Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

علم البصريات الوراثي الطفرات عشوائية عن طريق هيستون-miniSOG في Published: November 14, 2016 doi: 10.3791/54810
Automatic Translation
1, 1,2
1Division of Biological Sciences, Section of Neurobiology, University of California in San Diego and Howard Hughes Medical Institute, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, University of California in San Diego School of Medicine and Howard Hughes Medical Institute

Summary

المشفرة وراثيا هيستون-miniSOG يدفع الطفرات الوراثية الجينوم على نطاق بطريقة تعتمد الخفيفة والأزرق. هذه الطريقة الطفرات بسيطة وسريعة وخالية من المواد الكيميائية السامة، ومناسبة تماما للفحص الجيني إلى الأمام والتكامل التحوير.

Introduction

وقد استخدمت على نطاق واسع شاشات الوراثية إلى الأمام لتوليد طفرات الوراثية تعطيل العمليات البيولوجية المختلفة في الكائنات نموذج مثل ايليجانس انواع معينة (C. ايليجانس) 1. التحاليل التي أجريت على تلك المسوخ تؤدي إلى اكتشاف الجينات مهمة وظيفيا ويشير على مسارات 1،2. تقليديا، الطفرات في C. ويتحقق ايليجانس استخدام المواد الكيميائية تسبب الطفرات الوراثية، الإشعاع، أو الترانسبوزونات 2. المواد الكيميائية مثل methanesulfonate الإيثيلي (EMS) وN -ethyl- N -nitrosourea (ENU) تكون سامة للبشر؛ أشعة جاما أو الأشعة فوق البنفسجية (UV) الطفرات الإشعاع يتطلب معدات خاصة. وسلالات ينقول النشط، مثل سلالات mutator 3، يمكن أن تسبب الطفرات غير الضرورية أثناء الصيانة. لقد قمنا بتطوير مقاربة بسيطة للحث على الطفرات الوراثية باستخدام الضيائي المشفرة وراثيا-4.

يمكن أن أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS) الحمض النووي من التلف 5.مولد صغير القميص الأوكسجين (miniSOG) هو بروتين الفلورية الخضراء من 106 الأحماض الأمينية التي تم تصميمها من قائمة القيم (الضوء، والأكسجين، والجهد) مجال نبات الأرابيدوبسيس phototropin 2 6. عند التعرض للضوء الأزرق (~ 450 نانومتر)، miniSOG يولد ROS بما في ذلك الأكسجين القميص مع فلوريدا AVIN النوكليوتيد بمثابة العامل المساعد 6-8، التي هي موجودة في جميع الخلايا. بنينا بروتين الانصهار صاحب-mSOG عن طريق وضع علامات miniSOG إلى C-محطة من هيستون-72، وجيم ايليجانس البديل من هيستون 3. نحن إنشاء واحدة في نسخة التحوير 9 في التعبير عن رأيه، mSOG في سلالة الجرثومية من C. ايليجانس تحت ظروف التربية العادية في الظلام، والديدان المعدلة وراثيا صاحب-mSOG لها حجم الحضنة العادي والعمر الافتراضي 4. عند التعرض إلى الضوء الأزرق LED، الديدان صاحب-mSOG تنتج الطفرات الوراثية بين ذريتها 4. الطيف من الطفرات المستحثة يتضمن تغييرات النوكليوتيدات، مثل G: C إلى T: A و G: C إلى C: G، وchromoso صغيرةلي الحذف 4. هذا الإجراء الطفرات بسيط على القيام بها، ويتطلب الحد الأدنى من الإعداد سلامة المختبر. هنا، نحن تصف الإعداد إضاءة LED وإجراءات الطفرات علم البصريات الوراثي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. بناء الصمام المنور

ملاحظة: يتم تلخيص معدات LED المطلوبة في قائمة المواد. الإعداد الصمام كامل صغير ويمكن وضعها في أي مكان في المختبر، على الرغم من أننا أوصي به أن توضع في غرفة مظلمة للسيطرة على التعرض للضوء من الديدان 4.

