Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Optogenetic mutagenesis אקראי באמצעות היסטון-miniSOG ב Published: November 14, 2016 doi: 10.3791/54810
Automatic Translation
1, 1,2
1Division of Biological Sciences, Section of Neurobiology, University of California in San Diego and Howard Hughes Medical Institute, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, University of California in San Diego School of Medicine and Howard Hughes Medical Institute

Summary

גנטי בקידוד היסטון-miniSOG גורם מוטציות תורשתי הגנום כולו באופן אור תלוי כחול. שיטת mutagenesis זה היא פשוטה, מהירה, ללא כימיקלים רעילים, מתאים היטב סריקה גנטית קדימה ואינטגרציה transgene.

Introduction

מסך גנטי קדימה כבר בשימוש נרחב כדי ליצור מוטציות גנטיות לשבש תהליכים ביולוגיים שונים באורגניזמים מודל כגון elegans Caenorhabditis (ג elegans) 1. ניתוח של מוטציות כאלה להוביל לגילוי של גנים חשובים מבחינה תפקודית והאיתות שלהם מסלולי 1,2. באופן מסורתי, mutagenesis ב C. elegans מושגת באמצעות כימיקלים מוטגנים, קרינה, או transposons 2. כימיקלים כגון methanesulfonate אתיל (EMS) ו- N -ethyl- -nitrosourea N (ENU) הם רעילים לבני אדם; קרני גאמא או אולטרה סגול (UV) mutagenesis קרינה דורש ציוד מיוחד; זני transposon-פעיל, כגון זנים המוטטורי 3, יכולים לגרום מוטציות מיותרות במהלך תחזוקה. פיתחנו גישה פשוטה לגרום מוטציות תורשתיות באמצעות פוטוסנסיטייזר גנטית בקידוד 4.

(Reactive oxygen species ROS) יכול לגרום נזק לדנ"א 5.מחולל חמצן גופיה מיני (miniSOG) הוא חלבון פלואורסצנטי ירוק של 106 חומצות אמינו כי תוכננה מן LOV (אור, חמצן, ואת מתח) תחום של ארבידופסיס phototropin 2 6. בחשיפה לאור כחול (~ 450 ננומטר), miniSOG מייצר חמצן גופיית ROS כולל עם fl יבין mononucleotide בתור פקטור 6-8, אשר שוהה בכל התאים. בנינו חלבון היתוך-mSOG שלו על ידי תיוג miniSOG אל C- הסופי של היסטון-72, ג elegans וריאנט של היסטון 3. אנחנו שנוצר transgene חד עותק 9 להביע-mSOG שלו ב germline של ג elegans. בתנאי תרבות נורמלים בחושך, התולעים המהונדסים-mSOG שלו יש גודל גוזלים נורמלי תוחלת חי 4. בחשיפה לאור LED כחול, התולעים שלו-mSOG לייצר מוטציות תורשתיות בקרב הצאצאים שלהם 4. הספקטרום של מוטציות מושרות כולל שינויי נוקלאוטיד, כגון G: C ל- T: A ו- G: C ל- C: G ו- chromoso הקטןלי מחיקות 4. הליך mutagenesis זה הוא פשוט לביצוע, ודורש התקנת בטיחות במעבדה מינימאלית. כאן, אנו מתארים את התקנת תאורת LED ונהלי mutagenesis optogenetic.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. בנייה של ה- LED הפנס

הערה: ציוד LED הנדרש מסוכם הרשימה של חומרים. ההתקנה LED כולו הוא קטן והוא יכול להיות ממוקם בכל מקום במעבדה, אם כי מומלץ להשתמש בו יוצב בחדר חשוך לשלוט חשיפה לאור של תולעים 4.

