Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Optogenetic Tilfældig mutagenese ved anvendelse histon-miniSOG i Published: November 14, 2016 doi: 10.3791/54810
Automatic Translation
1, 1,2
1Division of Biological Sciences, Section of Neurobiology, University of California in San Diego and Howard Hughes Medical Institute, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, University of California in San Diego School of Medicine and Howard Hughes Medical Institute

Summary

Genetisk kodet histon-miniSOG inducerer genom-dækkende arvelige mutationer i et blåt lys-afhængig måde. Denne mutagenese metode er enkel, hurtig, fri for giftige kemikalier, og velegnet til frem genetisk screening og transgen integration.

Introduction

Fremad genetiske skærme er ofte blevet brugt til at generere genetiske mutanter forstyrre forskellige biologiske processer i modelorganismer såsom Caenorhabditis elegans (C. elegans) 1. Analyser af sådanne mutanter føre til opdagelsen af funktionelt vigtige gener og deres signalveje 1,2. Traditionelt mutagenese i C. elegans opnås ved anvendelse af mutagene kemikalier, stråling eller transposoner 2. Kemikalier såsom -ethylmethansulfonat (EMS) og N-ethyl-N -nitrosourea (ENU) er giftige for mennesker; gamma-ray eller ultraviolet (UV) stråling mutagenese kræver særligt udstyr; og transposon-aktiv stammer, såsom mutatorstammer 3, kan forårsage unødvendige mutationer under vedligeholdelse. Vi har udviklet en enkel fremgangsmåde til at fremkalde arvelige mutationer under anvendelse af en genetisk kodet fotosensibilisator 4.

Reaktive Oxygen Species (ROS) kan skade DNA 5.Mini Singlet Oxygen Generator (miniSOG) er et grønt fluorescerende protein af 106 aminosyrer, som blev manipuleret fra LOV (Light, oxygen og spænding) domæne af Arabidopsis phototropin 2 6. Ved udsættelse for blåt lys (~ 450 nm), miniSOG genererer ROS herunder singlet oxygen med fl avin mononukleotid som en cofaktor 6-8, som er til stede i alle celler. Vi konstruerede et His-mSOG fusionsproteinet ved tagging miniSOG til C-terminalen af histon-72, en C. elegans variant af histon 3. Vi genererede et enkelt eksemplar transgen 9 til at udtrykke His-mSOG i kimcellelinje C. elegans. Under normale dyrkningsbetingelser i mørke, de His-mSOG transgene orme har normal yngel størrelse og levetid 4. Ved udsættelse for blå LED lys, His-mSOG orme producerer arvelige mutationer blandt deres afkom 4. Spektret af inducerede mutationer omfatter nukleotidændringer, såsom G: C til T: A og G: C til C: G, og små chromosomig deletioner 4. Denne mutagenese procedure er enkel at udføre, og kræver minimal opsætning lab sikkerhed. Her beskriver vi LED belysning setup og procedurer for optogenetic mutagenese.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Konstruktion af LED-lampe

BEMÆRK: Den nødvendige LED udstyr er sammenfattet i listen over stoffer. Hele LED opsætning er lille og kan placeres overalt i laboratoriet, selvom vi anbefaler det anbringes i et mørkt rum for at kontrollere lyseksponering af orme 4.

  1. Tilslut LED til en controller med kabler (figur 1A, D).
  2. Tilslut controlleren til en digital funktion generator / forstærker med en BNC-kabel (figur 1A, C, D).
  3. Fastgør LED lys 10 cm over scenen ved hjælp af en brugerdefineret holder (figur 1A).
    BEMÆRK: Vi har lavet holderen med metaldele.
  4. Dæk LED-belysning setup delvist, men undgå varmeakkumulering (figur 1B), hvilket gør orme syge.
    BEMÆRK: Vi anvender en skræddersyet hård plastkappe med åben top og bund (figur 1A). Dækslet er ikke påkrævet for selve mutagenese, men bruges to begrænse unødvendig udsættelse af det blå lys til omgivelserne. Vi anbefaler ikke at dække LED setup helt (figur 1B) for at forhindre overophedning orme.
  5. Bær laser-beskyttende briller.
    BEMÆRK: Vi bære laser-beskyttende briller, fordi lyset er meget lys. Solbriller kan arbejde så godt.
  6. Skift håndtaget af LED controller til "Int.« for kontinuerlig belysning (Figur 1D) og sæt den til 65% af den maksimale effekt (figur 1C).
  7. Brug et fotometer til måling af blåt lys intensitet på det stadium, hvor ormene er placeret ved hjælp af fabrikantens protokol. Opsætningen giver 2,0 mW / mm2 under kontinuerlig belysning.

2. Blue Light Treatment

BEMÆRK: Brug stammen CZ20310 juSi164 [Pmex-5-HIS-72 :: miniSOG-3'UTR (TBB-2) + Cb-unc-119 (+)] unc-119 (ED3) III 4 Stammen er tilgængelig. på Caenorhabditis Genetics center (CGC, http: //www.cgc.cbs.umn.edu/).

  1. Opretholde den His-mSOG stammen i mørke på standard nematode vækstmedium (NGM) plader med E. coli OP50 efter en standardprotokol 10,11.
    BEMÆRK: Under omgivende lys, behøver juSi164 holdige stammer ikke vise en mutation på over en spontan sats 4. Rutinemæssig stamme passage ved anvendelse af et dissektionsmikroskop med en halogenlampe generelt ikke forårsager mutationer samt. Ikke desto mindre bør der udvises forsigtighed for at undgå unødig udsættelse for lys, fx holde stammerne i en standard mørk-inde inkubator, eller dækker stammer med folie. Det tilrådes at fryse portioner af stammen efter at have modtaget den i tilfælde unødvendige mutationer ophobes over tid.
  2. Pick gravide unge voksne (ca. 12 timer efter L4) dyr med en orm pick 11.
    BEMÆRK: Yngre dyr viser mindre mutagene effekt 4, mens ældre dyr kan have lavere kuld størrelse.
  3. Skær et filter paper til at passe en 60 mm plade med en 25 mm x 25 mm firkantet hul og placere på en ikke podet plade (figur 1E).
    BEMÆRK: En firkantet dorn kan anvendes, men størrelsen af ​​stemplet behøver ikke at være præcis.
  4. Drop 100 pi 100 mM CuCl2 på filtrerpapiret jævnt at begrænse orme inden det firkantede hul på pladen.
  5. Pick ønskede antal drægtige unge voksne hermafroditter (se trin 3 for et eksempel) og overførsel til centrum af CuCl2 plade.
  6. Bær laser beskyttelsesbriller.
  7. Tænd for LED og funktionen generator.
  8. Skift håndtaget af LED controller til Ext. « at kontrollere den ved funktionsgenerator (figur 1D).
  9. Indstil styringen ved 65% af den maksimale effekt og funktion generator som sinusbølge, 4 Hz (figur 1C).
  10. Placer CuCl 2 plade fra trin 2.5 uden låg på scenen under LED (figur 1A </ Strong>).
  11. Belyse dyr med blåt lys i 30 min.
  12. Overfør sundt udseende orme til en podet plade som P 0.
    BEMÆRK: Det ønskede antal P 0 afhænger af typen af skærmen. Se trin 3 for et eksempel. De P 0 orme kan synes at være ukoordineret umiddelbart efter lysbehandling, og vil komme sig over tid.
  13. Hold orme dækket ved hjælp af folie i en inkubator eller i mørke; og følg den normale procedure for at begynde screening ønskede fænotyper blandt deres afkom 2,10.

3. Eksempel på en Forward Genetisk Screen

BEMÆRK:. Dette er et eksempel på den klonale skærm med 120 haploide genomer at kontrollere, om LED og stamme arbejder Figur 2 viser skematisk proceduren.

  1. [Day1] Efter blåt lys behandling, pick fem sundt udseende orme på en NGM plade med OP50 som P 0, holde dem i en 20 ° C inkubator, og lad dem lægge æg for end ( 'Day1' plade).
  2. [Day2] Transfer P 0 på en ny seedede plade ( "Day2 'plade).
  3. [Day3] Pick og dræbe P 0 på "Day2 'plade ved at brænde dem.
  4. [Day4] Pick 30 gravide unge voksne F 1 fra "Day1 'plade og overfør dem til de enkelte plader (30 F 1 plader for' Day1«).
  5. [Day5] Gentag trin 3.4 for "Day2 'plade (30 F 1 plader for' Day2«).
  6. [Day7-9] Kontroller unormale morfologier og / eller adfærd F 2 orme i forhold til WT-stammen (figur 3A) under en standard stereomikroskop, når de bliver voksne.
    BEMÆRK: en arvelig mutation viser om en fjerdedel af orme med samme fænotype blandt F 2, når det er recessive med høj penetrans. Dog kan nogle mutanter vokser langsomt og / eller vise delvis penetrans. Derfor er det muligt, at mindre end en fjerdedel af mutanterne kan ses på enplade.
  7. Pick orme med synlige fænotyper individuelt og kontrollere arveligheden af ​​fænotype i den næste generation.

4. Eksempel på et ekstrakromosomalt transgen integration

  1. Indsprøjtes DNA'et af interesse i CZ20310 juSi164 [Pmex-5-HIS-72 :: miniSOG-3'UTR (TBB-2) + Cb-unc-119 (+)] unc-119 (ED3) og forberede transgene orme med et lav transmissionshastighed (10-30%) efter en standard injektionsprotokol 12,13.
    BEMÆRK: Alternativt kan etablerede ekstrakromosomale arrays krydses i juSi164 stammer. For at undgå genotypebestemmelse for juSi164 kan juSi164 heterozygoter anvendes som P 0 skønt effektiviteten kan være nedsat. Den genotype metode til juSi164 er beskrevet i afsnit 5.
  2. [Day1] Forkæl ~ 20 transgene dyr som P 0 med blåt lys, som beskrevet i trin 2.
    BEMÆRK: Mere P 0 orme er nødvendige afhængigt af st ansmission sats. Transgener kan identificeres ved fænotyper eller coinjektion markør 12,13.
  3. Pick 10 sundt udseende P 0 på de enkelte plader, holde dem i en 20 ° C inkubator, og lad dem lægge æg i et par dage (P 0 plader)
  4. [Day4] Single ud 20 transgene F 1 orme fra hver P 0 plade på individuelle plader og lad dem lægge æg. (20 F 1 x 10 P 0 plader = 200 F 1 plader i alt.)
  5. [Dag 7] Find F 1 plader med> 75% F 2 har transgener.
  6. Pick fem transgene dyr fra transmissionshastigheden> 75% F 1 plader (F 2 plader).
  7. [Day10] Hold F 2 plader med 100% transmissionshastighed som potentielle integrerede linjer.
  8. Udkrydsning de potentielle integrerede kredsløb under anvendelse af en standardprocedure 10 at kontrollere Mendelsk segregation og fjerne potentielle baggrundsmutationer.
le "> 5. Genotypebestemmelse

  1. Lyse 20 udkrydsede F 2 orme i lysepuffer ved anvendelse af en standardprotokol 14.
  2. Udfør PCR under anvendelse af primerne for MosSCI insertion 9, juSi164, (tabel 1) med en annealingstemperatur på 58 ° C efter en standardprotokol 14.
    BEMÆRK: Det er unødvendigt at genotype unc-119 (ED3) fordi unc-119 (ED3) kan påvises ved ukoordineret adfærd efter fjernelse af redning transgen (juSi164) i følgende trin 5.4 og 5.5.
  3. Kør agarosegelelektroforese 15 og undersøge båndstørrelser (tabel 1) for at finde WT for juSi164.
  4. Undersøg, om F 2 afkom har lammet orme på grund af eksistensen af unc-119 (ED3).
  5. Hvis der findes ukoordinerede orme på trin 5.4, til enlige flere nonuncoordinated orme få alle nonuncoordinated orme i den næste generation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi udførte en forward genetisk skærm med CZ20310 juSi164 unc-119 (ED3) ved hjælp af 30 min lys eksponering efter standard protokollen beskrevet i afsnit 2 og 3. Blandt 60 F 1 plader svarende til 120 mutageniseret haploide genomer, fandt vi 8 F 1 plader med F 2 orme udviser synlige fænotyper såsom kropsstørrelse defekt (figur 3B), ukoordineret bevægelse (figur 3C), og voksen dødelighed (figur 3D). Vi lagde ikke mærke nogen forskel i antallet af mutanter mellem 'Day1 «og» Day2' plader. Alt afkom af fremhævet små F 2 orme og ukoordinerede F 2 orme viste de tilsvarende fænotyper, hvilket antyder, at de er arvelige mutanter. Den fulde observation er opsummeret i tabel 2. I gennemsnit vil en klonal skærm med 120 haploide genomer resulterer i omkring 10 F 1 plader conTaining orme med synligt påviselige fænotyper såsom kropsform og bevægelse, der let spottet under et stereomikroskop. Mere kvantitativ analyse er nødvendigt at fastlægge den mutation sats præcist 4. Det forventede antal synlige mutanter fra denne skærm antyder, at stammen og opsætning fungerer korrekt for optogenetic mutagenese.