  1. توصيل الصمام إلى وحدة تحكم مع الكابلات (الشكل 1A، D).
  2. ربط وحدة تحكم إلى الرقمي وظيفة مولد / مكبر للصوت مع كابل BNC (الشكل 1A، C، D).
  3. إصلاح الصمام الخفيفة 10 سم فوق خشبة المسرح باستخدام حامل مخصصة (الشكل 1A).
    ملاحظة: جعلنا حامل مع الأجزاء المعدنية.
  4. تغطية الإعداد إضاءة LED جزئيا، ولكن تجنب تراكم الحرارة (الشكل 1B)، الأمر الذي يجعل الديدان المرضى.
    ملاحظة: نحن نستخدم غطاء من البلاستيك الصلب حسب الطلب مع مكشوفة وأسفل (الشكل 1A). غير مطلوب غطاء لالطفرات نفسها، ولكنها تستخدم رس لحد من التعرض غير الضروري للضوء الأزرق إلى المناطق المحيطة بها. ونحن ننصح بعدم تغطية الإعداد الصمام كليا (الشكل 1B) لمنع الانهاك الديدان.
  5. ارتداء نظارات واقية ليزر.
    ملاحظة: نحن ارتداء نظارات واقية ليزر لأن الضوء هو مشرق جدا. قد تعمل النظارات الشمسية أيضا.
  6. تبديل رافعة للتحكم ادى الى "كثافة العمليات". لإضاءة مستمرة (1D الشكل) ووضعه في 65٪ من الطاقة القصوى (الشكل 1C).
  7. استخدام مضواء لقياس شدة الضوء الأزرق على المسرح حيث يتم وضع الديدان باستخدام بروتوكول الشركة الصانعة. الإعداد يعطي 2.0 ميغاواط / مم 2 تحت إضاءة مستمرة.

2. الأزرق علاج الخفيفة

ملاحظة: استخدم سلالة CZ20310 juSi164 [Pmex-5-HIS-72 :: miniSOG-3'UTR (TBB-2) + CB-UNC-119 (+)] UNC-119 (ED3) الثالث 4 هو السلالة متاح. في انواع معينة مركز علم الوراثة (CGC، http: //: //www.cgc.cbs.umn.edu/).

  1. الحفاظ على سلالة صاحب-mSOG في الظلام على معيار متوسط النمو الخيطية (NGM) لوحات مع E. القولونية OP50 التالية بروتوكول قياسي 10،11.
    ملاحظة: تحت الضوء المحيط، juSi164 سلالات المحتوية لا يتم عرض معدل الطفرات أعلى معدل عفوية 4. الروتيني سلالة مرور باستخدام نطاق تشريح مع مصابيح الهالوجين عادة لا تسبب الطفرات كذلك. ومع ذلك، ينبغي الحرص على تجنب التعرض غير الضروري إلى النور، على سبيل المثال، والحفاظ على السلالات في معيار الظلام داخل الحاضنة، أو تغطي التوتر مع احباط. ينصح لتجميد aliquots من سلالة بعد الحصول عليها في حالة الطفرات لا لزوم لها تتراكم مع مرور الوقت.
  2. اختيار حامل الشباب البالغين (ما يقرب من 12 ساعة بعد L4) الحيوانات مع دودة اختيار 11.
    ملاحظة: الحيوانات الأصغر سنا تظهر تأثير أقل مطفرة 4، في حين أن الحيوانات الأكبر سنا قد يكون أقل حجم الحضنة.
  3. قطع مرشح صأبر لتتناسب مع لوحة 60 ملم مع 25 ملم × 25 ملم حفرة مربعة ومكان على لوحة غير المصنف (الشكل 1E).
    ملاحظة: لكمة مربع يمكن استخدامها ولكن حجم لكمة ليس من الضروري أن يكون دقيقا.
  4. إسقاط 100 ميكرولتر من 100 ملي CuCl 2 على ورقة الترشيح بالتساوي للحد من الديدان داخل حفرة مربعة على لوحة.
  5. اختيار العدد المطلوب من حامل المنحرفين الشباب البالغين (راجع الخطوة 3 للحصول على مثال) ونقل إلى مركز لوحة CuCl 2.
  6. ارتداء النظارات الواقية ليزر.
  7. التبديل على الصمام ومولد وظيفة.
  8. تبديل رافعة للتحكم ادى الى "تحويلة". للسيطرة عليها من قبل مولد وظيفة (1D الشكل).
  9. تعيين تحكم في 65٪ من الطاقة القصوى والمولد وظيفة موجة جيبية، 4 هرتز (الشكل 1C).
  10. وضع لوحة CuCl 2 من الخطوة 2.5 دون غطاء على المسرح تحت الصمام (الشكل 1A </ قوي>).
  11. تسليط الضوء على الحيوانات مع الضوء الأزرق لمدة 30 دقيقة.
  12. نقل الديدان صحية يتطلعون إلى لوحة المصنف كما P 0.
    ملاحظة: العدد المطلوب من P 0 يعتمد على نوع من الشاشة. راجع الخطوة 3 على سبيل المثال. قد تظهر ف 0 الديدان أن تكون غير منسقة فورا بعد العلاج الخفيفة وسوف تتعافى مع مرور الوقت.
  13. حافظ على الديدان تغطيتها باستخدام رقائق في حاضنة أو في الظلام. واتبع الإجراء القياسي لبدء فحص الظواهر المطلوب بين ذريتها 2،10.

3. مثال على شاشة الوراثية إلى الأمام

ملاحظة: هذا مثال من الشاشة نسيلي مع 120 الجينوم فرداني للتحقق مما إذا كان الصمام وسلالة تعمل يبين الشكل 2 التخطيطي لهذا الإجراء.

  1. [DAY1] بعد العلاج الضوء الأزرق، واختيار خمسة الديدان صحية تتطلع إلى لوحة NGM مع OP50 كما P 0، والاحتفاظ بها في 20 درجة مئوية الحاضنة، والسماح لهم وضع البيض ل1د (لوحة "DAY1 ').
  2. [DAY2] نقل P 0 على طبق من ذهب المصنفة جديدة (لوحة "DAY2 ').
  3. [DAY3] انتقاء وقتل P 0 على لوحة في "DAY2 عن طريق حرقها.
  4. [DAY4] اختيار 30 شابة حامل الكبار F 1 من لوحة في "DAY1" ونقلها على لوحات فردية (30 F 1 لوحات ل 'DAY1').
  5. [Day5] كرر الخطوة 3.4 لوحة في "DAY2" (30 F 1 لوحات ل 'DAY2').
  6. [Day7-9] التحقق من الأشكال التضاريسية غير طبيعية و / أو سلوك F 2 الديدان مقارنة WT سلالة (الشكل 3A) تحت مجهر تشريحي القياسية عندما يصبحون بالغين.
    ملاحظة: يعرض طفرة وراثية نحو ربع الديدان مع نفس النمط الظاهري بين F 2 عندما يكون المتنحية مع انتفاذ عالية. ومع ذلك، قد تنمو بعض المسوخ ببطء و / أو إظهار انتفاذ جزئي. لذلك، فمن الممكن أن أقل من ربع المسوخ يمكن العثور علىطبق.
  7. اختيار الديدان مع الظواهر المرئية على حدة والتحقق من التوريث من النمط الظاهري في الجيل القادم.

4. مثال على التكامل خارج الصبغي التحوير

  1. حقن الحمض النووي من الاهتمام الى CZ20310 juSi164 [Pmex-5-HIS-72 :: miniSOG-3'UTR (TBB-2) + CB-UNC-119 (+)] UNC-119 (ED3) وإعداد الديدان المعدلة وراثيا مع انخفاض معدل انتقال (10-30٪) في أعقاب 12،13 بروتوكول حقن القياسية.
    ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن تجاوز صفائف خارج الصبغي أنشئت في سلالات juSi164. لتجنب التنميط الجيني لjuSi164، يمكن استخدام الزيجوت juSi164 باسم P 0 على الرغم من كفاءة قد انخفض. يتم وصف أسلوب التنميط الجيني لjuSi164 في القسم 5.
  2. [DAY1] علاج ~ 20 الحيوانات المعدلة وراثيا كما P 0 مع الضوء الأزرق كما هو موضح في الخطوة 2.
    ضرورية عن P 0 الديدان تبعا لآر ملاحظة: معدل ansmission. الجينات المحورة يمكن تحديدها من خلال الظواهر أو 12،13 coinjection علامة.
  3. اختيار 10 تبحث P صحية 0 على لوحات فردية، والاحتفاظ بها في 20 درجة مئوية الحاضنة، والسماح لهم وضع البيض لبضعة أيام (ف 0 لوحات)
  4. [DAY4] واحدة من 20 المعدلة وراثيا F 1 الديدان من كل لوحة P 0 على لوحات فردية والسماح لهم وضع البيض. (20 F 1 × 10 ف 0 لوحات = 200 F 1 لوحات في المجموع).
  5. [Day7] البحث F 1 لوحات مع> 75٪ F 2 وجود الجينات المحورة.
  6. اختيار خمسة حيوانات معدلة وراثيا من معدل انتقال> 75٪ F 1 لوحات (F لوحات 2).
  7. [Day10] حافظ F لوحات 2 مع معدل نقل 100٪ من خطوط متكاملة المحتملة.
  8. تهجين خطوط متكاملة المحتملة باستخدام الإجراء العادي 10 للتحقق من العزل مندلية ولإزالة الطفرات خلفية محتملة.
لو "> 5. انماط