  1. חבר את LED לבקר עם כבלים (איור 1 א, ד).
  2. חבר את בקר מגבר גנרטור / פונקציה דיגיטלי באמצעות כבל BNC (איור 1 א ', ג', ד).
  3. תקן 10 ס"מ הנורית מעל לבמה בעזרת בעל מותאם אישית (איור 1 א).
    הערה: עשינו בעל עם חלקי מתכת.
  4. מכסה את התקנת תאורת LED חלקית, אבל למנוע הצטברות חומה (איור 1 ב '), מה שהופך תולעים חולים.
    הערה: אנו משתמשים כיסוי פלסטיק קשיח מחוייט עם העליון פתוח והתחתון (איור 1 א). הכיסוי אינו נדרש עבור mutagenesis עצמו, אך משמש to להגביל את החשיפה המיותרת של האור הכחול אל הסביבה. אנו ממליצים לא לכסות את התקנת LED לחלוטין (איור 1B) כדי למנוע התחממות יתר של התולעים.
  5. יש להרכיב משקפיים בלייזר-מגן.
    הערה: אנו להרכיב משקפיים בלייזר-מגן מפני שהאור הוא בהיר מאוד. משקפי שמש יפעלו גם כן.
  6. החלף את הידית של הבקר LED ל 'Int.' עבור תאורה רציפה (1D איור) ולהגדיר אותו ב 65% של הכוח המרבי (תרשים 1C).
  7. השתמש פוטומטר כדי למדוד את עוצמת האור הכחולה על הבמה שבו התולעים ממוקמים באמצעות הפרוטוקול של היצרן. ההתקנה נותנת 2.0 mW / 2 מ"מ תחת תאורה רציפה.

2. טיפול תכלת

הערה: השתמש זן CZ20310 juSi164 [Pmex-5-HIS-72 :: miniSOG-3'UTR (TBB-2) + CB-UNC-119 (+)] UNC-119 (ed3) III 4 זן זמין. במרכז גנטיקה Caenorhabditis (CGC, http: //www.cgc.cbs.umn.edu/).

  1. שמירה על זן-mSOG שלו בחושך על מדיום הגידול נמטודות סטנדרטי (NGM) צלחות עם E. coli OP50 בא פרוטוקול סטנדרטי 10,11.
    הערה: תחת אור הסביבה, זנים המכילים juSi164 אינם מציגים שיעור מוטציות מעל שיעור ספונטני 4. מעבר למתח שיגרתי באמצעות היקף ניתוחים עם מנורת הלוגן בדרך כלל אינו גורם מוטציות גם כן. עם זאת, יש להיזהר כדי למנוע חשיפה מיותרת לאור, למשל, שמירה על זני חממה כהה בתוך סטנדרטית, או כיסוי הזנים עם רדיד. מומלץ להקפיא aliquots של המתח לאחר שקיבל אותה במקרה מיותר מוטציות לצבור לאורך זמן.
  2. פיק הרה להולדת מבוגרים צעירים (כ 12 שעות לאחר-L4) חיות עם תולעת לאסוף 11.
    הערה: בעלי חיים צעירים להראות פחות מוטגנים אפקט 4, בעוד בעלי חיים מבוגרים יכולים להיות גודל גוזלים נמוך.
  3. חותכים p מסנןaper כדי להתאים צלחת 60 מ"מ עם 25 מ"מ x 25 מ"מ חור מרובע ומניחים על צלחת unseeded (איור 1E).
    הערה: אגרוף מרובע ניתן להשתמש אך בגודל של אגרוף לא חייב להיות מדויק.
  4. זרוק 100 μL של 100 מ"מ CuCl 2 על נייר הסינון שווה להגביל תולעים בתוך החור המרובע על הצלחת.
  5. פיק מספר רצוי של הרמפרודיטים מבוגרים צעירים הרה להולדת (ראה שלב 3 עבור דוגמא) ולהעביר למרכז הצלחת 2 CuCl.
  6. יש להרכיב משקפיים בלייזר מגן.
  7. להדליק את הנורית ואת מחולל פונקציה.
  8. החלף את הידית של בקר LED ל 'שלוחה.' כדי לשלוט בו על ידי מחולל אותות (1D איור).
  9. הגדר את בקר ב 65% של הכוח המרבי ואת מחולל פונקציה כמו גל סינוס, 4 הרץ (תרשים 1C).
  10. מניחים את הצלחת 2 CuCl משלב 2.5 ללא מכסה על הבמה תחת LED (איור 1 א </ Strong>).
  11. להאיר את החיות עם אור כחול עבור 30 דקות.
  12. העבר מחפשים תולעים בריאים לצלחת זורעי ע 0.
    הערה: המספר הרצוי של P 0 תלוי בסוג של המסך. ראה שלב 3 עבור דוגמה. תולעי P 0 עשויים להיראות חסר קואורדינציה מייד לאחר טיפול אור יתאוששו לאורך זמן.
  13. שמור תולעים המכוסים באמצעות רדיד באינקובטור או בחושך; ופעל לפי הנוהל המקובל להתחיל הקרנה פנוטיפים רצוי בקרב הצאצאים שלהם 2,10.

דוגמא 3. של מסך גנטי קדימה

הערה:. זוהי דוגמא של המסך המשובט עם 120 גנומים הפלואידים לבדוק אם LED והמתח עובדים איור 2 מראה סכמטי של ההליך.

  1. [Day1] לאחר טיפול באור כחול, לאסוף חמישה תולעים ובריאים לצלחת NGM עם OP50 כמו P 0, לשמור אותם בתוך חממת 20 ° C, ולתת להם להטיל ביצים עבור 1ד (צלחת 'Day1').
  2. [יום 2] העברת P 0 לצלחת חדשה זורעת (הצלחת 'יום 2').
  3. [Day3] פיק ולהרוג P 0 על הצלחת 'יום 2' על ידי שריפת אותם.
  4. [Day4] פיק 30 בוגרים צעירים הרה להולדת F 1 מהצלחת 'Day1' ולהעבירם לצלחות בודדים (30 צלחות F 1 עבור 'Day1').
  5. [Day5] חזור על שלב 3.4 עבור הצלחת 'יום 2' (30 F 1 צלחות עבור 'יום 2').
  6. [Day7-9] בדוק את מורפולוגיות ו / או התנהגות חריגה של F 2 תולעים בהשוואה לזן WT (איור 3 א) תחת סטראו רגיל כאשר הם הופכים למבוגרים.
    הערה: מציג מוטציה תורשתית כרבע תולעים עם אותו הפנוטיפ בין F 2 כאשר הוא רצסיבי עם חדירות גבוהות. עם זאת, כמה מוטציות עשויות לגדול לאט ו / או להציג חדירות חלקיות. לכן, יתכן כי פחות מרבע של מוטציות ניתן למצוא עלצַלַחַת.
  7. פיק תולעים עם פנוטיפים גלויים בנפרד ולבדוק התורשתיות של הפנוטיפ בדור הבא.

דוגמה 4. של אינטגרציה extrachromosomal transgene

  1. להזריק את ה- DNA של עניין לתוך CZ20310 juSi164 [Pmex-5-HIS-72 :: miniSOG-3'UTR (TBB-2) + CB-UNC-119 (+)] UNC-119 (ed3) ולהכין תולעים מהונדס עם שיעור התמסורת נמוך (10-30%) בעקבות 12,13 פרוטוקול זריקה רגילה.
    הערה: לחלופין, מערכי extrachromosomal הוקמו ניתן חצו לתוך זני juSi164. כדי למנוע גנוטיפ עבור juSi164, heterozygotes juSi164 עשוי לשמש P 0 אם כי היעילות להצטמצם. שיטת גנוטיפ עבור juSi164 מתואר בסעיף 5.
  2. [Day1] פנקו ~ 20 חיות טרנסגניות ע 0 עם אור כחול כמתואר שלב 2.
    הערה: תולעי P 0 פרטים נוספים נחוצים תלוי tr שיעור ansmission. Transgenes ניתן לזהות על ידי פנוטיפים או coinjection סמן 12,13.
  3. פיק 10 מחפש P 0 בריא לצלחות פרט, לשמור אותם בתוך חממת C 20 °, ולתת להם להטיל ביצים במשך כמה ימים (P 0 צלחות)
  4. [Day4] יחיד מתוך 20 מהונדס F 1 תולעים מכל צלחת P 0 לצלחות הפרט ולתת להם להטיל ביצים. (20 F 1 x 10 P 0 צלחות = 200 F 1 צלחות בסך הכל.)
  5. [יום 7 ג] מצא F 1 צלחות עם> 75% F 2 transgenes שיש.
  6. פיק חמש חיות טרנסגניות משיעור העברת 75%> F 1 צלחות (F 2 צלחות).
  7. [Day10] שמור F 2 צלחות עם שיעור תמסורת 100% כקווים משולבים פוטנציאליים.
  8. Outcross הקווים פוטנציאל המשולבים באמצעות הליך סטנדרטי 10 לבדוק את פרדת מנדל וכדי להסיר מוטציות רקע פוטנציאליות.
le "> 5. Genotyping

  1. Lyse 20 outcrossed F 2 תולעים חיץ תמוגה באמצעות פרוטוקול סטנדרטי 14.
  2. בצע PCR באמצעות פריימרים עבור MosSCI הכנסת 9, juSi164, (טבלה 1) עם טמפרטורה חישול של C ° 58 בעקבות פרוטוקול סטנדרטי 14.
    הערה: אין צורך גנוטיפ UNC-119 (ed3) כי UNC-119 (ed3) יכולים להיות מזוהים על ידי התנהגות לא מתואמת לאחר הסרת transgene ההצלה (juSi164) בשלבים הבאים 5.4 ו -5.5.
  3. הפעל ג'ל אלקטרופורזה agarose 15 ולבחון את הגדלים הלהקה (טבלה 1) כדי למצוא את WT עבור juSi164.
  4. בדוק אם צאצאי F 2 שתקו תולעים בשל קיומו של UNC-119 (ed3).
  5. אם תולעים מתואמים נמצאים על צעד 5.4, אחת כמה תולעים nonuncoordinated להשיג את כל התולעים nonuncoordinated בדור הבא.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ביצענו מסך גנטי קדימה עם CZ20310 juSi164 UNC-119 (ed3) באמצעות חשיפה לאור 30 דקות בעקבות פרוטוקול סטנדרטי האמור בסעיפים 2 ו -3 בין 60 צלחות F 1 המתאים 120 גנומים הפלואידים mutagenized, מצאנו 8 F 1 צלחות עם F 2 תולעים מוצגות פנוטיפים גלויים כגון פגם לגודל גוף (איור 3 ב), תנועה לא מתואמת (איור 3 ג), ואת הקטלניות מבוגרות (איור 3D). אנחנו לא מבחינים בשום הבדל במספר של מוטציות בין 'Day1' והצלחות 'יום 2'. כל הצאצאים של תולעים קטנות F 2 בחרו ותולעי F 2 ללא תיאום הראו פנוטיפים המתאימים, מה שמראה כי הם מוטנטים תורשתיים. התצפית המלאה מסוכמת בטבלה 2. בממוצע, מסך משובט עם 120 גנומים הפלואידים יגרום כ -10 F 1 צלחות containing תולעים עם פנוטיפים לזיהוי בעליל כגון צורת תנועה בגוף הבחינו בקלות תחת סטראו. עוד ניתוח כמותי יש צורך לקבוע את שיעור המוטציות בדיוק 4. המספר הצפוי של מוטציות גלויות ממסך זה מצביע על כך לכאביה ההתקנה פועלים כראוי עבור mutagenesis optogenetic.

איור 1
איור 1:. התקנת LED (א) מערכת כולה. הנורית הייתה רכובה על בעל מחוייט. פרטים נמצאים ברשימת החומרים. (ב) הכיסוי עשוי מפלסטיק. הביטוח אינו מכסה לחלוטין את המערכת כדי למנוע הצטברות חומה. (C) גנרטור בקר ותפקוד. (ד) הצד האחורי של המערכת. (E) צלחת unseeded בנייר מסנן -soaked 2 CuCl לטיפול אור כחול. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2:. נוהל ניסיוני עבור מסך המשובטים לאחר טיפול באור כחול, תולעים P 0 מועברים צלחת נזרע ואיפשר להטיל ביצים. תולעי P 0 מועברים ד צלחת 1 חדש זרעה לאחר טיפול אור והרגו 2 ד לאחר שיזוף. תולעי F 1 נבחרים לשמש מטרה מצלחות P 0. פנוטיפים של תולעי F 2 נבדקו לאחר התבגרותם. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

10fig3.jpg "/>
איור 3: דוגמה של מוטאנטים (א) זן מקורי עבור mutagenesis optogenetic:. CZ20310 juSi164 UNC-119 (ed3). יש זן זה צורת גוף נורמלית, התנהגות, וגודל גוזל. סרגל קנה מידה: 0.5 מ"מ. . (B - D) F 2 צאצאים מראה פגם לגודל גוף (B), חסר קואורדינציה (C), פנוטיפים קטלניים (D) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

שולחן 1
טבלה 1: Genotyping של juSi164 ו UNC-119 (ed3).

טבלה 2
טבלה 2: דוגמה של פנוטיפים frאום מסך משובט.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן אנו מתארים הליך מפורט של mutagenesis optogenetic באמצעות שלו-mSOG לידי ביטוי germline ולספק דוגמה של מסך גנטי קדימה בקנה מידה קטן. לעומת mutagenesis כימי סטנדרטי, שיטת mutagenesis optogenetic זה יש מספר יתרונות. ראשית, זה לא רעיל, ובכך שמירה על אנשי המעבדה הרחק מוטאגנים כימיים רעילים כגון EMS, ENU ו trimethylpsoralen עם אור אולטרה סגול (TMP / UV). שנית, הליך ניסיוני של mutagenesis יכול לשמש עבור מספר קטן של בעלי חיים P 0 ויכול להסתיים בתוך שעה אחת. שלישית, mutagenesis optogenetic מייצר מגוון רחב של מוטציות כולל החלפות נוקלאוטיד ומחיקות כרומוזום. לבסוף, mutagenesis optogenetic ניתן להשתמש לשילוב של transgenes extrachromosomal.

השלב הקריטי בפרוטוקול mutagenesis זה הוא להבטיח כי הגדרת LED עובדת על הזנים המכילים mSOG שלו בבית לשעבריעילות pected. אנו ממליצים על ביצוע מסך המשובטים טייס, כמתואר בפרוטוקול סעיף 3, עם כ -100 הגנום הפלואידים. Mutagenesis הוא ניתן להרחבה בקלות ממסכי טייס בהיקף קטן מסכי nonclonal ידי הגדלת מספר P 0 לטיפול אור. עבור מסכי nonclonal בקנה מידה גדול, אנו ממליצים וסנכרון בין תולעים צעירים הרה להולדת והעברת מאות מהם עם פתרון M9 לצלחת 2 CuCl לטיפול אור. התנאי הסטנדרטי כמתואר בשלבים 2 ו -3 מוערך יש כ יעילות 4.4 פעמים נמוכות יותר מאשר בשימוש הנרחב 50 שיטת mutagenesis מ"מ EMS 4. שיעור המוטציה ניתן לשפר על ידי הגדלת זמן חשיפה לאור ו / או להגדיל את עוצמת האור. עם זאת, שינויים אלה יכולים לגרום phototoxicity ולהוביל גודל אפרוחים קטן וחולה של תולעי אור שטופל. כדי להגביר את היעילות, יתכן שניתן יהיה להשתמש נגזר miniSOG עם תשואה גבוהה יותר ROS כזהכמו miniSOG (Q103L) למרות שהיא עשויה להגביר את האפקט mutagenesis ברקע ללא טיפול באור 16,17. עבור שינוי של מבנה ה- DNA, Pmex-5--72 HIS :: miniSOG-3'UTR (TBB-2) פלסמיד (pCZ886) זמין מסחרית.

בתנאים שתוארו כאן, transgenes המשולב נוצרים כ בקו אחד לכל 200 F 1 על 4 ממוצע בעת שימוש זן מהונדס extrachromosomal עם שיעור תמסורת של 10 - 30%. יעילות זו עשויה להיות מוגברת באמצעות זנים מהונדסים extrachromosomal בעלי קצב שידור גבוה כפי שדווח בעבר עבור שיטת קרינת UV 18.

mutagenesis optogenetic-mSOG בתיווך שלו גורם מוטציות מגוון רחב של גנים. כמו כן, תדירויות לוקוסים התאוששו מהמסך המדכא סל"ד-1 באמצעות mutagenesis optogenetic דומות לאלה מאותו המסך באמצעות EMS 4. עם זאת, זה possible כי mutagenesis optogenetic באמצעות גנים היסטון עלולה להיות הטיה כלפי גנים מסוימים, עקב גורמים לא ידועים כגון מבנה הכרומטין. כדי לטפל בבעיה זו, יש צורך לנתח מוטציות רבות מושרה optogenetically ידי רצף הגנום כולו.

Mutagenesis optogenetic-mSOG בתיווך שלו גורם ספקטרום רחב של מוטציות כולל החלפות נוקלאוטיד בודד ומחיקות הנעים בין 1 נ"ב עד כמה מאות נ"ב 4. הספקטרום של גרסאות נוקלאוטיד בודד עולה כי מינים חמצן תגובתי הנגרמת miniSOG הם הגורם של מוטציות 4. אפשר גם כי הנזקים miniSOG היסטון חלבונים גורמת לחוסר יציבות הכרומטין כי miniSOG משמש כדי להשבית חלבונים כמו גם 19. ייתכן שניתן יהיה לתפעל את הסוג של מוטציות על ידי השימוש באור בעוצמות שונות. מאז mutagenesis optogenetic גורם מחיק, חשוב לנתח מחיקות כמו גם שינויים נוקלאוטיד יחידים אשרנתוני רצף הגנום le למיפוי 20.

עוד נמסר בעבר כי מיקרוסקופ epifluorescent משמש אבלציה התא בתיווך miniSOG 21,22. עוצמת האור של מיקרוסקופ מתחם epifluorescent תקן נמדדה להיות ~ 0.5 mW / 2 מ"מ ללא עדשה, שזה בערך 4x נמוך מזו בשימוש בפרוטוקול mutagenesis optogenetic הסטנדרטי. לכן, רצוי מאוד כדי לקבוע את היעילות באופן אמפירי כאשר באמצעות מיקרוסקופ עלית פלורסנט כמקור אור. אחד היתרונות של ה- LED הוא יציבות במשך אלפי שעות. מחקרים קודמים הראו כי miniSOG הוא יותר חזק ב אבלציה התא בתיווך ROS תחת אור פעמו 22, למרות שהמנגנון המדויק עדיין לא נקבע. השתמשנו מגבר גנרטור / פונקציה דיגיטלית לעשות אור פעם. אפשרות נוספת היא לחבר את מקור האור למחשב באמצעות ממשק USB-TTL (איור 1 א) כדי להסדיר את li LEDgHt ידי תוכנית. המערכת LED המתואר כאן יכול לשמש גם למטרות אחרות, כגון בקרת optogenetic של תאים להתרגש באמצעות channelrhodopsin 23, אבלציה התא באמצעות mitochondria- או תא-קרום במיקוד miniSOG 17,22, ו Chromophore בסיוע אור איון (CALI) של חלבונים 19. יתר על כן, mutagenesis optogenetic זה יש את הפוטנציאל להיות מיושם על אורגניזמים אחרים, כגון חיידקים, שמרים, לעוף, דג זברה, וכן שורות תאים של יונקים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ultra High Power LED light source Prizmatix UHP-mic-LED-460 460 ± 5 nm
LED controller Prizmatix UHPLCC-01
Digital function generator/amplifier PASCO PI-9587C PI-9587C is no longer available. The replacement is PI-8127.
BNC cable male/male THORLABS CA3136
USB-TTL interface Prizmatix Optional
Photometer THORLABS PM50 and Model D10MM
Filter paper Whatman 1001-110
Stereomicroscope Leica MZ95
NGM plate Dissolve 5 g NaCl, 2.5 g Peptone, 20 g Agar, 10 µg/mL cholesterol in 1 L H2O. After autoclaving, add 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mM KH2PO4(pH 6.0). 
Lysis solution 10 mM Tris(pH 8.8), 50 mM KCl, 0.1% Triton X-100, 2.5 mM MgCl2, 100 µg/mL Proteinase K

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nat Rev Genet. 3 (5), 356-369 (2002).
  2. Kutscher, L. M., Shaham, S. Forward and reverse mutagenesis in C. elegans. WormBook. , 1-26 (2014).
  3. Collins, J., Saari, B., Anderson, P. Activation of a transposable element in the germ line but not the soma of Caenorhabditis elegans. Nature. 328 (6132), 726-728 (1987).
  4. Noma, K., Jin, Y. Optogenetic mutagenesis in Caenorhabditis elegans. Nat Commun. 6, 8868 (2015).
  5. Cooke, M. S., Evans, M. D., Dizdaroglu, M., Lunec, J. Oxidative DNA damage: mechanisms, mutation, and disease. FASEB J. 17 (10), 1195-1214 (2003).
  6. Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLoS Biol. 9 (4), 1001041 (2011).
  7. Ruiz-Gonzalez, R., et al. Singlet oxygen generation by the genetically encoded tag miniSOG. J Am Chem Soc. 135 (26), 9564-9567 (2013).
  8. Pimenta, F. M., Jensen, R. L., Breitenbach, T., Etzerodt, M., Ogilby, P. R. Oxygen-dependent photochemistry and photophysics of "miniSOG," a protein-encased flavin. Photochem Photobiol. 89 (5), 1116-1126 (2013).
  9. Frokjaer-Jensen, C., et al. Random and targeted transgene insertion in Caenorhabditis elegans using a modified Mos1 transposon. Nat Methods. 11 (5), 529-534 (2014).
  10. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  11. Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. J Vis Exp. (47), (2011).
  12. Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. (18), (2008).
  13. Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).
  14. Fay, D., Bender, A. Genetic mapping and manipulation: chapter 4--SNPs: introduction and two-point mapping. WormBook. , 1-7 (2006).
  15. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
  16. Westberg, M., Holmegaard, L., Pimenta, F. M., Etzerodt, M., Ogilby, P. R. Rational design of an efficient, genetically encodable, protein-encased singlet oxygen photosensitizer. J Am Chem Soc. 137 (4), 1632-1642 (2015).
  17. Xu, S., Chisholm, A. D. Highly efficient optogenetic cell ablation in C. elegans using membrane-targeted miniSOG. Sci Rep. 6, 21271 (2016).
  18. Mariol, M. C., Walter, L., Bellemin, S., Gieseler, K. A rapid protocol for integrating extrachromosomal arrays with high transmission rate into the C. elegans genome. J Vis Exp. (82), (2013).
  19. Lin, J. Y., et al. Optogenetic inhibition of synaptic release with chromophore-assisted light inactivation (CALI). Neuron. 79 (2), 241-253 (2013).
  20. Minevich, G., Park, D. S., Blankenberg, D., Poole, R. J., Hobert, O. CloudMap: A Cloud-Based Pipeline for Analysis of Mutant Genome Sequences. Genetics. 192 (>4), 1249-1269 (2012).
  21. Qi, Y., Xu, S. MiniSOG-mediated Photoablation in Caenorhabdtis elegans. Bio-protocol. 3 (1), http://www.bio-protocol.org/e316 316 (2013).
  22. Qi, Y. B., Garren, E. J., Shu, X., Tsien, R. Y., Jin, Y. Photo-inducible cell ablation in Caenorhabditis elegans using the genetically encoded singlet oxygen generating protein miniSOG. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (19), 7499-7504 (2012).
  23. Nagel, G., et al. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).

Tags

גנטיקה גיליון 117 mutagenesis אקראי הגנום כולו שינוי ה- DNA ROS היסטון-miniSOG אינטגרציה transgene המחיקה כרומוזומליות סריקה גנטית קדימה
Optogenetic mutagenesis אקראי באמצעות היסטון-miniSOG ב<em&gt; C. elegans</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Noma, K., Jin, Y. Optogenetic Random … More

Noma, K., Jin, Y. Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans. J. Vis. Exp. (117), e54810, doi:10.3791/54810 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter