Optogénétiques mutagenèse aléatoire Utilisation Histone-miniSOG dans Published: November 14, 2016 doi: 10.3791/54810

DOI

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Kentaro Noma¹, Yishi Jin^1,2

¹Division of Biological Sciences, Section of Neurobiology, University of California in San Diego and Howard Hughes Medical Institute, ²Department of Cellular and Molecular Medicine, University of California in San Diego School of Medicine and Howard Hughes Medical Institute

Summary

Génétiquement codés histone-miniSOG induit des mutations héréditaires du génome entier d'une manière dépendant de la lumière bleue. Cette méthode de mutagenèse est simple, rapide, exempt de produits chimiques toxiques, et bien adapté pour le dépistage génétique avant et l'intégration du transgène.

Introduction

Écrans génétiques à terme ont été largement utilisés pour générer des mutants génétiques perturbant divers processus biologiques dans des organismes modèles tels que Caenorhabditis elegans (C. elegans) ^1. Les analyses de ces mutants conduisent à la découverte de gènes fonctionnellement importants et de leur voies de signalisation ^1,2. Traditionnellement, la mutagénèse en C. elegans est obtenue en utilisant des produits chimiques mutagènes, le rayonnement, ou transposons ^2. Les produits chimiques tels que le méthanesulfonate d'éthyle (EMS) et N - éthyl - N -nitrosourea (ENU) sont toxiques pour l' homme; rayons gamma ou ultraviolet (UV) mutagenèse de rayonnement nécessite un équipement spécial; et les souches de transposons-actifs tels que des souches mutantes ^3, peuvent causer des mutations inutiles lors de l' entretien. Nous avons développé une approche simple pour induire des mutations héréditaires utilisant un photosensibilisant génétiquement codés ^4.

Reactive Oxygen Species (ROS) peuvent endommager l' ADN ^5.Le générateur de mini - Singlet Oxygen (miniSOG) est une protéine fluorescente verte de 106 acides aminés qui a été conçu à partir de la LOV (Light, oxygène et tension) domaine Arabidopsis phototropin 2 ^6. Lors de l' exposition à la lumière bleue (~ 450 nm), miniSOG génère ERO comprenant de l' oxygène singulet avec fl avine mononucléotide comme cofacteur ^6-8, qui est présent dans toutes les cellules. Nous avons construit une protéine de fusion His-MSOG miniSOG par le marquage à l' extrémité C-terminale de l' histone-72, un C. elegans variante de Histone 3. Nous généré une seule copie transgène ⁹ pour exprimer His-MSOG dans la lignée germinale de C. elegans. Dans des conditions normales de culture dans l'obscurité, les vers transgéniques His-MSOG ont la taille des couvées normale et la durée de vie ^4. Lors de l' exposition à la lumière LED bleue, les vers His-MSOG produisent des mutations héréditaires chez leur progéniture ^4. Le spectre des mutations induites inclut des changements nucléotidiques, tels que G: C à T: A et G: C à C: G et petit chromosome suppressions ^4. Cette procédure de mutagenèse est simple à réaliser et nécessite une configuration minimale de sécurité en laboratoire. Ici, nous décrivons la configuration et les procédures d'éclairage LED pour la mutagenèse optogenetic.

Protocol

1. Construction de l'illuminateur LED

REMARQUE: L'équipement LED requis est résumée dans la liste des matériaux. La configuration LED ensemble est petit et peut être placé n'importe où dans le laboratoire, bien que nous recommandons qu'il soit placé dans une pièce sombre pour contrôler l' exposition la lumière des vers ^4.

1. Branchez le LED à un contrôleur avec des câbles (Figure 1A, D).
2. Connectez le contrôleur à une fonction générateur / amplificateur numérique avec un câble BNC (Figure 1A, C, D).
3. Fixer la lumière 10 cm LED au- dessus du stade en utilisant un support personnalisé (figure 1A).
   NOTE: Nous avons fait le porte avec des pièces métalliques.
4. Couvrir l'installation d'éclairage LED partiellement, mais il faut éviter l' accumulation de chaleur (figure 1B), ce qui rend les vers malades.
   NOTE: Nous utilisons une couverture rigide en plastique sur mesure avec toit ouvrant et en bas (figure 1A). Le couvercle est pas nécessaire pour la mutagenèse elle-même, mais elle est utilisée to limiter l'exposition inutile de la lumière bleue à l'environnement. Nous vous conseillons de ne pas couvrir la configuration LED entièrement (figure 1B) pour éviter la surchauffe des vers.
5. Porter des lunettes de protection laser.
   NOTE: Nous portons des lunettes laser de protection parce que la lumière est très lumineux. Lunettes de soleil peuvent fonctionner aussi bien.
6. Mettez le levier du contrôleur LED 'Int. pour l' éclairage continu (figure 1D) et le fixer à 65% de la puissance maximale (figure 1C).
7. Utilisez un photomètre pour mesurer l'intensité de la lumière bleue sur la scène où les vers sont placés en utilisant le protocole du fabricant. La configuration donne 2,0 mW / mm ² sous illumination continue.