  1. ليز 20 outcrossed F 2 الديدان في تحلل العازلة باستخدام بروتوكول قياسي 14.
  2. أداء PCR باستخدام بادئات لMosSCI الإدراج 9، juSi164، (الجدول رقم 1) مع درجة الحرارة الصلب من 58 درجة مئوية بعد بروتوكول قياسي 14.
    ملاحظة: ليس من الضروري الوراثي UNC-119 (ED3) لUNC-119 (ED3) يمكن الكشف عنها بواسطة سلوك غير منسقة بعد إزالة التحوير إنقاذ (juSi164) في خطوات التالية 5.4 و 5.5.
  3. تشغيل الاغاروز الكهربائي للهلام 15 وفحص أحجام الفرقة (الجدول 1) للعثور على WT لjuSi164.
  4. فحص إذا ذرية F 2 شلت الديدان بسبب وجود (ED3) UNC-119.
  5. إذا تم العثور على الديدان غير منسقة في خطوة 5.4، واحدة عدة الديدان nonuncoordinated الحصول على جميع الديدان nonuncoordinated في الجيل القادم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

أجرينا شاشة الوراثية إلى الأمام مع CZ20310 juSi164 (ED3) UNC-119 باستخدام التعرض للضوء 30 دقيقة بعد بروتوكول قياسي الموصوفة في أقسام 2 و 3. من بين 60 F 1 لوحات الموافق 120 الجينوم فرداني mutagenized، وجدنا 8 F 1 لوحات مع F 2 الديدان التي تظهر الظواهر المرئية مثل عيب حجم الجسم (الشكل 3B)، حركة غير منسقة (الشكل 3C)، والفتك الكبار (الشكل 3D). لم نلاحظ أي اختلاف في عدد من المسوخ بين "DAY1" وألواح "DAY2". وأظهرت كل ذرية صغيرة F 2 الديدان خص وغير منسقة F 2 الديدان الظواهر المقابلة، مما يشير إلى أنها طفرات وراثية. وتتلخص المراقبة الكاملة في الجدول 2. وفي المتوسط، فإن الشاشة نسيلي مع 120 الجينوم فرداني يؤدي إلى حوالي 10 F 1 لوحات يخدعtaining الديدان مع الظواهر كشف بشكل واضح مثل شكل الجسم والحركة التي رصدت بسهولة تحت مجهر تشريحي. المزيد من التحليل الكمي ضروري لتحديد معدل التحور على وجه التحديد 4. العدد المتوقع من المسوخ وضوحا من هذه الشاشة تشير إلى أن سلالة والإعداد تعمل بشكل صحيح عن الطفرات علم البصريات الوراثي.

شكل 1
الشكل 1: الإعداد الصمام (A) والنظام بأكمله. وقد شنت LED على حامل حسب الطلب. تم العثور على التفاصيل في قائمة المواد. يرصد (B) غطاء من البلاستيك. أنه لا يغطي النظام بشكل كامل لتجنب تراكم الحرارة. (C) وحدة تحكم وظيفة المولد. (D) في الجانب الخلفي للنظام. (E) لوحة غير المصنف مع CuCl 2 -soaked ورق الترشيح للعلاج الضوء الأزرق. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: إجراء تجريبي لشاشة نسيلي بعد العلاج الضوء الأزرق، يتم نقل ف 0 الديدان إلى لوحة المصنفة وسمح لوضع البيض. يتم نقل ف 0 الديدان جديدة لوحة المصنفة 1 د بعد العلاج الخفيفة وقتل 2 د بعد العلاج الخفيفة. وخص F 1 الديدان من ف 0 لوحات. يتم فحص الظواهر من F 2 الديدان بعد يصبحون بالغين. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

10fig3.jpg "/>
الرقم 3: مثال من المسوخ (A) سلالة الأصلي للالطفرات علم البصريات الوراثي: CZ20310 juSi164 UNC-119 (ED3). هذه السلالة لها شكل طبيعي الجسم والسلوك، وحجم الحضنة. شريط مقياس: 0.5 مم. (B - D) F 2 ذرية تظهر حجم الجسم عيب (B)، غير منسقة (C)، وقاتلة (D) الظواهر الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1
الجدول 1: انماط من juSi164 وUNC-119 (ED3).

الجدول 2
الجدول 2: مثال من الظواهر الابام شاشة نسيلي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا، نحن تصف إجراءات تفصيلية من الطفرات علم البصريات الوراثي باستخدام اعرب-mSOG في سلالة الجرثومية وتقديم مثال على شاشة الوراثية إلى الأمام على نطاق صغير. بالمقارنة مع الطفرات الكيميائية القياسية، وهذه الطريقة الطفرات علم البصريات الوراثي لديها العديد من المزايا. أولا، فمن غير سامة، وبالتالي الحفاظ على أفراد المختبر بعيدا عن المطفرة الكيميائية السامة مثل نظم الإدارة البيئية، ENU وtrimethylpsoralen مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية (TMP / الأشعة فوق البنفسجية). ثانيا، إن إجراء التجارب من الطفرات يمكن استخدامها لعدد صغير من ف 0 الحيوانات ويمكن أن تنتهي في غضون ساعة واحدة. ثالثا، الطفرات علم البصريات الوراثي وتنتج مجموعة واسعة من الطفرات بما في ذلك استبدال النوكليوتيدات والحذف كروموسوم. وأخيرا، فإن الطفرات علم البصريات الوراثي يمكن أن تستخدم لدمج الجينات المحورة خارج الصبغي.

في خطوة حاسمة في هذا البروتوكول الطفرات هو التأكد من أن إعداد الصمام يعمل على صاحب-mSOG تحتوي على سلالات في السابقكفاءة pected. نوصي أداء شاشة نسيلي التجريبية، كما هو موضح في القسم بروتوكول 3، مع حوالي 100 الجينوم فرداني. الطفرات هي قابلة للتطوير بسهولة من الشاشات على نطاق تجريبي صغيرة لشاشات nonclonal عن طريق زيادة عدد ف 0 لعلاج الخفيفة. لشاشات nonclonal على نطاق واسع، نقترح عليك مزامنة الديدان إلى الشباب حامل ونقل المئات منهم مع حل M9 على طبق من ذهب CuCl 2 للعلاج الخفيفة. الشرط القياسية الموضحة في الخطوات 2 و 3 يقدر أن يكون أقل ما يقرب من 4.4 مرة كفاءة من استخدامها على نطاق واسع 50 ملي EMS طريقة الطفرات 4. يمكن تحسين معدل التحور من خلال زيادة وقت التعرض للضوء و / أو زيادة شدة الضوء. ومع ذلك، يمكن لهذه التعديلات يسبب الضيائية ويؤدي إلى حجم الحضنة الصغيرة ومرض الديدان المعالجة الخفيفة. لزيادة الكفاءة، فإنه قد يكون من الممكن استخدام المشتقات miniSOG مع ارتفاع العائد ROS هذاكما miniSOG (Q103L) على الرغم من أنها قد تزيد من تأثير الخلفية الطفرات دون علاج الخفيفة 16،17. لتعديل التركيبة الحمض النووي، و(TBB-2) البلازميد Pmex-5-HIS-72 :: miniSOG-3'UTR (pCZ886) متاحة تجاريا.

وفقا للشروط الموضحة هنا، يتم إنشاؤها الجينات المحورة المتكاملة على خط واحد تقريبا لكل 200 F 1 في المتوسط 4 عند استخدام سلالة المعدلة وراثيا خارج الصبغية مع معدل نقل من 10 - 30٪. ويمكن زيادة هذه الكفاءة باستخدام سلالات معدلة وراثيا خارج الصبغي مع معدلات نقل عالية كما ذكرت سابقا لطريقة الأشعة فوق البنفسجية 18.

له بوساطة mSOG-الطفرات علم البصريات الوراثي تحرض الطفرات في مجموعة واسعة من الجينات. أيضا، وتواتر مواضع تعافى من الشاشة القامع دورة في الدقيقة 1 باستخدام الطفرات علم البصريات الوراثي هو مماثلة لتلك التي من نفس الشاشة باستخدام EMS 4. ومع ذلك، فمن possiبليه أن الطفرات علم البصريات الوراثي باستخدام جينة هيستون قد يكون لها انحياز بعض الجينات، وذلك بسبب عوامل غير معروفة مثل هيكل لونين. لمعالجة هذه المسألة، فمن الضروري تحليل العديد من الطفرات المستحثة optogenetically التي كتبها كامل تسلسل الجينوم.

تسبب له بوساطة mSOG-الطفرات علم البصريات الوراثي طائفة واسعة من الطفرات بما في ذلك استبدال النووية المنفردة والحذف تتراوح ما بين 1 بي بي لبضع مئات من بي بي 4. الطيف من المتغيرات النووية المنفردة تشير إلى أن أنواع الاكسجين التفاعلية التي يسببها miniSOG-هي سبب الطفرات 4. ومن الممكن أيضا أن الأضرار miniSOG هيستون البروتينات ويسبب عدم الاستقرار لونين لأنه يستخدم miniSOG لتعطيل البروتينات وكذلك (19). قد يكون من الممكن لمعالجة نوع من الطفرات باستخدام ضوء كثافات مختلفة. منذ الطفرات علم البصريات الوراثي يؤدي الحذف، فإنه من المهم تحليل الحذف فضلا عن التغييرات النووية المنفردة في منظمة الصحة العالميةالبيانات جنيه تسلسل الجينوم لرسم الخرائط 20.

وقد ذكرت سابقا أن يتم استخدام المجهر epifluorescent للتوسط miniSOG خلايا الاجتثاث 21،22. وقد تم قياس شدة الضوء من المجهر epifluorescent المجمع القياسي لتكون ~ 0.5 ميغاواط / مم 2 دون عدسة، وهي عبارة عن 4X أقل من تلك المستخدمة في بروتوكول قياسي الطفرات علم البصريات الوراثي. وبالتالي، فإنه من المستحسن للغاية لتحديد تجريبيا كفاءة عند استخدام المجهر برنامج التحصين الموسع الفلورسنت كمصدر ضوء. ميزة واحدة من الصمام هو الاستقرار على مدى آلاف ساعة. وقد أظهرت دراسات سابقة أن miniSOG هو أكثر فعالية في استئصال الخلايا بوساطة ROS-تحت ضوء نابض 22، على الرغم من أن الآلية الدقيقة لا تزال يحدد لاحقا. استخدمنا الرقمي وظيفة مولد / مكبر للصوت لجعل ضوء نابض. وثمة خيار آخر هو ربط مصدر الضوء إلى جهاز الكمبيوتر باستخدام واجهة USB-TTL (الشكل 1A) لتنظيم لى LEDGHT بواسطة برنامج. ويمكن أيضا أن تستخدم نظام LED الموصوفة هنا لأغراض أخرى، مثل التحكم في علم البصريات الوراثي للخلايا منفعل باستخدام channelrhodopsin 23، الاجتثاث الخلية باستخدام mitochondria- أو miniSOG 17،22 استهدفت خلية غشاء، وحامل اللون، بمساعدة ضوء التعطيل (كالي) من البروتينات 19. وعلاوة على ذلك، هذه الطفرات علم البصريات الوراثي لديه القدرة على تطبيقها على الكائنات الحية الأخرى، مثل البكتيريا والخميرة، ويطير، والزرد، فضلا عن خطوط خلايا الثدييات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ultra High Power LED light source Prizmatix UHP-mic-LED-460 460 ± 5 nm
LED controller Prizmatix UHPLCC-01
Digital function generator/amplifier PASCO PI-9587C PI-9587C is no longer available. The replacement is PI-8127.
BNC cable male/male THORLABS CA3136
USB-TTL interface Prizmatix Optional
Photometer THORLABS PM50 and Model D10MM
Filter paper Whatman 1001-110
Stereomicroscope Leica MZ95
NGM plate Dissolve 5 g NaCl, 2.5 g Peptone, 20 g Agar, 10 µg/mL cholesterol in 1 L H2O. After autoclaving, add 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mM KH2PO4(pH 6.0). 
Lysis solution 10 mM Tris(pH 8.8), 50 mM KCl, 0.1% Triton X-100, 2.5 mM MgCl2, 100 µg/mL Proteinase K

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nat Rev Genet. 3 (5), 356-369 (2002).
  2. Kutscher, L. M., Shaham, S. Forward and reverse mutagenesis in C. elegans. WormBook. , 1-26 (2014).
  3. Collins, J., Saari, B., Anderson, P. Activation of a transposable element in the germ line but not the soma of Caenorhabditis elegans. Nature. 328 (6132), 726-728 (1987).
  4. Noma, K., Jin, Y. Optogenetic mutagenesis in Caenorhabditis elegans. Nat Commun. 6, 8868 (2015).
  5. Cooke, M. S., Evans, M. D., Dizdaroglu, M., Lunec, J. Oxidative DNA damage: mechanisms, mutation, and disease. FASEB J. 17 (10), 1195-1214 (2003).
  6. Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLoS Biol. 9 (4), 1001041 (2011).
  7. Ruiz-Gonzalez, R., et al. Singlet oxygen generation by the genetically encoded tag miniSOG. J Am Chem Soc. 135 (26), 9564-9567 (2013).
  8. Pimenta, F. M., Jensen, R. L., Breitenbach, T., Etzerodt, M., Ogilby, P. R. Oxygen-dependent photochemistry and photophysics of "miniSOG," a protein-encased flavin. Photochem Photobiol. 89 (5), 1116-1126 (2013).
  9. Frokjaer-Jensen, C., et al. Random and targeted transgene insertion in Caenorhabditis elegans using a modified Mos1 transposon. Nat Methods. 11 (5), 529-534 (2014).
  10. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  11. Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. J Vis Exp. (47), (2011).
  12. Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. (18), (2008).
  13. Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).
  14. Fay, D., Bender, A. Genetic mapping and manipulation: chapter 4--SNPs: introduction and two-point mapping. WormBook. , 1-7 (2006).
  15. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
  16. Westberg, M., Holmegaard, L., Pimenta, F. M., Etzerodt, M., Ogilby, P. R. Rational design of an efficient, genetically encodable, protein-encased singlet oxygen photosensitizer. J Am Chem Soc. 137 (4), 1632-1642 (2015).
  17. Xu, S., Chisholm, A. D. Highly efficient optogenetic cell ablation in C. elegans using membrane-targeted miniSOG. Sci Rep. 6, 21271 (2016).
  18. Mariol, M. C., Walter, L., Bellemin, S., Gieseler, K. A rapid protocol for integrating extrachromosomal arrays with high transmission rate into the C. elegans genome. J Vis Exp. (82), (2013).
  19. Lin, J. Y., et al. Optogenetic inhibition of synaptic release with chromophore-assisted light inactivation (CALI). Neuron. 79 (2), 241-253 (2013).
  20. Minevich, G., Park, D. S., Blankenberg, D., Poole, R. J., Hobert, O. CloudMap: A Cloud-Based Pipeline for Analysis of Mutant Genome Sequences. Genetics. 192 (>4), 1249-1269 (2012).
  21. Qi, Y., Xu, S. MiniSOG-mediated Photoablation in Caenorhabdtis elegans. Bio-protocol. 3 (1), http://www.bio-protocol.org/e316 316 (2013).
  22. Qi, Y. B., Garren, E. J., Shu, X., Tsien, R. Y., Jin, Y. Photo-inducible cell ablation in Caenorhabditis elegans using the genetically encoded singlet oxygen generating protein miniSOG. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (19), 7499-7504 (2012).
  23. Nagel, G., et al. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).

Tags

علم الوراثة، العدد 117، الطفرات العشوائية على نطاق الجينوم، وتعديل الحمض النووي، ROS، هيستون-miniSOG، والتكامل التحوير، الكروموسومات الحذف، الفحص الجيني إلى الأمام
علم البصريات الوراثي الطفرات عشوائية عن طريق هيستون-miniSOG في<em&gt; C. ايليجانس</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Noma, K., Jin, Y. Optogenetic Random … More

Noma, K., Jin, Y. Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans. J. Vis. Exp. (117), e54810, doi:10.3791/54810 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter