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Genetics

Optogenetische Zufallsmutagenese Mit Histon-miniSOG in Published: November 14, 2016 doi: 10.3791/54810
Automatic Translation
1, 1,2
1Division of Biological Sciences, Section of Neurobiology, University of California in San Diego and Howard Hughes Medical Institute, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, University of California in San Diego School of Medicine and Howard Hughes Medical Institute

Summary

Genetisch kodierte Histon-miniSOG induziert genomweite vererbbare Mutationen in einem blauen Licht abhängig. Diese Mutagenese-Methode ist einfach, schnell, frei von giftigen Chemikalien und gut geeignet für vorwärts genetisches Screening und Transgen-Integration.

Introduction

Vorwärts genetischen Screens wurden verschiedene biologische Prozesse in Modellorganismen genetische Mutanten zu erzeugen , zu stören wie Caenorhabditis elegans (C. elegans) 1 weit verbreitet. Analysen solcher Mutanten führen zur Entdeckung von funktionell wichtigen Gene und ihre Signalwege 1,2. Traditionell Mutagenese in C elegans unter Verwendung mutagener Chemikalien erreicht, Strahlung oder Transposonen 2. Chemikalien , wie beispielsweise Ethylmethansulfonat (EMS) und N - Ethyl - N -nitrosourea (ENU) sind für den Menschen giftig; gamma-Strahlen oder Ultraviolett (UV) -Strahlung Mutagenese erfordert spezielle Ausrüstung; und Transposon-aktiven Stämmen wie Mutatorstämme 3 können unnötige Mutationen während der Wartung führen. Wir haben eine einfache Ansatz entwickelt vererbbare Mutationen zu induzieren 4 eine genetisch kodierte Photosensibilisator verwendet wird .

Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) können DNA 5 beschädigen.Der Mini - Singlet Sauerstoff - Generator (miniSOG) ist ein grün fluoreszierendes Protein von 106 Aminosäuren, die von der LOV (Licht, Sauerstoff und Voltage) Domäne von Arabidopsis Phototropin 2 6 entwickelt wurde. Bei Bestrahlung mit blauem Licht (~ 450 nm), miniSOG ROS erzeugt , einschließlich Singulett - Sauerstoff mit fl avin Mononukleotid als Cofaktor 6-8, die in allen Zellen vorhanden ist. Wir konstruierten eine His-Fusionsprotein durch MSOG miniSOG an den C-Terminus von Histon-72, ein C - Tagging elegans Variante von Histon 3. Wir erzeugten eine Einzelkopie - Transgen 9 His-MSOG in der Keimbahn von C. auszudrücken elegans. Unter normalen Kulturbedingungen in der Dunkelheit, die His-MSOG transgenen Würmer haben normale Brut Größe und Lebensdauer 4. Bei Bestrahlung mit blauem LED - Licht, die His-MSOG Würmer produzieren vererbbare Mutationen unter ihren Nachkommen 4. Das Spektrum der induzierten Mutationen umfasst Nukleotidänderungen, wie G: C zu T: A und G: C zu C: G, und kleine chromosome Löschungen 4. Dieses Mutagenese Verfahren ist einfach durchzuführen und erfordert nur minimale Laborsicherheit Setup. Hier beschreiben wir die LED-Beleuchtung Einrichtung und Verfahren für optogenetische Mutagenese.

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Protocol

1. Aufbau der LED-Illuminator

HINWEIS: Die erforderliche LED-Geräte sind in der Liste der Materialien zusammengefasst. Die gesamte LED - Setup ist klein und kann überall im Labor aufgestellt werden, obwohl wir es empfehlen , in einem dunklen Raum platziert werden 4 Lichtexposition von Würmern zu steuern.

  1. Schließen Sie das LED an einen Controller mit Kabel (1A, D).
  2. Schließen Sie den Controller an einen digitalen Funktionsgenerator / Verstärker mit einem BNC - Kabel (Abbildung 1A, C, D).
  3. Befestigen Sie die LED - Leuchte 10 cm über der Bühne einen benutzerdefinierten Halter (Abbildung 1A).
    HINWEIS: Es wird der Halter mit Metallteilen.
  4. Decken Sie die LED - Beleuchtung Einrichtung teilweise, aber Wärmestau (1B) zu vermeiden, die Würmer krank macht.
    HINWEIS: Wir verwenden eine maßgeschneiderte Hartplastikhülle mit oben und unten offen (Abbildung 1A). Der Deckel ist für die Mutagenese selbst ist nicht erforderlich, wird aber verwendet to begrenzen unnötige Exposition des blauen Lichts in die Umgebung. Wir empfehlen nicht den LED - Setup völlig abdecken (Abbildung 1B) eine Überhitzung der Würmer zu verhindern.
  5. Tragen Sie Laser-Schutzbrille.
    HINWEIS: Wir tragen Laser-Schutzbrille, weil das Licht sehr hell ist. Sonnenbrille kann auch arbeiten.
  6. Schalten Sie den Hebel des LED-Controller auf "Int." für kontinuierliche Beleuchtung (1D) und es bei 65% der maximalen Leistung (1C) eingestellt.
  7. Verwenden Sie ein Photometer die blaue Lichtintensität auf der Bühne zu messen, wo die Würmer gestellt werden Protokoll des Herstellers verwendet wird. Das Setup gibt 2,0 mW / mm 2 unter kontinuierlicher Beleuchtung.

2. Blau-Licht-Behandlung

HINWEIS: Verwenden Sie den Stamm CZ20310 juSi164 [pMEX-5-HIS-72 :: miniSOG-3'UTR (TBB-2) + Cb-unc-119 (+)] unc-119 (ed3) III 4 Der Stamm ist verfügbar. am Caenorhabditis Genetics Center (CGC, http: //www.cgc.cbs.umn.edu/).

  1. Pflegen Sie den His-MSOG Stamm im Dunkeln auf Standard - Nematode Wachstumsmedium (NGM) Platten mit E. coli OP50 nach einem Standardprotokoll 10,11.
    HINWEIS: Unter Umgebungslicht, juSi164 haltigen Stämme mit einer Mutationsrate über einer spontanen Rate 4 nicht angezeigt werden soll . Routine Stamm Durchgang einen Binokular mit einer Halogenlampe mit im Allgemeinen nicht Mutationen auch verursacht. Dennoch sollte darauf unnötige Lichteinwirkung vermieden wird, zum Beispiel mit den Stämmen in einem Standard - dunkel innerhalb Inkubator zu halten, oder Abdecken der Stämme mit Folie. Es wird empfohlen, Teilmengen des Stammes einzufrieren, nachdem es im Fall unnötige Mutationen ansammeln im Laufe der Zeit zu empfangen.
  2. Pick - trächtige junge Erwachsene (ca. 12 h nach L4) Tiere mit einem Wurm Pick 11.
    HINWEIS: Die kleinen Tiere zeigen weniger mutagene Wirkung 4, während ältere Tiere niedriger Brut Größe haben können.
  3. Schneiden Sie einen Filter paper eine 60 - mm - Platte mit 25 mm x 25 mm Vierkantloch und setzen auf eine ungeimpfte Platte (Abbildung 1E) zu passen.
    HINWEIS: Ein quadratisches punch verwendet werden kann, aber die Größe des Stempels muss nicht genau zu sein.
  4. Drop 100 ul 100 mM CuCl 2 auf dem Filterpapier gleichmäßig Würmer auf der Platte innerhalb der quadratischen Öffnung zu beschränken.
  5. Wählen Sie gewünschte Anzahl von trächtigen jungen Erwachsenen Hermaphroditen (siehe Schritt 3 für ein Beispiel) und Transfer zum Zentrum der CuCl 2 - Platte.
  6. Tragen Laserschutzbrille.
  7. Schalten Sie das LED und den Funktionsgenerator.
  8. Schalten Sie den Hebel des LED-Controller zu "Ext." zu steuern , es wird von dem Funktionsgenerator (Figur 1D).
  9. Stellen Sie den Regler auf 65% der maximalen Leistung und den Funktionsgenerator als Sinuswelle, 4 Hz (1C).
  10. Legen Sie die CuCl 2 - Platte aus Schritt 2.5 ohne Deckel auf der Bühne unter der LED (1A </ Strong>).
  11. Illuminate die Tiere mit blauem Licht für 30 min.
  12. Übertragen Sie gesund aussehende Würmer auf eine geimpfte Platte als P 0.
    HINWEIS: Die gewünschte Anzahl von P 0 ist abhängig von der Art des Bildschirms. Siehe Schritt 3 für ein Beispiel. Die P 0 Würmer erscheinen nach der Lichtbehandlung unkoordiniert sofort sein und wird im Laufe der Zeit zu erholen.
  13. Halten Sie Würmer abgedeckt mit Folie in einem Inkubator oder im Dunkeln; und folgen Sie dem Standardverfahren zu beginnen , bei ihren Nachkommen 2,10 gewünschten Phänotypen Screening.

3. Beispiel eines Forward genetischen Screen

. ANMERKUNG: Dies ist ein Beispiel für die klonale Bildschirm mit 120 haploiden Genomen zu überprüfen , ob die LED und Belastung arbeiten Abbildung 2 zeigt ein Schema des Verfahrens.

  1. [Day1] Nach blaues Licht Behandlung, Pick fünf gesunde Würmer auf eine NGM Platte mit OP50 als P 0, halten sie in einem 20 ° C Inkubator suchen, und lassen Sie sie Eier legen für 1d ( 'Day1' Schild).
  2. [Day2] Übertragung P 0 auf eine neue ausgesät Platte ( 'Day2' Schild).
  3. [Day3] Pick - and - Platte P 0 auf der 'Day2' töten sie durch Verbrennen.
  4. [Day4] 30 trächtige jungen Erwachsenen F - Pick 1 von der Platte "Tag1" und sie auf einzelnen Platten (30 F 1 Platten für 'Day1') übertragen.
  5. [Day5] Wiederholen Sie Schritt 3.4 für die 'Day2' Platte (30 F 1 Platten für 'Day2').
  6. Prüfen Sie [Day7-9] , um die anomalen Morphologien und / oder das Verhalten von F 2 Würmer im Vergleich zum WT - Stamm (3A) unter einer Standardstereo , wenn sie erwachsen werden.
    Hinweis: Um eine vererbbare Mutation zeigt etwa ein Viertel der Würmer mit dem gleichen Phänotyp unter F 2 , wenn es mit hoher Penetranz rezessiv ist. Allerdings wachsen einige Mutanten können langsam und / oder Teil Penetranz zeigen. Daher ist es möglich, dass weniger als ein Viertel der Mutanten auf eine gefunden werden kannTeller.
  7. Pick-Würmer mit sichtbaren Phänotypen individuell und überprüfen Sie die Erblichkeit des Phänotyps in der nächsten Generation.

4. Beispiel eines extrachromosomalen Transgene Integration

  1. Injizieren Sie die DNA von Interesse in CZ20310 juSi164 [pMEX-5-HIS-72 :: miniSOG-3'UTR (TBB-2) + Cb-unc-119 (+)] unc-119 (ed3) und bereiten transgene Würmer mit einem niedrige Übertragungsrate (10-30%) nach einem Standard - Injektionsprotokoll 12,13.
    HINWEIS: Alternativ etablierte extrachromosomale Arrays können in die juSi164 Stämme gekreuzt werden. Um zu vermeiden , Genotypisierung für juSi164, juSi164 Heterozygoten kann als P verwendet werden 0 obwohl Effizienz könnte verringert werden. Die Genotypisierung Methode für juSi164 wird in Abschnitt 5 beschrieben.
  2. [Day1] Saures ~ 20 transgene Tiere als P 0 mit blauem Licht wie in Schritt 2 beschrieben.
    HINWEIS: Weitere P 0 Würmer sind notwendig , je nach tr ansmission Rate. Transgene können durch Phänotypen oder Co - Injektion Marker 12,13 identifiziert werden.
  3. Wählen Sie 10 gesund aussehende P 0 auf einzelnen Platten, halten sie in einem 20 ° C Inkubator, und lassen Sie sie legen Eier für ein paar Tage (P 0 Platten)
  4. Einzel aus 20 transgenen F 1 Würmer aus jeder P 0 Platte [Day4] auf einzelne Platten und lassen sie Eier legen. (20 F 1 x 10 P 0 Platten = 200 F 1 Platten insgesamt.)
  5. [Day7] Finden F 1 Platten mit> 75% F 2 mit Transgene.
  6. Wählen Sie fünf transgenen Tiere aus dem> 75% Übertragungsrate F 1 - Platten (F 2 Platten).
  7. [Day10] Halten Sie F 2 - Platten mit 100% Übertragungsrate als potentielle integrierte Linien.
  8. Auskreuzung die möglichen integrierten Linien ein Standardverfahren 10 mit der Mendelschen Segregation zu überprüfen und mögliche Hintergrundmutationen entfernen.
le "> 5. Genotypisierung

  1. Lyse 20 kreuzt F 2 Würmer in Lysepuffer mit einem Standardprotokoll 14.
  2. Führen PCR unter Verwendung der Primer für MosSCI Insertion 9, juSi164, (Tabelle 1) mit einer Annealingtemperatur von 58 ° C nach einem Standardprotokoll 14.
    HINWEIS: Es ist nicht notwendig , unc-119 (ed3) , weil unc-119 (ed3) durch unkoordinierte Verhalten nachgewiesen werden , zu dem Genotyp nach der Rettung von Transgen (juSi164) in den folgenden Schritte 5.4 und 5.5 zu entfernen.
  3. Führen Sie Agarose - Gelelektrophorese 15 und die Bandgrößen (Tabelle 1) untersuchen die WT für juSi164 zu finden.
  4. Überprüfen Sie, ob die F 2 Nachkommen Würmer aufgrund der Existenz von unc-119 (ed3) gelähmt hat.
  5. Wenn unkoordiniert Würmer auf Schritt 5.4, einzelne mehrere nonuncoordinated Würmer alle nonuncoordinated Würmer in der nächsten Generation zu finden sind erhalten.

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Representative Results

Wir führten eine vorwärts genetischen Bildschirm mit CZ20310 juSi164 unc-119 (ed3) 30 min Belichtung mit nach dem Standardprotokoll in den Abschnitten 2 und 3 unter 60 F 1 Platten bis 120 mutagenisiert haploide Genome entspricht, fanden wir 8 F 1 Platten mit F 2 Würmer sichtbar Phänotypen wie Körpergröße Defekt (3B), unkoordinierte Bewegung (3C) und Erwachsenen Letalität (3D) angezeigt wird . Wir bemerken keinen Unterschied in der Anzahl der Mutanten zwischen "Tag1" und "Day2 'Platten. Alle Nachkommen von vereinzelten kleinen F 2 Würmer und unkoordiniert F 2 Würmer zeigten die entsprechenden Phänotypen, was darauf hindeutet , dass sie vererbbar Mutanten. Die vollständige Beobachtung ist in Tabelle 2 zusammengefasst. Im Durchschnitt ein klonalen Bildschirm mit 120 haploide Genome in etwa 10 F 1 Platten führen conTaining Würmer mit sichtbar nachweisbaren Phänotypen wie Körperform und Fortbewegung, die unter einem Stereomikroskop leicht zu erkennen. Weitere quantitative Analyse ist notwendig , um die Mutationsrate genau 4 zu bestimmen. Die erwartete Anzahl der sichtbaren Mutanten von diesem Bildschirm legt nahe, dass die Belastung und das Setup richtig funktionieren für optogenetische Mutagenese.

Abbildung 1
Abb . 1: Die LED - Setup (A) Das ganze System. Die LED wurde auf einem maßgeschneiderten Halter montiert. Einzelheiten sind in der Liste der Materialien gefunden. (B) Der Deckel ist aus Kunststoff gefertigt. Es ist nicht das System vollständig bedecken einen Wärmestau zu vermeiden. (C) Regler und Funktionsgenerator. (D) Die Rückseite des Systems. (E) Eine ungeimpfte Platte mit CuCl 2 -soaked Filterpapier für blaues Licht Behandlung. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2:. Versuchsdurchführung für einen Geklonte Bildschirm Nach blaues Licht Behandlung, P 0 Würmer auf eine geimpfte Platte übertragen und erlaubt Eier zu legen. P 0 Würmer werden in eine neue ausgesät Platte 1 d nach der Lichtbehandlung transferiert und getötet 2 d nach der Lichtbehandlung. F 1 Würmer werden aus den P 0 - Platten vereinzelt. Die Phänotypen von F 2 Würmer untersucht werden , nachdem sie erwachsen werden. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

10fig3.jpg "/>
Abbildung 3: Beispiel für Mutants (A) Original - Stamm für optogenetische Mutagenese. CZ20310 juSi164 unc-119 (ed3). Dieser Stamm hat normale Körperform, das Verhalten und der Brut. Maßstabsbalken: 0,5 mm. . (B - D) F 2 Nachkommen zeigt Körpergröße Defekt (B), unkoordinierte (C) und tödlich (D) Phänotypen Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Tabelle 1
Tabelle 1: Genotypisierung von juSi164 und unc-119 (ed3).

Tabelle 2
Tabelle 2: Beispiel für Phänotypen from einer klonalen Bildschirm.

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Discussion

Hier beschreiben uns ein detailliertes Verfahren von optogenetische Mutagenese unter Verwendung von His-MSOG in der Keimbahn exprimiert und ein Beispiel für einen kleinen Maßstab vorwärts genetischen Bildschirm liefern. Im Vergleich zu Standard chemische Mutagenese weist dieses optogenetische Mutagenese Methode mehrere Vorteile. Zum einen ist es ungiftig, dadurch hält das Laborpersonal weg von giftigen chemischen Mutagenen wie EMS, ENU und Trimethylpsoralen mit ultraviolettem Licht (TMP / UV). Zweitens kann das experimentelle Verfahren der Mutagenese für eine kleine Anzahl von P 0 Tieren verwendet werden und kann innerhalb einer Stunde abgeschlossen sein. Drittens erzeugt die optogenetische Mutagenese ein breites Spektrum an Mutationen einschließlich Nukleotidsubstitutionen und Chromosom Deletionen. Schließlich kann die optogenetische Mutagenese zur Integration von extrachromosomalen Transgene verwendet werden.

Der entscheidende Schritt in diese Mutagenese-Protokoll ist, um sicherzustellen, dass die LED-Setup funktioniert auf His-MSOG enthaltenden Stämme bei der Exvoraussichtlich Effizienz. Wir empfehlen, einen Pilot klonalen Bildschirm durchführen, wie in Protokoll Abschnitt 3, mit etwa 100 haploide Genome beschrieben. Die Mutagenese ist leicht skalierbar von den kleinen Pilot Bildschirme nonclonal Bildschirme durch die Anzahl der P 0 für die Lichtbehandlung zu erhöhen. Für Groß nonclonal Bildschirme, empfehlen wir die Synchronisierung die Würmer trächtige junge Erwachsene und Hunderte von ihnen mit M9 Lösung auf eine CuCl 2 Platte für Lichtbehandlung zu übertragen. Die Standardbedingungen in den Schritten 2 und 3 wird geschätzt auf etwa das 4,4 - fache geringeren Wirkungsgrad als die weit verbreitete 50 mM EMS Mutagenese Methode 4 aufweisen. Die Mutationsrate kann durch Erhöhen der Belichtungszeit und / oder die Erhöhung der Intensität des Lichts verbessert werden. Allerdings können diese Modifikationen Phototoxizität verursachen und zu kleine Brut Größe und Krankheit von Licht behandelten Würmer führen. Um die Effizienz zu erhöhen, kann es möglich sein, miniSOG Derivate mit höheren ROS Ausbeute solche zu verwenden,wie miniSOG (Q103L) , obwohl sie den Hintergrund Mutagenese Effekt ohne Lichtbehandlung 16,17 erhöhen. Zur Modifizierung des DNA - Konstrukts, das pMEX-5-HIS-72 :: miniSOG-3'UTR (TBB-2) Plasmid (pCZ886) ist kommerziell erhältlich.

Unter den hier beschriebenen Bedingungen, werden auf etwa eine Zeile pro 200 F 1 im Durchschnitt 4 integrierte Transgene erzeugt wird, wenn ein extrachromosomales transgenen Stamm mit einer Übertragungsrate von 10 unter Verwendung von - 30%. Diese Effizienz kann für eine UV - Strahlung Methode 18 berichtet , wie zuvor unter Verwendung von extrachromosomalen transgenen Stämme mit hohen Übertragungsraten erhöht werden.

His-MSOG-vermittelte optogenetische Mutagenese induziert Mutationen in einer Vielzahl von Genen. Außerdem ist die Frequenz von Loci aus dem rpm-1 Suppressor - Screen unter Verwendung optogenetische Mutagenese gewonnen ähnlich denen aus dem gleichen Bildschirm mit EMS 4. Es ist jedoch mögBLE, dass die optogenetische Mutagenese ein Histon-Gen unter Verwendung einer Vorspannung kann auf bestimmte Gene, aufgrund unbekannter Faktoren wie Chromatinstruktur. Um dieses Problem zu beheben, ist es notwendig, viele optogenetically induzierte Mutationen durch Sequenzierung ganzer Genome zu analysieren.

His-MSOG vermittelte optogenetische Mutagenese verursacht ein breites Spektrum von Mutationen einschließlich Einzel - Nukleotid - Substitutionen und im Bereich Deletionen von 1 bp auf ein paar hundert bp 4. Das Spektrum der einzelnen Nucleotid - Varianten legt nahe , dass miniSOG induzierter reaktiver Sauerstoffspezies die Ursache der Mutationen sind 4. Es ist auch möglich , dass miniSOG Schäden Proteine Histon und verursacht Instabilität Chromatin weil miniSOG verwendet Proteine sowie 19 zu inaktivieren. Es kann möglich sein, die Art der Mutationen unter Verwendung von Licht von unterschiedlichen Intensitäten zu manipulieren. Da optogenetische Mutagenese Deletionen verursacht, ist es wichtig, Deletionen sowie Einzel-Nukleotid-Veränderungen, die zu analysierenle Genomsequenzdaten für die Zuordnung von 20.

Es wurde zuvor berichtet , dass ein Epifluoreszenz - Mikroskop zur miniSOG-vermittelten Zell - Ablation 21,22 verwendet wird. Die Lichtintensität eines Standardmikroskop Epifluoreszenz Verbindung wurde gemessen ~ 0,5 mW / mm 2 ohne eine Linse sein, die 4x ist etwa geringer als die in der Norm optogenetische Mutagenese - Protokoll verwendet. Somit ist es sehr ratsam, um empirisch die Effizienz bestimmen, wann ein Epi-Fluoreszenzmikroskop als Lichtquelle verwendet wird. Ein Vorteil der LED ist die Stabilität über Tausende von Stunden. Frühere Studien haben gezeigt , dass miniSOG potenter ist in ROS-vermittelten Zell - Ablation unter gepulstem Licht 22, obwohl der genaue Mechanismus zu bestimmen bleibt. Wir verwendeten einen digitalen Funktionsgenerator / Verstärker gepulstes Licht zu machen. Eine weitere Option ist die Lichtquelle zu einem Computer zu verbinden über ein USB-TTL - Schnittstelle (Abbildung 1A) , um die LED - li zu regulierendurch ein Programm ght. Die LED hier beschriebene System kann auch für andere Zwecke verwendet werden, wie zum Beispiel optogenetische Kontrolle von erregbaren Zellen Kanalrhodopsin mit 23, mit Zellablation mitochondria- oder Zell-Membran-bezogene miniSOG 17,22 und Chromophor-Assisted Licht Inaktivierung (CALI) von Proteine 19. Ferner ist diese optogenetische Mutagenese hat das Potential, auf andere Organismen, wie Bakterien, Hefe angewendet werden, fliegen und Zebrabärbling sowie Säugerzelllinien.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ultra High Power LED light source Prizmatix UHP-mic-LED-460 460 ± 5 nm
LED controller Prizmatix UHPLCC-01
Digital function generator/amplifier PASCO PI-9587C PI-9587C is no longer available. The replacement is PI-8127.
BNC cable male/male THORLABS CA3136
USB-TTL interface Prizmatix Optional
Photometer THORLABS PM50 and Model D10MM
Filter paper Whatman 1001-110
Stereomicroscope Leica MZ95
NGM plate Dissolve 5 g NaCl, 2.5 g Peptone, 20 g Agar, 10 µg/mL cholesterol in 1 L H2O. After autoclaving, add 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mM KH2PO4(pH 6.0). 
Lysis solution 10 mM Tris(pH 8.8), 50 mM KCl, 0.1% Triton X-100, 2.5 mM MgCl2, 100 µg/mL Proteinase K

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References

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