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Genetics

Optogenetic यादृच्छिक mutagenesis में Histone-miniSOG का प्रयोग Published: November 14, 2016 doi: 10.3791/54810
Automatic Translation
1, 1,2
1Division of Biological Sciences, Section of Neurobiology, University of California in San Diego and Howard Hughes Medical Institute, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, University of California in San Diego School of Medicine and Howard Hughes Medical Institute

Summary

आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग हिस्टोन-miniSOG एक नीली बत्ती पर निर्भर ढंग से जीनोम चौड़ा पैतृक म्यूटेशन लाती है। इस mutagenesis विधि सरल, तेज, जहरीले रसायनों से मुक्त है, और आगे आनुवंशिक स्क्रीनिंग और transgene एकीकरण के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है।

Introduction

आगे आनुवंशिक स्क्रीन व्यापक रूप से इस तरह के Caenorhabditis एलिगेंस (एलिगेंस) 1 के रूप में मॉडल जीवों में विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं में खलल न डालें आनुवंशिक म्यूटेंट उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। ऐसे म्यूटेंट का विश्लेषण कार्यात्मक महत्वपूर्ण जीन की खोज करने के लिए नेतृत्व और उनके संकेत दे रास्ते 1,2। परंपरागत रूप से, सी में mutagenesis एलिगेंस mutagenic रसायन, विकिरण, या transposons 2 का उपयोग कर हासिल की है। ऐसे एथिल methanesulfonate (ईएमएस) और एन एन -ethyl- -nitrosourea (ENU) मनुष्य के लिए विषाक्त कर रहे हैं के रूप में रसायन; गामा-रे या पराबैंगनी (यूवी) विकिरण म्युटाजेनेसिस विशेष उपकरणों की आवश्यकता है; और इस तरह mutator उपभेदों 3, के रूप में transposon सक्रिय तनाव, रखरखाव के दौरान अनावश्यक म्यूटेशन पैदा कर सकता है। हम एक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग photosensitizer 4 का उपयोग पैतृक म्यूटेशन प्रेरित करने के लिए एक सरल दृष्टिकोण विकसित किया है।

रिएक्टिव ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) डीएनए 5 नुकसान पहुंचा सकता है।मिनी स्वेटर ऑक्सीजन जनरेटर (miniSOG) 106 अमीनो एसिड होता है जो LOV (प्रकाश, ऑक्सीजन, और वोल्टेज) से इंजीनियर था Arabidopsis phototropin 2 से 6 के डोमेन का हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन होता है। नीले प्रकाश (~ 450 एनएम), miniSOG के लिए जोखिम पर आरओएस एक सहायक कारक 6-8, जो सभी कोशिकाओं में मौजूद है के रूप में फ्लोरिडा Avin mononucleotide साथ स्वेटर ऑक्सीजन सहित उत्पन्न करता है। हम हिस्टोन -72, एक सी सी टर्मिनस के लिए miniSOG टैगिंग से एक उनकी mSOG संलयन प्रोटीन का निर्माण Histone 3. की एलिगेंस संस्करण हम सी के germline में उनकी mSOG व्यक्त करने के लिए एक एकल कॉपी ट्रांस्जीन 9 उत्पन्न एलिगेंस। अंधेरे में सामान्य संस्कृति शर्तों के तहत, उनकी mSOG ट्रांसजेनिक कीड़े सामान्य चिंता आकार और जीवन काल 4 लोगों की है। नीले एलईडी प्रकाश के संपर्क करने पर, उनकी mSOG कीड़े उनके वंशज 4 के बीच पैतृक म्यूटेशन का उत्पादन। टी करने के लिए C: एक और जी: सी सी: जी, और छोटे chromoso प्रेरित म्यूटेशन के स्पेक्ट्रम ऐसे जी के रूप में न्यूक्लियोटाइड परिवर्तन भी शामिल है,मेरे 4 विलोपन। इस mutagenesis प्रक्रिया का प्रदर्शन करने के लिए आसान है, और कम से कम प्रयोगशाला सुरक्षा सेटअप की आवश्यकता है। यहाँ, हम एलईडी रोशनी सेटअप और optogenetic mutagenesis के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन।

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Protocol

1. एलईडी प्रकाशक का निर्माण

नोट: आवश्यकता एलईडी उपकरण सामग्री की सूची में संक्षेप। पूरे एलईडी सेटअप छोटा है और प्रयोगशाला में कहीं भी रखा जा सकता है, हालांकि हम अनुशंसा करते हैं कि यह एक अंधेरे कमरे कीड़े 4 के प्रकाश जोखिम को नियंत्रित करने में रखा जा सकता है।

  1. केबल (चित्रा 1 ए, डी) के साथ एक नियंत्रक करने के लिए एलईडी कनेक्ट।
  2. एक BNC केबल (चित्रा 1 ए, सी, डी) के साथ एक डिजिटल समारोह जनरेटर / एम्पलीफायर को नियंत्रक कनेक्ट।
  3. मंच के ऊपर एलईडी प्रकाश 10 सेमी एक कस्टम धारक (चित्रा 1 ए) का उपयोग ठीक करें।
    नोट: हम धातु भागों के साथ धारक बना दिया।
  4. एलईडी रोशनी सेटअप आंशिक रूप से कवर, लेकिन गर्मी संचय (चित्रा 1 बी), जो कीड़े बीमार बना देता है से बचें।
    नोट: हम खुले ऊपर और नीचे (चित्रा 1 ए) के साथ एक कस्टम बनाया हार्ड प्लास्टिक कवर का उपयोग करें। कवर म्युटाजेनेसिस खुद के लिए आवश्यक नहीं है, लेकिन टी प्रयोग किया जाता हैओ परिवेश को नीले रंग की रोशनी के अनावश्यक जोखिम को सीमित। हम एलईडी सेटअप पूरी तरह से (चित्रा 1 बी) के कीड़े overheating रोकने के लिए कवर नहीं करने की सलाह है।
  5. लेजर सुरक्षा चश्मा पहनें।
    नोट: हम लेजर सुरक्षा चश्मा पहनते हैं, क्योंकि प्रकाश बहुत उज्ज्वल है। धूप का चश्मा के रूप में अच्छी तरह से काम कर सकते हैं।
  6. करने के लिए एलईडी नियंत्रक के लीवर स्विच 'इंट।' सतत रोशनी (चित्रा -1) के लिए है और यह अधिकतम शक्ति (चित्रा 1 सी) के 65% पर सेट।
  7. मंच है जहां कीड़े निर्माता प्रोटोकॉल का उपयोग कर रखा जाता है पर नीले रंग के प्रकाश की तीव्रता को मापने के लिए एक दीप्तिमापी का प्रयोग करें। सेटअप 2.0 मेगावाट / 2 मिमी निरंतर रोशनी के तहत देता है।

2. ब्लू लाइट उपचार

नोट: तनाव CZ20310 juSi164 का प्रयोग करें [Pmex-5-his-72 :: miniSOG-3'UTR (TBB -2) + CB-यूएनसी-119 (+)] यूएनसी-119 (ed3) तृतीय 4 तनाव उपलब्ध है। Caenorhabditis जेनेटिक्स केंद्र (CGC पर, http: //www.cgc.cbs.umn.edu/)।

  1. मानक निमेटोड विकास मध्यम (एन जी एम) पर अंधेरे में उनकी mSOG तनाव बनाए रखने के ई के साथ प्लेटों कोलाई OP50 एक मानक प्रोटोकॉल 10,11 के बाद।
    नोट: परिवेश प्रकाश के तहत, juSi164 युक्त उपभेदों एक सहज दर 4 से ऊपर एक उत्परिवर्तन दर प्रदर्शित नहीं करते। नियमित तनाव पारित होने के एक हैलोजन लैंप के साथ एक विदारक गुंजाइश का उपयोग आम तौर पर म्यूटेशन के रूप में अच्छी तरह से पैदा नहीं करता। बहरहाल, देखभाल प्रकाश में अनावश्यक जोखिम, जैसे बचने के लिए लिया जाना चाहिए, एक मानक काले अंदर इनक्यूबेटर में उपभेदों रखते हुए, या पन्नी के साथ उपभेदों को कवर। यह मामला अनावश्यक म्यूटेशन समय पर जमा में इसे प्राप्त करने के बाद तनाव की aliquots फ्रीज करने की सलाह दी है।
  2. सगर्भा युवा वयस्क उठाओ (लगभग 12 घंटे के बाद L4) एक कीड़ा के साथ जानवरों 11 उठाओ।
    नोट: युवा जानवरों, कम mutagenic प्रभाव दिखाने के 4 बड़े पशुओं कम चिंता आकार हो सकता है, जबकि।
  3. एक फिल्टर पी कटकोल एक 25 मिमी x 25 मिमी वर्ग छेद के साथ एक 60 मिमी प्लेट फिट हैं और एक गैर वरीय प्लेट (चित्रा 1E) पर जगह है।
    नोट: एक वर्ग पंच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है लेकिन पंच के आकार सटीक होना जरूरी नहीं है।
  4. समान रूप से फिल्टर पेपर पर 100 मिमी CuCl 2 के 100 μL गिरा प्लेट पर वर्ग छेद के भीतर कीड़े को प्रतिबंधित करने के लिए।
  5. सगर्भा युवा वयस्क hermaphrodites की वांछित संख्या (एक उदाहरण के लिए चरण 3 देखें) उठाओ और CuCl 2 प्लेट के केंद्र के लिए स्थानांतरण।
  6. लेजर सुरक्षा चश्मा पहनें।
  7. एलईडी और समारोह जनरेटर पर स्विच।
  8. करने के लिए एलईडी नियंत्रक के लीवर स्विच 'एक्सटेंशन'। समारोह जनरेटर (चित्रा -1) द्वारा इसे नियंत्रित करने के लिए।
  9. अधिकतम शक्ति का 65% पर नियंत्रक और साइन लहर, 4 हर्ट्ज (चित्रा 1 सी) के रूप में समारोह जनरेटर सेट करें।
  10. एलईडी (चित्रा 1 ए <तहत मंच पर एक ढक्कन के बिना 2.5 कदम से CuCl 2 प्लेट रखें/ Strong>)।
  11. 30 मिनट के लिए नीली बत्ती के साथ जानवरों रोशन।
  12. पी 0 के रूप में एक वरीयता प्राप्त थाली करने के लिए स्वस्थ लग कीड़े हस्तांतरण।
    नोट: पी 0 की वांछित संख्या स्क्रीन के प्रकार पर निर्भर करता है। एक उदाहरण के लिए चरण 3 देखें। पी 0 कीड़े तुरंत बेबुनियाद प्रकाश उपचार के बाद प्रतीत हो सकता है और समय के साथ ठीक हो जाएगी।
  13. एक मशीन में या अंधेरे में पन्नी का उपयोग कर कवर कीड़े रखें; और मानक प्रक्रिया उनकी संतान 2,10 के बीच वांछित phenotypes स्क्रीनिंग शुरू करने के लिए का पालन करें।

3. एक आगे आनुवंशिक स्क्रीन का उदाहरण

नोट:। यह अगर एलईडी और तनाव काम कर रहे हैं जाँच करने के लिए 120 अगुणित जीनोम के साथ प्रतिरूप स्क्रीन का एक उदाहरण है चित्रा 2 प्रक्रिया का एक योजनाबद्ध दिखाता है।

  1. [Day1] नीले प्रकाश उपचार के बाद, पी 0 के रूप में OP50 के साथ एक एन जी एम थाली पर पांच स्वस्थ लग कीड़े लेने के लिए उन्हें एक 20 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखने के लिए, और उन्हें 1 के लिए अंडे रखनाडी ( 'Day1' प्लेट)।
  2. [Day2] स्थानांतरण पी 0 एक नया वरीयता प्राप्त थाली पर ( 'Day2' प्लेट)।
  3. [Day3] उठाओ और उन्हें जलने से 'Day2' थाली पर पी 0 को मारने।
  4. [Day4] 'Day1' थाली से 30 सगर्भा युवा वयस्क एफ 1 उठाओ और उन्हें अलग-अलग प्लेटों ( 'Day1' के लिए 30 एफ 1 प्लेट) पर स्थानांतरित।
  5. 'Day2' थाली के लिए [Day5] दोहराएँ 3.4 कदम ( 'Day2' के लिए 30 एफ 1 प्लेट)।
  6. [Day7-9] एक मानक stereomicroscope के तहत असामान्य morphologies और / या गुम्मट तनाव (चित्रा 3 ए) की तुलना में एफ 2 कीड़े के व्यवहार की जाँच जब वे वयस्क हो जाते हैं।
    नोट: एफ 2 के बीच एक ही phenotype के साथ कीड़े की एक चौथाई से जब यह उच्च penetrance के साथ पीछे हटने के बारे में एक आनुवंशिक उत्परिवर्तन को प्रदर्शित करता है। हालांकि, कुछ म्यूटेंट धीरे धीरे बढ़ने और / या आंशिक penetrance दिखा सकते हैं। इसलिए, यह संभव है कि म्यूटेंट के एक चौथाई से भी कम एक पर पाया जा सकता हैथाली।
  7. दिखाई phenotypes के साथ कीड़े को व्यक्तिगत रूप से उठाओ और अगली पीढ़ी में phenotype के आनुवांशिकता की जाँच करें।

4. एक Extrachromosomal ट्रांसजीन एकता का उदाहरण

  1. CZ20310 juSi164 में ब्याज की डीएनए इंजेक्षन [Pmex-5-his-72 :: miniSOG-3'UTR (TBB -2) + CB-यूएनसी-119 (+)] यूएनसी-119 (ed3) और तैयार ट्रांसजेनिक एक साथ कीड़े कम संचरण दर (10-30%) एक मानक इंजेक्शन प्रोटोकॉल 12,13 के बाद।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, स्थापित extrachromosomal सरणियों juSi164 उपभेदों में पार किया जा सकता है। JuSi164 के लिए जीनोटाइपिंग बचने के लिए, juSi164 heterozygotes पी 0 हालांकि दक्षता कम किया जा सकता है के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। JuSi164 के लिए जीनोटाइपिंग विधि की धारा 5 में वर्णित है।
  2. [Day1] चरण 2 में वर्णित के रूप में नीले रंग की रोशनी के साथ पी 0 के रूप में 20 पशुओं का इलाज ट्रांसजेनिक ~।
    नोट: अधिक P 0 कीड़े टीआर के आधार पर आवश्यक हैं ansmission दर। Transgenes phenotypes या coinjection मार्कर 12,13 से पहचाना जा सकता है।
  3. अलग-अलग प्लेटों पर 10 स्वस्थ लग पी 0 उठाओ, उन्हें एक 20 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखने के लिए, और उन्हें कुछ दिनों (पी 0 प्लेट) के लिए अंडे रखना
  4. [Day4] एकल बाहर 20 ट्रांसजेनिक एफ से अलग-अलग प्लेटों पर प्रत्येक पी 0 प्लेट 1 कीड़े और उन्हें अंडे देना करते हैं। (20 एफ 1 एक्स 10 पी 0 = प्लेटों में कुल 200 एफ 1 प्लेटें।)
  5. [Day7] एफ> 75% एफ 2 होने ट्रांसजीन के साथ 1 प्लेटों का पता लगाएं।
  6. 1 प्लेट (एफ 2 प्लेटें) एफ> 75% संचरण दर से पांच ट्रांसजेनिक जानवरों उठाओ।
  7. [Day10] एफ संभावित एकीकृत लाइनों के रूप में 100% संचरण दर के साथ 2 प्लेटों रखें।
  8. मेंडेलियाई अलगाव की जाँच करने के लिए और संभावित पृष्ठभूमि म्यूटेशन को हटाने के लिए एक मानक प्रक्रिया का उपयोग कर 10 संभावित एकीकृत लाइनों outcross।
Le "> 5। जीनोटाइपिंग

  1. Lyse 20 एक मानक प्रोटोकॉल का उपयोग कर 14 lysis बफर में एफ 2 कीड़े outcrossed।
  2. MosSCI प्रविष्टि 9, juSi164, (तालिका 1) एक मानक प्रोटोकॉल 14 निम्नलिखित 58 डिग्री सेल्सियस के एक annealing तापमान के साथ के लिए प्राइमरों का उपयोग पीसीआर प्रदर्शन करना।
    नोट: यह यूएनसी-119 (ed3) जीनोटाइप के लिए अनावश्यक है क्योंकि यूएनसी-119 (ed3) निम्नलिखित कदम 5.4 और 5.5 में बचाव ट्रांस्जीन (juSi164) को हटाने के बाद बेबुनियाद व्यवहार से पता लगाया जा सकता है।
  3. Agarose जेल वैद्युतकणसंचलन 15 चलाने के लिए और बैंड आकार (तालिका 1) की जांच के लिए WT juSi164 खोजने के लिए।
  4. जांच अगर एफ 2 संतान यूएनसी-119 (ed3) के अस्तित्व के कारण कीड़े को लकवा मार गया है।
  5. बेबुनियाद कीड़े कदम 5.4 पर पाए जाते हैं, तो भी कई nonuncoordinated कीड़े अगली पीढ़ी में सभी nonuncoordinated कीड़े प्राप्त करने के लिए।

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Representative Results

हम CZ20310 juSi164 यूएनसी-119 (ed3) के साथ एक आगे आनुवंशिक स्क्रीन प्रदर्शन मानक प्रोटोकॉल 60 एफ 1 120 mutagenized अगुणित जीनोम के लिए इसी प्लेटों के बीच धारा 2 और 3 में वर्णित के बाद 30 मिनट प्रकाश जोखिम का उपयोग करते हुए, हम साथ 8 एफ 1 प्लेटों पाया एफ 2 कीड़े इस तरह के शरीर के आकार दोष (चित्रा 3 बी), बेबुनियाद आंदोलन (चित्रा 3 सी), और वयस्क मारक (चित्रा 3 डी) के रूप में दिखाई दे phenotypes प्रदर्शित। हम 'Day1' और 'Day2' प्लेटों के बीच म्यूटेंट की संख्या में कोई अंतर नोटिस नहीं किया था। Singled छोटे एफ 2 कीड़े और बेबुनियाद एफ 2 कीड़े के सभी संतान इसी phenotypes से पता चला है, सुझाव है कि वे पैतृक म्यूटेंट हैं। पूर्ण अवलोकन तालिका 2 में संक्षेप। औसत पर, 120 अगुणित जीनोम के साथ एक प्रतिरूप स्क्रीन के बारे में 10 एफ 1 प्लेटों में परिणाम होगा चुनावइस तरह के शरीर के आकार और हरकत के रूप में पहचाने जाने दिख phenotypes आसानी से एक stereomicroscope के तहत देखा कि साथ कीड़े taining। अधिक मात्रात्मक विश्लेषण उत्परिवर्तन दर ठीक 4 निर्धारित करने के लिए आवश्यक है। इस स्क्रीन से दिखाई म्यूटेंट की उम्मीद की संख्या पता चलता है कि तनाव और सेटअप optogenetic mutagenesis के लिए ठीक से काम कर रहे हैं।

आकृति 1
चित्रा 1:। एलईडी सेटअप (ए) पूरी प्रणाली। एलईडी एक कस्टम बनाया धारक पर रखा गया था। विवरण सामग्री की सूची में पाए जाते हैं। (बी) के कवर प्लास्टिक का बना है। यह गर्मी संचय से बचने के लिए सिस्टम को पूरी तरह कवर नहीं करता है। (सी) और नियंत्रक समारोह जनरेटर। (डी) प्रणाली के पीछे की ओर। (ई) नीले प्रकाश उपचार के लिए CuCl 2 -soaked फिल्टर पेपर के साथ एक गैरवरीय थाली। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2:। एक प्रतिरूप स्क्रीन के लिए प्रायोगिक प्रक्रिया नीले प्रकाश उपचार के बाद, पी 0 कीड़े एक वरीयता प्राप्त प्लेट को हस्तांतरित और अंडे देना करने की अनुमति है। पी 0 कीड़े प्रकाश उपचार के बाद के लिए एक नया वरीयता प्राप्त प्लेट 1 डी का तबादला और प्रकाश उपचार के बाद 2 डी मारे गए हैं। एफ 1 कीड़े पी 0 प्लेटों से अकेले हैं। एफ 2 कीड़े के phenotypes के बाद वे वयस्क हो जाते जांच कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

10fig3.jpg "/>
चित्रा 3: म्यूटेंट का उदाहरण (ए) optogenetic mutagenesis के लिए मूल तनाव:। CZ20310 juSi164 यूएनसी-119 (ed3)। इस तनाव सामान्य शरीर के आकार, व्यवहार, और चिंता आकार की है। स्केल पट्टी: 0.5 मिमी। । (बी - डी) एफ 2 संतान दिखा शरीर के आकार दोष (बी), बेबुनियाद (सी), और घातक (डी) phenotypes यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका एक
तालिका 1: juSi164 और यूएनसी-119 (ed3) की जीनोटाइपिंग।

सारणी 2
तालिका 2: phenotypes सोमवार का उदाहरणएक प्रतिरूप स्क्रीन ओम।

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Discussion

यहाँ, हम optogenetic mutagenesis की एक विस्तृत प्रक्रिया का उपयोग कर अपने-mSOG germline में व्यक्त किया है और एक छोटे पैमाने पर आगे आनुवंशिक स्क्रीन का एक उदाहरण प्रदान का वर्णन है। मानक रासायनिक उत्परिवर्तजनन की तुलना में, इस optogenetic म्युटाजेनेसिस विधि के कई फायदे हैं। सबसे पहले, यह nontoxic है, जिससे प्रयोगशाला कर्मियों ऐसे ईएमएस, ENU के रूप में जहरीले रसायन mutagens से दूर रखने और पराबैंगनी प्रकाश (TMP / यूवी) के साथ trimethylpsoralen। दूसरे, mutagenesis की प्रयोगात्मक प्रक्रिया पी 0 जानवरों की एक छोटी संख्या के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और एक घंटे के भीतर समाप्त हो सकता है। तीसरा, optogenetic म्युटाजेनेसिस न्यूक्लियोटाइड प्रतिस्थापन और गुणसूत्र विलोपन सहित म्यूटेशन की एक व्यापक स्पेक्ट्रम पैदा करता है। अंत में, optogenetic म्युटाजेनेसिस extrachromosomal ट्रांसजीन के एकीकरण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

इस mutagenesis प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम सुनिश्चित करने के लिए कि एलईडी सेटअप पूर्व में उनकी mSOG युक्त उपभेदों पर काम करता हैpected दक्षता। प्रोटोकॉल धारा 3 में वर्णित के रूप में 100 के बारे में अगुणित जीनोम के साथ, हम एक पायलट प्रतिरूप स्क्रीन प्रदर्शन सलाह देते हैं। म्युटाजेनेसिस आसानी से प्रकाश इलाज के लिए पी 0 की संख्या में वृद्धि से nonclonal स्क्रीन करने के लिए छोटे पैमाने पर पायलट स्क्रीन से स्केलेबल है। बड़े पैमाने पर nonclonal स्क्रीन के लिए, हम सगर्भा युवा वयस्कों के लिए कीड़े तुल्यकालन और प्रकाश उपचार के लिए एक CuCl 2 थाली पर M9 समाधान के साथ उनमें से सैकड़ों स्थानांतरित सुझाव देते हैं। मानक हालत चरण 2 में वर्णित है और 3 व्यापक रूप से इस्तेमाल 50 मिमी ईएमएस mutagenesis विधि 4 से लगभग 4.4 गुना कम क्षमता का अनुमान है। उत्परिवर्तन दर प्रकाश जोखिम समय बढ़ रही है और / या प्रकाश की तीव्रता में वृद्धि से सुधार किया जा सकता है। हालांकि, इन संशोधनों phototoxicity का कारण है और छोटे बच्चे आकार और हल्के इलाज कीड़े की बीमारी हो सकती है। दक्षता बढ़ाने के लिए, यह उच्च आरओएस उपज ऐसी साथ miniSOG डेरिवेटिव का उपयोग करने के लिए संभव हो सकता हैminiSOG (Q103L) हालांकि यह प्रकाश उपचार 16,17 बिना पृष्ठभूमि म्युटाजेनेसिस प्रभाव में वृद्धि हो सकती है। डीएनए का निर्माण के संशोधन के लिए, Pmex-5-his-72 :: miniSOG-3'UTR (TBB -2) प्लाज्मिड (pCZ886) व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है।

यहाँ वर्णित शर्तों के तहत, एकीकृत transgenes लगभग एक पर औसत 4 प्रति 200 एफ 1 लाइन में उत्पन्न जब 10 के एक संचरण दर के साथ एक extrachromosomal ट्रांसजेनिक तनाव का उपयोग कर रहे हैं - 30%। इस दक्षता उच्च संचरण दर के रूप में पहले एक पराबैंगनी विकिरण विधि 18 के लिए सूचना के साथ extrachromosomal ट्रांसजेनिक उपभेदों का उपयोग करके बढ़ाया जा सकता है।

उनकी mSOG की मध्यस्थता optogenetic म्युटाजेनेसिस जीन की एक विस्तृत श्रृंखला में परिवर्तन लाती है। इसके अलावा, लोकी की आवृत्ति आरपीएम -1 शमन optogenetic mutagenesis का उपयोग कर स्क्रीन से बरामद एक ही स्क्रीन ईएमएस 4 का उपयोग करने से उन लोगों के लिए समान है। हालांकि, यह possi हैऐसे क्रोमेटिन संरचना के रूप में अज्ञात कारकों की वजह से है कि optogenetic एक हिस्टोन जीन का उपयोग कर, कुछ जीनों की दिशा में एक पूर्वाग्रह हो सकता है म्युटाजेनेसिस ble। इस मुद्दे के समाधान के लिए, यह पूरे जीनोम अनुक्रमण द्वारा कई optogenetically प्रेरित म्यूटेशन का विश्लेषण करने के लिए आवश्यक है।

उनकी mSOG की मध्यस्थता optogenetic म्युटाजेनेसिस एकल nucleotide प्रतिस्थापन और 1 बीपी से कुछ सौ बीपी 4 से लेकर विलोपन सहित म्यूटेशन की एक व्यापक स्पेक्ट्रम का कारण बनता है। एकल nucleotide वेरिएंट की स्पेक्ट्रम पता चलता है कि miniSOG प्रेरित प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों म्यूटेशन 4 का कारण रहे हैं। यह भी संभव है कि miniSOG हर्जाना प्रोटीन हिस्टोन और क्रोमेटिन अस्थिरता का कारण बनता है क्योंकि miniSOG प्रोटीन के रूप में अच्छी तरह से 19 निष्क्रिय करने के लिए प्रयोग किया जाता है। यह अलग तीव्रता के प्रकाश का उपयोग करके उत्परिवर्तन के प्रकार के हेरफेर करने के लिए संभव हो सकता है। optogenetic म्युटाजेनेसिस विलोपन का कारण बनता है के बाद से, यह जो में विलोपन के साथ ही एकल nucleotide परिवर्तन का विश्लेषण करने के लिए महत्वपूर्ण हैमानचित्रण 20 के लिए ले जीनोम अनुक्रमण डेटा।

यह पहले से सूचना मिली थी कि एक epifluorescent माइक्रोस्कोप miniSOG की मध्यस्थता सेल पृथक 21,22 के लिए प्रयोग किया जाता है। एक मानक epifluorescent यौगिक सूक्ष्मदर्शी के प्रकाश की तीव्रता ~ 0.5 मेगावाट / 2 मिमी एक लेंस है, जो मानक optogenetic mutagenesis प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता है कि अधिक से 4x के बारे में कम है बिना होना मापा गया था। इस प्रकार, यह जब एक प्रकाश स्रोत के रूप में एक महामारी फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग अनुभव से दक्षता का निर्धारण करने के लिए बहुत ही उचित है। एलईडी से एक लाभ घंटे के हजारों के ऊपर स्थिरता है। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि miniSOG, हालांकि सटीक व्यवस्था निर्धारित किया जाना बना रहता है स्पंदित प्रकाश 22 के तहत आरओएस की मध्यस्थता सेल पृथक में अधिक शक्तिशाली है। हम स्पंदित प्रकाश बनाने के लिए एक डिजिटल समारोह जनरेटर / एम्पलीफायर का इस्तेमाल किया। एक अन्य विकल्प के लिए एक यूएसबी-टीटीएल इंटरफ़ेस (चित्रा 1 ए) का उपयोग एलईडी ली विनियमित करने के लिए एक कंप्यूटर करने के लिए प्रकाश स्रोत से कनेक्ट करने के लिए हैएक कार्यक्रम के द्वारा GHT। एलईडी प्रणाली यहाँ वर्णित भी इस तरह के channelrhodopsin 23 का उपयोग कर उत्तेजनीय कोशिकाओं के optogenetic नियंत्रण के रूप में अन्य प्रयोजनों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, सेल पृथक mitochondria- या सेल झिल्ली-लक्षित miniSOG 17,22, उपयोग और क्रोमोफोर की मदद से लाइट निष्क्रियता (कैली) की प्रोटीन 19। इसके अलावा, इस optogenetic म्युटाजेनेसिस संभावित जैसे बैक्टीरिया, खमीर, मक्खी, और zebrafish के रूप में अन्य जीवों के साथ-साथ स्तनधारी सेल लाइनों के लिए लागू किया गया है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ultra High Power LED light source Prizmatix UHP-mic-LED-460 460 ± 5 nm
LED controller Prizmatix UHPLCC-01
Digital function generator/amplifier PASCO PI-9587C PI-9587C is no longer available. The replacement is PI-8127.
BNC cable male/male THORLABS CA3136
USB-TTL interface Prizmatix Optional
Photometer THORLABS PM50 and Model D10MM
Filter paper Whatman 1001-110
Stereomicroscope Leica MZ95
NGM plate Dissolve 5 g NaCl, 2.5 g Peptone, 20 g Agar, 10 µg/mL cholesterol in 1 L H2O. After autoclaving, add 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mM KH2PO4(pH 6.0). 
Lysis solution 10 mM Tris(pH 8.8), 50 mM KCl, 0.1% Triton X-100, 2.5 mM MgCl2, 100 µg/mL Proteinase K

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References

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आनुवंशिकी अंक 117 जीनोम चौड़ा यादृच्छिक mutagenesis डीएनए संशोधन आरओएस हिस्टोन-miniSOG transgene एकीकरण गुणसूत्र विलोपन आगे आनुवंशिक स्क्रीनिंग
Optogenetic यादृच्छिक mutagenesis में Histone-miniSOG का प्रयोग<em&gt; सी। एलिगेंस</em
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Noma, K., Jin, Y. Optogenetic Random … More

Noma, K., Jin, Y. Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans. J. Vis. Exp. (117), e54810, doi:10.3791/54810 (2016).

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