figur 1
Figur 1:. LED Setup (A) Hele systemet. Lysdioden var monteret på en specialfremstillet holder. Detaljer findes i listen over stoffer. (B) Låget er lavet af plastik. Den dækker ikke systemet helt at undgå varme ophobning. (C) Controller og funktionsgenerator. (D) Bagsiden af systemet. (E) En upodede plade med CuCl 2 -soaked filter papir til blåt lys behandling. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2:. Forsøgsprocedure for en klonal Screen Efter blåt lys behandling, er P 0 orme overført til en podet plade og fik lov til at lægge æg. P 0 orme overføres til en ny seedet plade 1 d efter lysbehandling og dræbte 2 d efter lysbehandling. F 1 orme er udskilt fra P 0 plader. Fænotyper af F 2 orme er undersøgt efter de bliver voksne. Klik her for at se en større version af dette tal.

10fig3.jpg "/>
Figur 3: Eksempel på mutanter (A) Original belastning for optogenetic mutagenese:. CZ20310 juSi164 unc-119 (ED3). Denne stamme har normal kropsform, adfærd, og ruge størrelse. Målestok: 0,5 mm. . (B - D) F 2 afkom viser kropsstørrelse defekt (B), ukoordineret (C), og dødelige (D) fænotyper Klik her for at se en større version af dette tal.

tabel 1
Tabel 1: Genotypebestemmelse af juSi164 og unc-119 (ED3).

tabel 2
Tabel 2: Eksempel på fænotyper frabout en Klonal Screen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her beskriver vi en detaljeret procedure for optogenetic mutagenese hjælp His-mSOG udtryk i kimcellelinje og giver et eksempel på en lille skala fremad genetisk skærm. Sammenlignet med standard kemisk mutagenese, denne optogenetic mutagenese metode har flere fordele. For det første er ikke-toksisk og dermed holde lab personale væk fra toksiske kemiske mutagener, såsom EMS, ENU og trimethylpsoralen med ultraviolet lys (TMP / UV). For det andet kan den eksperimentelle fremgangsmåde for mutagenese anvendes til et lille antal af de P 0 dyrene og kan være færdig inden for en time. For det tredje den optogenetic mutagenese producerer et bredt spektrum af mutationer, herunder nukleotidsubstitutioner og kromosom deletioner. Endelig kan optogenetic mutagenese anvendes til integration af ekstrakromosomale transgener.

Det kritiske trin i dette mutagenese protokol er at sikre, at LED konfiguration fungerer på Hans-mSOG indeholdende stammer abforventede effektivitet. Vi anbefaler at udføre en pilot klonal skærm, som beskrevet i protokol § 3, med omkring 100 haploide genomer. Mutagenesen er let skaleres fra lille skala pilot skærme til nonclonal skærme ved at øge antallet af P 0 for lysbehandling. For store nonclonal skærme, foreslår vi at synkronisere ormene til drægtige unge voksne og overførsel hundredvis af dem med M9 løsning på en CuCl2 plade til lysbehandling. Standarden tilstand beskrevet i trin 2 og 3 skønnes at have ca. 4,4 gange lavere effektivitet end den udbredte 50 mM EMS-mutagenese metode 4. Mutationsraten kan forbedres ved at forøge lys eksponeringstid og / eller øge intensiteten af ​​lyset. Dog kan disse modifikationer forårsage fototoksicitet og føre til små yngel størrelse og sygdom af lys-behandlede orme. At øge effektiviteten, kan det være muligt at anvende miniSOG derivater med højere ROS udbytte sådansom miniSOG (Q103L), selv om det kan øge baggrunden mutagenese effekt uden lys behandling 16,17. For ændring af DNA-konstruktionen, den Pmex-5-HIS-72 :: miniSOG-3'UTR (TBB-2) plasmid (pCZ886) findes i handelen.

Under betingelserne beskrevet her, er integrerede transgener genereres på ca. en linje pr 200 F 1 i gennemsnit 4, når der anvendes et ekstrakromosomalt transgen stamme med en transmissionshastighed på 10 - 30%. Denne effektivitet kan forøges ved anvendelse af ekstrakromosomale transgene stammer med høje transmissionshastigheder som tidligere er rapporteret for en UV-stråling metode 18.

His-mSOG-medieret optogenetic mutagenese inducerer mutationer i en lang række gener. Også frekvensen af loci udvundet fra rpm-1 suppressor skærmen ved hjælp optogenetic mutagenese svarer til dem fra den samme skærm ved hjælp EMS 4. Men det er muble at optogenetic mutagenese under anvendelse af en histon-gen kan have en bias mod visse gener, på grund af ukendte faktorer som chromatinstruktur. For at løse dette problem, er det nødvendigt at analysere mange optogenetically inducerede mutationer ved hele genomet sekventering.

His-mSOG-medieret optogenetic mutagenese forårsager et bredt spektrum af mutationer herunder enkelte nucleotidsubstitutioner og deletioner i området fra 1 bp til nogle få hundrede bp 4. Spektret af enkelt nukleotid-varianter antyder, at miniSOG-inducerede reaktive oxygenspecies er årsag til mutationerne 4. Det er også muligt at miniSOG skader histonproteiner og forårsager chromatin ustabilitet fordi miniSOG anvendes til at inaktivere proteiner såvel 19. Det kan være muligt at manipulere typen af ​​mutationer ved anvendelse af lys af forskellige intensiteter. Da optogenetic mutagenese forårsager deletioner, er det vigtigt at analysere deletioner såvel som enkelte nucleotidændringer i hvemle genom sekventering data for kortlægning 20.

Det blev tidligere rapporteret, at en epifluorescensmikroskop anvendes til miniSOG-medieret celle ablation 21,22. Lysstyrken af en standard epifluorescerende sammensat mikroskop blev målt til at være ~ 0,5 mW / mm2 uden en linse, som er ca. 4x lavere end den, der anvendes i standard optogenetic mutagenese protokol. Således er det yderst tilrådeligt at empirisk bestemme effektiviteten ved brug af en epi-fluorescensmikroskop som lyskilde. En fordel ved LED er stabiliteten over tusinder af timer. Tidligere undersøgelser har vist, at miniSOG er mere potent i ROS-medieret celle ablation under pulserende lys 22, men virkningsmekanismen skal stadig bestemmes. Vi anvendte en digital funktion generator / forstærker til at pulserende lys. En anden mulighed er at forbinde lyskilden til en computer ved hjælp af et USB-TTL-interface (figur 1A) at regulere LED liGHT af et program. LED-systemet er beskrevet her, kan også anvendes til andre formål, såsom optogenetic kontrol over overgearet celler ved hjælp channelrhodopsin 23, celle ablation hjælp mitokondrierelateret eller celle-membran-målrettet miniSOG 17,22, og chromophorgruppe-Assisted Light Inaktivering (CALI) af proteiner 19. Desuden er denne optogenetic mutagenese har potentiale til at blive anvendt på andre organismer, såsom bakterier, gær flyve, og zebrafisk, samt mammale cellelinier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ultra High Power LED light source Prizmatix UHP-mic-LED-460 460 ± 5 nm
LED controller Prizmatix UHPLCC-01
Digital function generator/amplifier PASCO PI-9587C PI-9587C is no longer available. The replacement is PI-8127.
BNC cable male/male THORLABS CA3136
USB-TTL interface Prizmatix Optional
Photometer THORLABS PM50 and Model D10MM
Filter paper Whatman 1001-110
Stereomicroscope Leica MZ95
NGM plate Dissolve 5 g NaCl, 2.5 g Peptone, 20 g Agar, 10 µg/mL cholesterol in 1 L H2O. After autoclaving, add 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mM KH2PO4(pH 6.0). 
Lysis solution 10 mM Tris(pH 8.8), 50 mM KCl, 0.1% Triton X-100, 2.5 mM MgCl2, 100 µg/mL Proteinase K

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nat Rev Genet. 3 (5), 356-369 (2002).
  2. Kutscher, L. M., Shaham, S. Forward and reverse mutagenesis in C. elegans. WormBook. , 1-26 (2014).
  3. Collins, J., Saari, B., Anderson, P. Activation of a transposable element in the germ line but not the soma of Caenorhabditis elegans. Nature. 328 (6132), 726-728 (1987).
  4. Noma, K., Jin, Y. Optogenetic mutagenesis in Caenorhabditis elegans. Nat Commun. 6, 8868 (2015).
  5. Cooke, M. S., Evans, M. D., Dizdaroglu, M., Lunec, J. Oxidative DNA damage: mechanisms, mutation, and disease. FASEB J. 17 (10), 1195-1214 (2003).
  6. Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLoS Biol. 9 (4), 1001041 (2011).
  7. Ruiz-Gonzalez, R., et al. Singlet oxygen generation by the genetically encoded tag miniSOG. J Am Chem Soc. 135 (26), 9564-9567 (2013).
  8. Pimenta, F. M., Jensen, R. L., Breitenbach, T., Etzerodt, M., Ogilby, P. R. Oxygen-dependent photochemistry and photophysics of "miniSOG," a protein-encased flavin. Photochem Photobiol. 89 (5), 1116-1126 (2013).
  9. Frokjaer-Jensen, C., et al. Random and targeted transgene insertion in Caenorhabditis elegans using a modified Mos1 transposon. Nat Methods. 11 (5), 529-534 (2014).
  10. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  11. Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. J Vis Exp. (47), (2011).
  12. Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. (18), (2008).
  13. Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).
  14. Fay, D., Bender, A. Genetic mapping and manipulation: chapter 4--SNPs: introduction and two-point mapping. WormBook. , 1-7 (2006).
  15. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
  16. Westberg, M., Holmegaard, L., Pimenta, F. M., Etzerodt, M., Ogilby, P. R. Rational design of an efficient, genetically encodable, protein-encased singlet oxygen photosensitizer. J Am Chem Soc. 137 (4), 1632-1642 (2015).
  17. Xu, S., Chisholm, A. D. Highly efficient optogenetic cell ablation in C. elegans using membrane-targeted miniSOG. Sci Rep. 6, 21271 (2016).
  18. Mariol, M. C., Walter, L., Bellemin, S., Gieseler, K. A rapid protocol for integrating extrachromosomal arrays with high transmission rate into the C. elegans genome. J Vis Exp. (82), (2013).
  19. Lin, J. Y., et al. Optogenetic inhibition of synaptic release with chromophore-assisted light inactivation (CALI). Neuron. 79 (2), 241-253 (2013).
  20. Minevich, G., Park, D. S., Blankenberg, D., Poole, R. J., Hobert, O. CloudMap: A Cloud-Based Pipeline for Analysis of Mutant Genome Sequences. Genetics. 192 (>4), 1249-1269 (2012).
  21. Qi, Y., Xu, S. MiniSOG-mediated Photoablation in Caenorhabdtis elegans. Bio-protocol. 3 (1), http://www.bio-protocol.org/e316 316 (2013).
  22. Qi, Y. B., Garren, E. J., Shu, X., Tsien, R. Y., Jin, Y. Photo-inducible cell ablation in Caenorhabditis elegans using the genetically encoded singlet oxygen generating protein miniSOG. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (19), 7499-7504 (2012).
  23. Nagel, G., et al. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).

Tags

Genetik genom-dækkende tilfældig mutagenese DNA modifikation ROS histon-miniSOG transgen integration kromosomal sletning frem genetisk screening
Optogenetic Tilfældig mutagenese ved anvendelse histon-miniSOG i<em&gt; C. elegans</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Noma, K., Jin, Y. Optogenetic Random … More

Noma, K., Jin, Y. Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans. J. Vis. Exp. (117), e54810, doi:10.3791/54810 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter