabeça de parafina a partir de 7 dia- (A), 14-dia-(B) e 21-dia- 'SWS (C) idade 1 moscas. As pontas de seta apontam para vacúolos que se desenvolveram com o envelhecimento. A degeneração relacionada com a idade é quantificada por contagem do número de vacúolos e medição da sua área combinada (D). A MEV e o número de moscas analisadas está indicado. A barra de escala = 25 um. *** P <0,001.csource.jove.com/files/ftp_upload/54809/54809fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. neurodegeneração ocorre com a idade. Secção da cabeça de parafina de 10-dia-(A), 30-dia-(B) e 60-dia- (C) idade do tipo selvagem moscas. As setas apontam para vacúolos que se desenvolveram em moscas envelhecidas. A degeneração relacionada com a idade é quantificada por contagem do número de vacúolos e medição da sua área combinada (D). A MEV e o número de moscas analisadas está indicado. A barra de escala = 25 um. *** P <0,001. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. </ A>
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Discussion
O método descrito fornece um meio para quantificar a neurodegeneração no cérebro de Drosophila. Enquanto que outros métodos, tais como contagem de um tipo celular específico, pode ser usado para identificar a neurodegeneração, a vantagem deste método é que ele pode ser aplicada de modo mais geral. Contar as células requer que estas células podem ser identificadas com fiabilidade utilizando quer um anticorpo específico ou a expressão de um marcador específico de células, a qual não está sempre disponível. Além disso, foi demonstrado que os resultados dramaticamente diferentes podem ser obtidas com este método 24, presumivelmente devido às condições utilizadas para a marcação e para a detecção. Outro método para detectar células em degeneração é a utilização de marcadores de morte celular, como anti-activada de caspase 3. No entanto, isto só identifica células que sofrem activamente morte celular e uma vez que as células morreram, eles não são detectáveis. Outra vantagem do método proposto aqui é que nenhuma coloração é necessária devido ao autofluorescence causada pelo pigmento do olho, o que poupa tempo e minimiza artefactos causados por mudanças nas condições de coloração. É importante notar que, quando se utiliza este método, os olhos das moscas têm pigmento suficiente para manchar o slide. Se a cor dos olhos é muito clara, adicionando um pouco de tipo selvagem voa para a gola seria aconselhável para assegurar suficiente e até mesmo manchas em todo o slide. Uma vantagem adicional deste método é que várias zonas pode ser examinada, mesmo na mesma cabeça. Apesar de não mostrar os dados, usamos essas seções para examinar a neurodegeneração na perda de células da retina e células gliais no córtex lamina 30,36. Conforme descrito aqui, este método proporciona secções horizontais, mas rodando o bloco de parafina por 90 ° ao derreter-lo no suporte do objecto, pode-se também obter secções frontais. Assim, este método é um processo versátil que permite a medição rápida e eficiente de morte neuronal no cérebro da mosca. Porque a formação de Vacuoles tem sido observado em muitos modelos de mosca de doenças neurodegenerativas humanas, incluindo modelos para a AD, PD, Esclerose Lateral Amiotrófica (ALS), e doenças causadas por poliglutamina-unidades de repetição 16,37-40, este método pode ser usado para quantificar os fenótipos neurodegenerativas nas uma variedade de modelos de doenças.
No geral, este protocolo é simples e facilmente concluída uma vez que a configuração inicial do equipamento é realizada. Algumas notas para manter em mente são a tempo com cuidado as lavagens de etanol para evitar o excesso de desidratação das cabeças, para aparar cuidadosamente os blocos de parafina de modo a não perder seções ou cabeças, e não se expandem exageradamente a fita na água quando o slide é no bloco de calor. Se a fita pode se expandir muito longe, arrancando das cabeças de mosca pode resultar e a ordem das cabeças na fita pode ser perdida. Além disso, ser cego para o genótipo ao fazer as análises é essencial para evitar viés. Este é o melhor alcançado por ter uma pessoa a preparar a SLIdes e manter os registros, enquanto outra pessoa está tomando as imagens e fazer as medições. Uma das limitações do presente método é que a degeneração de apenas algumas células vai ser muito difícil de detectar. Nesse caso, uma coloração específica da população afectada de células seria mais informativa. Além disso, este método não permite uma para distinguir entre diferentes tipos de morte celular, o que exige métodos mais específicos, tais como uma coloração TUNEL para determinar a morte celular por apoptose. Finalmente, este método não é possível diferenciar entre a morte celular e a degeneração axonal, o que também seria detectável como vacúolos no neurópilo.
Como mostrado nos nossos resultados, este método pode ser usado para tratar a degeneração em áreas específicas do cérebro ou em todo o cérebro. Na nossa experiência, é útil para analisar apenas a uma área específica quando o fenótipo é bastante forte, mesmo quando todas as regiões do cérebro são afectados. Isto reduz significativamente a carga de trabalho e não afecta oresultado. Nós originalmente analisadas várias áreas no mutante SWS e observados resultados muito semelhantes na progressão do fenótipo quando comparando apenas uma zona e ao analisar todas as áreas (dados não mostrados). No entanto, deve notar-se que uma região claramente identificáveis devem ser escolhidos para evitar artifícios devidos à análise de diferentes zonas ou áreas a diferentes níveis.
Em contraste, nos casos em que o fenótipo é relativamente leve, é melhor analisar todo o cérebro, porque a probabilidade de encontrar vacúolos numa região específica é baixa. Por exemplo, este é o caso para determinar neurodegeneração relacionada com a idade, tal como mostrado na Figura 3, o que resulta em apenas 4-5 vacúolos em todo o cérebro de moscas 60 dias de idade. Ao contar vacúolos em todo o cérebro, tem de se ter em conta que os pequenos vacúolos só vai aparecer em uma seção, enquanto os maiores se estenderá por várias secções. Em relação a este último, a proximidade de adjsecções Acent quando se utiliza este método (figura 1) proporciona uma outra vantagem, uma vez que é relativamente fácil para determinar se a mesma vacúolo está presente em várias secções.
Em conclusão, este protocolo pode ser útil para o estudo de muitos modelos de Drosophila de diferentes doenças neurodegenerativas. Identificação de proteínas que interagem que melhoram ou agravar o fenótipo degenerativa pode fornecer informações cruciais sobre os mecanismos subjacentes que causam ou modificar doenças como Alzheimer e Parkinson. Nesta publicação, usamos este método para detectar a degeneração que é progressiva, onde os animais se desenvolvem normalmente, mas mostram aumento degeneração durante o envelhecimento. Além disso, este método também pode ser adaptado para determinar a degeneração que é causada por defeitos do desenvolvimento, que já deve estar presente em moscas recém-eclosed.
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Disclosures
Os autores não têm nada para revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of the Reagent/Equipment | Company | Catalog Number | |
| Collar | Genesee Scientific | TS 48-100 | We are using custom made collars that are made from one piece of metal instead of layers as the ones by Genesee. A description on how to make collars can be found at http://flybrain.neurobio.arizona.edu/Flybrain/html/atlas/fluorescent/index.html |
| Rubber ice cube tray for embedding | Household store | The size can be made-to-fit by glueing in additional walls | |
| Crystallizing dish | Fisher Scientific company | 08-762-3 | |
| Ether | Fisher Scientific Company | E138-1 | |
| Ethanol | Decon Laboratories Inc. | 2701 | |
| Choloroform | Fisher Scientific Company | C298-500 | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher Scientific Company | A38-212 | |
| Methylbenzoate | Fisher Scientific Company | M205-500 | Distinct Odor - Use in fume hood! |
| Low Melting Point Paraffin Wax | Fisher Scientific Company | T565 | Make sure to keep extra melted in a 65°C waterbath |
| Microtome | Leica Biosystems | Reichert Jung 2040 Autocut | |
| Microscope Slide | Fisher Scientific Company | 12-550D | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific Company | 12-545-M | |
| SafeClear | Fisher Scientific Company | 314-629 | Three different containers for washes |
| Vertical Staining Jar with Cover | Ted Pella Inc. | 432-1 | |
| Permount | Fisher Scientific Company | SP15-500 | |
| Poly-L-Lysine Solution (PLL) | Sigma Life Science | P8290-500 |
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