2. Bleu traitement Lumière

NOTE: Utiliser la souche CZ20310 juSi164 [PMEX-5-HIS-72 :: miniSOG-3'UTR (tbb-2) + Cb-unc-119 (+)] unc-119 (ed3) III ⁴ La souche est disponible. au Caenorhabditis Genetics Center (CGC, http: //www.cgc.cbs.umn.edu/).

1. Maintenir la souche His-MSOG dans l'obscurité sur un milieu de croissance des nématodes standard (NGM) plaques avec E. coli OP50 suivant un protocole standard ^10,11.
   REMARQUE: Dans la lumière ambiante, juSi164 souches contenant ne présentent pas un taux de mutation ci - dessus un taux spontané ^4. passage de la souche de routine en utilisant un microscope de dissection avec une lampe halogène en général ne provoque pas de mutations aussi bien. Néanmoins, il faut prendre soin d'éviter l' exposition inutile à la lumière, par exemple, en gardant les souches dans un incubateur sombre à l' intérieur standard, ou couvrant les souches avec une feuille. Il est conseillé de congeler des aliquotes de la souche après l'avoir reçu dans le cas des mutations inutiles accumulent au fil du temps.
2. Choisissez gravide jeune adulte (environ 12 h post-L4) animaux avec un ver ramasser ^11.
   NOTE: Les jeunes animaux montrent moins d' effet mutagène ^4, tandis que les animaux plus âgés peuvent avoir plus faible taille de la couvée.
3. Couper un filtre paper pour adapter une plaque de 60 mm avec un 25 mm x 25 mm trou carré et placer sur une plaque non ensemencée (figure 1E).
   NOTE: Un poinçon carré peut être utilisé, mais la taille du poinçon n'a pas à être précis.
4. Déposez 100 pi de 100 mM CuCl ₂ sur le papier filtre uniformément pour limiter les vers dans le trou carré sur la plaque.
5. Choisissez nombre désiré de gravides jeunes hermaphrodites adultes (voir l' étape 3 pour un exemple) et transférer au centre de la plaque CuCl _2.
6. Porter des lunettes de protection laser.
7. Allumez le LED et le générateur de fonction.
8. Mettez le levier du contrôleur LED 'Ext. pour le contrôler par le générateur de fonction (figure 1D).
9. Régler le régulateur à 65% de la puissance maximale et le générateur de fonction sinusoïdale, 4 Hz (figure 1C).
10. Placer la plaque de l' étape 2.5 CuCl ₂ sans couvercle sur la scène sous la LED (figure 1A </ Strong>).
11. Illuminez les animaux avec la lumière bleue pendant 30 min.
12. Transfert vers la recherche en santé à une plaque ensemencée en tant que P _0.
    NOTE: Le nombre désiré de P ₀ dépend du type d'écran. Voir l'étape 3 pour un exemple. Les P ₀ vers peuvent sembler être coordonnés immédiatement après le traitement et la lumière va récupérer au fil du temps.
13. Gardez les vers couverts en utilisant une feuille dans un incubateur ou dans l'obscurité; et suivez la procédure standard pour commencer le dépistage des phénotypes souhaités parmi leur progéniture ^2,10.

3. Exemple d'un écran génétique Forward

NOTE:. Ceci est un exemple de l'écran clonale avec 120 génomes haploïdes pour vérifier si la LED et la souche travaillent Figure 2 montre un schéma de la procédure.

1. [J1] Après le traitement de la lumière bleue, choisir cinq vers la recherche en santé sur une plaque NGM avec OP50 que P _0, gardez - les dans un incubateur à 20 °, et les laisser pondre pendant 1d (plaque «J1»).
2. [Day2] Transfert P ₀ sur une nouvelle plaque ensemencée (plaque 'Day2').
3. [J3] Choisissez et tuer P ₀ sur la plaque du 'Day2' en les brûlant.
4. [Day4] Choisissez 30 gravide jeune adulte F ₁ de la plaque le «J1» et de les transférer sur des plaques individuelles (30 F ₁ plaques pour 'J1').
5. [J5] Répétez l' étape 3.4 pour la plaque de la 'Day2' (30 F ₁ plaques pour 'Day2').
6. [Day7-9] Vérifiez les morphologies et / ou le comportement de F ₂ vers par rapport à la souche WT (figure 3A) anormaux sous un stéréomicroscope standard quand ils deviennent adultes.
   NOTE: Une mutation héritables affiche environ un quart des vers avec le même phénotype parmi F ₂ quand il est récessif avec une forte pénétrance. Cependant, certains mutants peuvent se développer lentement et / ou montrer pénétrance partielle. Par conséquent, il est possible que moins d'un quart des mutants se trouvent sur uneassiette.
7. Choisissez les vers avec des phénotypes visibles individuellement et vérifier l'héritabilité du phénotype dans la génération suivante.

4. Exemple d'une intégration extrachromosomique Transgène

1. Injecter l'ADN d'intérêt dans CZ20310 juSi164 [PMEX-5-His-72 :: miniSOG-3'UTR (tbb-2) + Cb-unc-119 (+)] unc-119 (ed3) et préparer des vers transgéniques avec faible taux de transmission (10-30%) à la suite d' un ^12,13 de protocole d'injection standard.
   REMARQUE: Vous pouvez également, les tableaux extrachromosomiques établis peuvent être franchies dans les souches juSi164. Afin d' éviter génotypage juSi164, juSi164 hétérozygotes peuvent être utilisés en tant que P ₀ , bien que l' efficacité peut être diminuée. La méthode de génotypage pour juSi164 est décrit à la section 5.
2. [J1] Traiter ~ 20 animaux transgéniques comme P ₀ avec la lumière bleue comme décrit à l' étape 2.
   NOTE: Plus P ₀ vers sont nécessaires en fonction de la tr taux de ansmission. Les transgènes peuvent être identifiés par des phénotypes ou marqueur coinjection ^12,13.
3. Choisissez 10 sain P regardant ₀ sur des plaques individuelles, gardez - les dans un incubateur à 20 °, et les laisser pondre pendant quelques jours (P ₀ plaques)
4. [Day4] Unique sur 20 transgénique F ₁ vers de chaque P ₀ plaque sur des plaques individuelles et les laisser pondre. (20 F ₁ x 10 P ₀ plaques = 200 F ₁ plaques au total.)
5. [J7] Trouver F ₁ plaques avec> 75% F ₂ ayant transgènes.
6. Choisissez cinq animaux transgéniques de la vitesse de transmission> 75% F ₁ plaques (F ₂ plaques).
7. [J10] Gardez F ₂ plaques avec un taux de transmission de 100% sous forme de lignes intégrées potentielles.
8. Outcross les lignes intégrées potentielles en utilisant une procédure standard ¹⁰ pour vérifier la ségrégation mendélienne et de supprimer les mutations de fond potentiels.

le ". Génotypage> 5

1. Lyse 20 F ₂ par croisement vers dans un tampon de lyse en utilisant un protocole standard ^14.
2. Effectuer une PCR en utilisant les amorces pour l' insertion MosSCI ^9, juSi164 (tableau 1) avec une température d'hybridation de 58 ° C suivant un protocole standard ^14.
   NOTE: Il est inutile de génotype unc-119 (ed3) parce unc-119 (ed3) peut être détectée par un comportement non coordonné après le retrait du transgène sauvetage (juSi164) dans les étapes 5.4 et 5.5 ci - après.
3. Exécutez agarose électrophorèse sur gel ¹⁵ et examiner les tailles de bande (tableau 1) pour trouver le WT pour juSi164.
4. Examiner si la F ₂ progéniture a paralysé les vers en raison de l'existence d'unc-119 (ed3).
5. Si les vers non coordonnées se trouvent à l'étape 5.4, simples plusieurs vers nonuncoordinated pour obtenir tous les vers nonuncoordinated dans la prochaine génération.

Representative Results

Nous avons effectué un criblage génétique avant avec CZ20310 juSi164 unc-119 (ed3) en utilisant une exposition lumineuse de 30 min suivant le protocole standard décrit dans les sections 2 et 3. Parmi les 60 F ₁ plaques correspondant à 120 génomes haploïdes mutagénisées, nous avons trouvé 8 F ₁ plaques avec F ₂ vers l' affichage des phénotypes visibles comme défaut de la taille du corps (figure 3B), le mouvement non coordonné (figure 3C), et la létalité des adultes (Figure 3D). On n'a pas remarqué aucune différence dans le nombre de mutants entre «J1» et plaques 'Day2. Tous les descendants de petits pointés F ₂ vers et non coordonnées F ₂ vers montré les phénotypes correspondants, ce qui suggère qu'ils sont des mutants héritables. L'observation complète est résumée dans le tableau 2. En moyenne, un écran clonale avec 120 génomes haploïdes se traduira par environ 10 F ₁ plaques concontenant des vers avec des phénotypes visiblement détectables tels que la forme du corps et de la locomotion qui facilement repérés sous un stéréomicroscope. Une analyse plus quantitative est nécessaire pour déterminer le taux précisément ⁴ de mutation. Le nombre attendu de mutants visibles de cet écran indique que la souche et l'installation fonctionnent correctement pour la mutagenèse optogenetic.

Figure 1:. Le programme d' installation LED (A) L' ensemble du système. La LED a été monté sur un support sur mesure. Détails se trouvent dans la liste des matériaux. (B) Le couvercle est fabriqué en matière plastique. Elle ne couvre pas complètement le système pour éviter l'accumulation de chaleur. (C) Contrôleur et générateur de fonction. (D) Le côté arrière du système. (E) Une plaque non ensemencée avec _CuCl2 papier filtre -soaked pour le traitement de la lumière bleue. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2:. Procédure expérimentale pour un écran clonale Après le traitement de la lumière bleue, P ₀ vers sont transférés à une plaque ensemencée et a permis de pondre des œufs. P ₀ vers sont transférés dans une nouvelle plaque ensemencée 1 j après traitement par la lumière et tué 2 jours après le traitement de la lumière. F ₁ vers sont distingués des P ₀ plaques. Phénotypes de F ₂ vers sont examinés après qu'ils deviennent adultes. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 3: Exemple de Mutants (A) Souche originale pour la mutagenèse optogenetic:. CZ20310 juSi164 unc-119 (ed3). Cette souche a une forme normale du corps, le comportement et la taille des couvées. Barre d'échelle: 0,5 mm. . (B - D) F ₂ progéniture montrant corps défaut de taille (B), manque de coordination (C), et mortelles (D) phénotypes S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Tableau 1: Génotypage de juSi164 et unc-119 (ed3).

Tableau 2: Exemple de phénotypes from un écran clonale.

Discussion

Ici, nous décrivons une procédure détaillée de la mutagenèse optogenetic utilisant His-MSOG exprimé dans la lignée germinale et fournir un exemple d'un écran avant génétique à petite échelle. Par rapport à une mutagenèse chimique standard, ce procédé de mutagenèse optogenetic présente plusieurs avantages. Tout d'abord, il est non toxique, gardant ainsi le personnel de laboratoire loin de mutagènes chimiques toxiques tels que EMS, ENU et triméthylpsoralène avec une lumière ultraviolette (TMP / UV). En second lieu , le mode opératoire de mutagénèse peut être utilisé pour un petit nombre d'animaux P ₀ et peut être terminé en une heure. En troisième lieu, la mutagenèse optogenetic produit un large spectre de mutations comprenant des substitutions de nucleotides et deletions chromosomiques. Enfin, la mutagénèse optogenetic peut être utilisé pour l'intégration de transgènes extrachromosomique.

L'étape critique dans ce protocole de mutagenèse est d'assurer que la configuration LED fonctionne sur ses-MSOG contenant des souches à l'exefficacité inatten-. Nous vous recommandons d'effectuer un écran clonale pilote, tel que décrit dans la section Protocole 3, avec environ 100 génomes haploïdes. La mutagenèse est facilement évolutive des petits écrans pilotes à grande échelle aux écrans nonclonal en augmentant le nombre de P ₀ pour le traitement de la lumière. Pour les écrans nonclonal à grande échelle, nous vous suggérons de synchroniser les vers aux jeunes adultes gravides et de transférer des centaines d'entre eux avec une solution M9 sur une plaque CuCl ₂ pour le traitement de la lumière. La condition standard décrit dans les étapes 2 et 3 est estimée à environ 4,4 fois l' efficacité inférieure à la méthode de mutagenèse mM EMS 50 largement utilisé ^4. Le taux de mutation peut être améliorée en augmentant le temps d'exposition à la lumière et / ou en augmentant l'intensité de la lumière. Cependant, ces modifications peuvent causer phototoxicité et conduire à la petite taille de la couvée et la maladie des vers légers traités. Pour augmenter l'efficacité, il peut être possible d'utiliser des dérivés miniSOG avec un rendement plus élevé ROS telscomme miniSOG (Q103L) même si elle peut augmenter l'effet de fond de mutagenèse sans traitement par la lumière ^16,17. Pour la modification de la construction d'ADN, la PMEX-5-HIS-72-miniSOG :: 3'UTR (TBB-2) plasmide (pCZ886) est disponible dans le commerce.

Dans les conditions décrites ici, les transgènes intégrés sont générés à environ une ligne par 200 F ₁ , en moyenne , ⁴ lors de l' utilisation d' une souche transgénique extrachromosomique avec un taux de 10 transmission - 30%. Cette efficacité peut être augmentée en utilisant des souches transgéniques extrachromosomiques avec des taux élevés de transmission comme indiqué précédemment pour un procédé de rayonnement UV ^18.

His-MSOG médiée par mutagenèse optogenetic induit des mutations dans un large éventail de gènes. En outre, la fréquence des loci récupéré de l'écran suppresseur rpm-1 en utilisant la mutagenèse optogenetic est similaire à ceux de la même écran en utilisant EMS ^4. Cependant, il est possible que la mutagenèse optogenetic utilisant un gène histone peut avoir un parti pris en faveur de certains gènes, en raison de facteurs inconnus tels que la structure de la chromatine. Pour résoudre ce problème, il est nécessaire d'analyser de nombreuses mutations optogenetically induites par le séquençage du génome entier.

His-MSOG mutagénèse à médiation par optogenetic provoque un large spectre de mutations comprenant des substitutions et des deletions allant de 1 pb à quelques centaines de paires de bases nucléotidiques simples ^4. Le spectre de variants d' un seul nucleotide donne à penser que les espèces réactives de l' oxygène induites par miniSOG sont la cause des mutations ^4. Il est également possible que les dommages miniSOG protéines d' histone et provoque l' instabilité en raison chromatine miniSOG est utilisé pour inactiver les protéines ainsi ^19. Il peut être possible de manipuler le type de mutations à l'aide de la lumière de différentes intensités. Depuis mutagenèse optogenetic provoque des suppressions, il est important d'analyser les suppressions ainsi que des modifications de nucléotides simples dans quidonnées le génome de séquençage pour la cartographie ^20.

Il a été précédemment rapporté qu'un microscope à épifluorescence est utilisé pour miniSOG médiée par l' ablation des cellules ^21,22. L'intensité lumineuse d'un microscope à épifluorescence composé standard a été mesurée comme étant de ~ 0,5 mW / mm ² sans lentille, qui est d' environ 4 x inférieure à celle utilisée dans le protocole de mutagénèse optogenetic standard. Ainsi, il est fortement conseillé de déterminer empiriquement l'efficacité lors de l'utilisation d'un microscope à épi-fluorescence comme source de lumière. Un avantage de la LED est la stabilité sur des milliers d'heures. Des études antérieures ont montré que miniSOG est plus puissant dans l' ablation des cellules ROS médiée par la lumière pulsée ^22, bien que le mécanisme précis reste à déterminer. Nous avons utilisé une fonction générateur / amplificateur numérique pour faire la lumière pulsée. Une autre option consiste à connecter la source de lumière à un ordinateur via une interface USB-TTL (figure 1A) pour réguler la li LEDGHT par un programme. Le système de LED décrit ici peut également être utilisé à d' autres fins, telles que le contrôle optogenetic des cellules excitables utilisant channelrhodopsin ^23, l' ablation de cellules en utilisant mitochondria- ou membrane cellulaire ciblée miniSOG ^17,22 et Chromophore assistée Lumière Inactivation (CALI) de des protéines ^19. En outre, cette mutagénèse optogenetic a le potentiel d'être appliquée à d'autres organismes tels que les bactéries, les levures, la mouche et le poisson zèbre, ainsi que des lignées cellulaires de mammifères.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ultra High Power LED light source	Prizmatix	UHP-mic-LED-460	460 ± 5 nm
LED controller	Prizmatix	UHPLCC-01
Digital function generator/amplifier	PASCO	PI-9587C	PI-9587C is no longer available. The replacement is PI-8127.
BNC cable male/male	THORLABS	CA3136
USB-TTL interface	Prizmatix		Optional
Photometer	THORLABS	PM50 and Model D10MM
Filter paper	Whatman	1001-110
Stereomicroscope	Leica	MZ95
NGM plate			Dissolve 5 g NaCl, 2.5 g Peptone, 20 g Agar, 10 µg/mL cholesterol in 1 L H2O. After autoclaving, add 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mM KH2PO4(pH 6.0).
Lysis solution			10 mM Tris(pH 8.8), 50 mM KCl, 0.1% Triton X-100, 2.5 mM MgCl2, 100 µg/mL Proteinase K