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Genetics

でヒストンminiSOGを使用した光遺伝学ランダム突然変異誘発 Published: November 14, 2016 doi: 10.3791/54810
Automatic Translation
1, 1,2
1Division of Biological Sciences, Section of Neurobiology, University of California in San Diego and Howard Hughes Medical Institute, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, University of California in San Diego School of Medicine and Howard Hughes Medical Institute

Summary

遺伝的にコードされたヒストンminiSOGは、青色光依存的にゲノムワイドな遺伝変異を誘発します。この突然変異誘発法は、高速で、単純な有毒化学物質の自由、およびフォワード遺伝子スクリーニングおよび導入遺伝子組込みに適しています。

Introduction

フォワード遺伝子スクリーニングは、広くそのような線虫（C.エレガンス）1などのモデル生物において様々な生物学的プロセスを破壊する遺伝子変異体を生成するために使用されてきました。このような変異体の分析は、機能的に重要な遺伝子およびそれらのシグナル伝達経路1,2の発見につながります。 C.で伝統的に、突然変異誘発エレガンスは、変異原性化学物質、放射線、またはトランスポゾン2を用いて達成されます。このようなメタンスルホン酸エチル（EMS）とN -エチル- Nの -nitrosourea（ENU）などの化学物質がヒトに対して毒性があります。ガンマ線または紫外線（UV）放射線変異誘発特別な装置を必要とします。そして、このような突然変異誘発株3、などのトランスポゾン活性株は、保守時に不必要な突然変異を引き起こす可能性があります。我々は遺伝的にコード光増感剤4を用いて、遺伝的変異を誘発するための簡単なアプローチを開発しました。

活性酸素種（ROS）DNA 5に損傷を与えることができます。ミニ一重項酸素発生器（miniSOG）がLOV（光、酸素、及び電圧）2 6フォトトロピンシロイヌナズナのドメインから設計された106個のアミノ酸の緑色蛍光タンパク質である。青色光（〜450 nm）のに曝されると、miniSOG ROSは、すべての細胞に存在する補因子6-8としてFL AVINモノ、と一重項酸素を含む生成されます。我々は、ヒストン-72、CのC末端にminiSOGをタグ付けすることによって彼の-mSOG融合タンパク質を構築しましたヒストン3のエレガンス変異体は、私たちはCの生殖細胞系列に彼-mSOGを表現するために単一コピーの導入遺伝子9を生成しましたエレガンス。暗闇の中で、通常の培養条件の下では、彼の-mSOGトランスジェニックワームは、通常のひなのサイズと寿命4を持っています。青色LEDの光に曝されると、彼の-mSOGワームは、それらの子孫4間の遺伝的変異を生成します。誘導された突然変異のスペクトルは、Gなどのヌクレオチド変化を含む：TからC：AとG：CからC：G、および小chromoso私は4を欠失。この突然変異誘発手順は実行が簡単で、かつ最小限のラボの安全設定が必要です。ここでは、LED照明のセットアップと光遺伝学突然変異誘発のための手順について説明します。

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Protocol

LEDイルミの1建設

注：必要なLED装置は、材料のリストにまとめられています。全体LEDセットアップは小さく、我々はそれがワーム4の露光量を制御するために、暗い部屋に置くことをお勧めしますが、ラボのどこにでも配置することができます。

  1. ケーブル（ 図1A、D）でコントローラにLEDを接続します。
  2. BNCケーブルでデジタルファンクションジェネレータ/アンプ（ 図1A、C、D）にコントローラを接続します。
  3. カスタムホルダー（ 図1A）を使用して、ステージ上のLEDライト10センチ修正。
    注：我々は、金属部品とホルダーを作りました。
  4. 部分的にLED照明のセットアップをカバーしますが、ワームが病気になり、熱の蓄積（ 図1B）を 、避けます。
    注：私たちは、オープントップとボトム（ 図1A）とのカスタムメイドのハードプラスチック製のカバーを使用します。カバーは、突然変異誘発、それ自体のために必要とされていませんが、トン使用されていますO周囲に青色光の不要な露出を制限。私たちは、ワームの過熱を防止するために、LEDセットアップ完全に（ 図1B）を覆わないように助言します。
  5. レーザー保護メガネを着用してください。
    注：光は非常に明るいですので、私たちは、レーザー保護メガネを着用してください。サングラスも同様に動作する可能性があります。
  6. LEDコントローラのレバースイッチ」のIntを。」連続照明（ 図1D）および最大電力（ 図1C）の65％に設定します。
  7. ワームは、製造業者のプロトコルを使用して配置され、ステージ上の青色光の強度を測定するための光度計を使用してください。セットアップは、連続的な照明の下で2.0ミリワット/ mm 2とを与えます。

2.ブルーライト治療

注：[miniSOG-3'UTR（TBB-2）:: Pmex-5-HIS-72 + CB-UNC-119（+）]株CZ20310 juSi164を使用して、UNC-119（ED3）III 4株が利用可能です。線虫遺伝学センター（CGCでは、http：//www.cgc.cbs.umn.edu/）。

  1. E.と標準線虫の増殖培地（NGM）プレート上に暗闇の中のHis-mSOG株を維持標準プロトコル10,11以下の大腸菌 OP50。
    注：周辺光の下では、juSi164含有株は自然発生率4以上の突然変異率を表示しません。ハロゲンランプと解剖スコープを使用してルーチン歪み通路は、一般的に、同様の突然変異を引き起こすことはありません。それにもかかわらず、注意が標準暗い内部のインキュベーター中で株を維持、またはホイルで株をカバーし、例えば 、光への不要な暴露を避けるために注意すべきです。不必要な変異は時間をかけて蓄積する場合には、それを受信した後、株のアリコートを凍結することをお勧めします。
  2. ワームに妊娠若年成人（約12時間後にL4）の動物を選んで11を選択します。
    注：古い動物は低いひなサイズを有することができる若い動物は、より少ない変異原効果4を示します。
  3. フィルタpをカットAPERは25ミリメートル×25 mm角の穴が60ミリメートルプレートに適合し、播種していないプレート（ 図1E）上に配置します。
    注：正方形のパンチを使用することができるが、パンチの大きさが正確である必要はありません。
  4. プレート上の四角い穴の中にワームを制限するために均等にろ紙上の100mMのCuCl 2の100μLをドロップします。
  5. 妊娠若年成人雌雄同体の所望の数を選択してください（例えばステップ3を参照）とのCuCl 2板の中央に移します。
  6. レーザー保護メガネを着用してください。
  7. LEDとファンクション・ジェネレータをオンにします。
  8. LEDコントローラのレバースイッチの内線を。」関数発生器（ 図1D）によってそれを制御します。
  9. 最大電力の65％で、コントローラおよび正弦波、4ヘルツ（ 図1C）などのファンクション・ジェネレータを設定します。
  10. <LEDの下にステージ上で蓋をせずにステップ2.5からのCuCl 2プレートを置きます （ 図1A/強いです>）。
  11. 30分間の青色光で動物を照らします。
  12. P 0としてシードのプレートに健康探してワームを転送します。
    注：P 0の所望の数が画面の種類によって異なります。例えば、ステップ3を参照してください。 P 0のワームは、光処理後すぐに調整されていないように見えることがあり、時間の経過とともに回復します。
  13. インキュベーター内または暗闇の中で箔を使用して覆われたワームをキープ。そしてそれらの子孫2,10の間で希望の表現型をスクリーニングを開始するための標準的な手順に従ってください。

前方遺伝画面の3例

注：これはLEDや歪みが機能しているかどうかを確認するために120半数体ゲノムを有するクローン画面の例である図2は、手順の概略を示しています。

  1. 【1日目】青色光処理後、P 0としてOP50とNGMプレート上に5人の健常探してワームを選ぶ20℃のインキュベーターでそれらを維持し、それらを1産卵しましょうD（「1日目」板）。
  2. [2日目]新しいシードされたプレート上に転送P 0（ '2日目」板）。
  3. [3日目]、それらを燃焼させることによって「2日目」板にP 0を選択し、殺します。
  4. 【Day4] '1日目」のプレートから30産卵期の若い成人F 1を選択し、個々のプレート（' 1日目」の30 F 1プレート）上に転送します。
  5. 「2日目」板用【Day5]を繰り返し、ステップ3.4（「2日目」の30 F 1のプレート）。
  6. 【Day7-9]彼らが大人になる、標準的な実体顕微鏡下でのWT株（ 図3A）と比較して、異常な形態および/またはF 2ワームの動作を確認してください。
    注：それは高い浸透と劣性であるF 2間で同じ表現型を持つワームの約四分の一遺伝変異が表示されます。しかし、いくつかの変異体は、ゆっくりと成長および/または部分的な浸透度を示すことができます。したがって、変異体未満の四半期に見つけることができる可能性がありますプレート。
  7. 個別に見える表現型とワームを選択し、次の世代の表現型の遺伝を確認してください。

体外導入遺伝子の統合の4例

  1. [72 Pmex-5-HIS-:: miniSOG-3'UTR（TBB-2）+ CB-UNC-119（+）] CZ20310 juSi164への関心のDNAを注入し、UNC-119（ED3）とを有するトランスジェニックワームを準備標準的な注入プロトコル12,13以下の低透過率（10〜30％）。
    注：別の方法として、確立された染色体外アレイはjuSi164株に交差することができます。 juSi164ための遺伝子型決定を回避するために、juSi164ヘテロ接合体は、効率が低下する可能性があるが、P 0として使用することができます。 juSi164ための遺伝子型決定方法は、第5章で説明されています。
  2. [1日目]ステップ2で説明したように青色光とP 0として〜20トランスジェニック動物を扱います。
    注：詳細P 0のワームは、TRに応じて必要とされます ansmission率。導入遺伝子は、表現型または共射出マーカー12,13によって同定することができます。
  3. 、個々のプレート上に10 P 0探して健康を選んで20℃のインキュベーターでそれらを維持し、それらを（P 0プレート）数日間卵を産むしましょう
  4. 【Day4]シングルアウト20トランスジェニックF 1個々のプレート上に各P 0のプレートからワーム、彼らは卵を産むしましょう。 （20 F 1×10 P 0プレート=合計で200 F 1プレート。）
  5. 【Day7] Fを> 75％のF 2を有する導入遺伝子を持つ1プレートを検索します。
  6. > 75％の透過率F 1プレート（F 2板）から5トランスジェニック動物を選択してください。
  7. 【Day10]潜在的な統合されたラインとして100％の透過率とF 2のプレートを保管してください。
  8. メンデル分離を確認し、潜在的なバックグラウンドの変異を削除するには、標準的な手順10を使用して、潜在的な統合された行を異種交配。
ル "> 5。ジェノタイピング

  1. 溶解20は、標準的なプロトコル14を使用して、溶解緩衝液中F 2ワームを外部交配しました。
  2. 標準プロトコル14以下の58℃のアニーリング温度でMosSCI挿入9、juSi164、（ 表1）のためのプライマーを用いてPCRを行います。
    注：UNC-119（ED3）は、次のステップ5.4および5.5に救出導入遺伝子（juSi164）を除去した後、非協調行動によって検出することができるので、UNC-119（ED3）の遺伝子型が不要です。
  3. アガロースゲル電気泳動15を実行し、juSi164ためのWTを見つけるために、バンドのサイズ（ 表1）を調べます。
  4. F 2子孫は、UNC-119（ED3）の存在にワームを麻痺しているかどうかを調べます。
  5. 非協調ワームはステップ5.4で発見された場合は、1つのいくつかのnonuncoordinatedワームは、次の世代内のすべてのnonuncoordinatedワームを取得します。

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Representative Results

私たちは8 F 1のプレートを見つけ、120変異誘発半数体ゲノムに対応する60 F 1のプレートのうち、第2条及び3に記載されている標準的なプロトコルに従って、30分間の露光を用いて、（ED3）CZ20310 juSi164 UNC-119とフォワード遺伝学的スクリーニングを行いましたこのようなボディサイズの欠陥（ 図3B）、非協調運動（ 図3C）、および成人の致死率（ 図3D）などの目に見える表現型を表示するF 2ワーム。私たちは、「1日目」と「2日目」のプレート間の変異体の数の違いに気付きませんでした。選抜小さなF 2ワーム、まとまりのないF 2ワームのすべての子孫は、彼らが遺伝変異体であることを示唆し、対応する表現型を示しました。完全な観察は、表2にまとめられている。平均して、120半数体ゲノムを有するクローンの画面が約10 F 1のプレートになりますコン簡単に実体顕微鏡下スポッティングようなボディ形状や運動などの視覚的に検出可能な表現型でワームをtaining。より定量的な分析が正確に4突然変異率を決定する必要があります。この画面から見える突然変異体数の期待値は、歪みやセットアップが光遺伝学突然変異誘発のために正常に動作していることを示唆しています。

図1
図1：LEDセットアップ （A）全体のシステム。 LEDは、カスタムメイドのホルダーに取り付けました。詳細は材料のリストに記載されています。 （B）カバーはプラスチック製です。これは、熱の蓄積を回避するために、システムを完全にカバーしていません。 （C）コントローラとファンクションジェネレータ。 （D）システムの裏側。 （E）のCuCl 2で播種していないプレートは、青色光の治療のための濾紙を-soaked。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
図2：クローンのスクリーンのための実験手順は、青色光処理後、P 0のワームはシードされたプレートに移し、卵を産むために許可されています。 P 0のワームは、光治療後に新しいシードのプレート1 Dに移し、光治療後2日間を殺しています。 F 1ワームは、P 0プレートから選抜されています。彼らが大人になった後、F 2虫の表現型が検討されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

10fig3.jpg "/>
図3：変異体の例光遺伝学突然変異誘発のための（A）オリジナル株：CZ20310 juSi164 UNC-119（ED3）。この株は、正常な身体形状、動作、およびひなサイズを有します。スケールバー：0.5ミリメートル。 （B - D）。本体サイズ欠陥（B）、非協調（C）、および致死（D）の表現型を示すF 2後代この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

表1
表1：juSi164と UNC-119（ED3） の遺伝子型決定 。

表2
表2：表現型FRの例クローン画面オム。

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Discussion

ここで、我々は彼の-mSOGを使用して、光遺伝学の突然変異誘発の詳細な手順を説明する生殖細胞系列で発現し、小規模前方遺伝画面の例を提供します。標準的な化学的突然変異誘発と比較して、この光遺伝学突然変異誘発方法は、いくつかの利点を有します。第一に、それによって離れて、このようなEMS、ENUなどの有害化学変異誘発物質からラボの人材を維持し、紫外線（TMP / UV）とトリメチルソラレン、非毒性です。第二に、突然変異誘発の実験手順は、P 0動物の数が少ないために使用することができる、1時間以内に終了することができます。第三に、光遺伝学的変異誘発は、ヌクレオチド置換、および染色体欠失を含む変異の広いスペクトルを生成します。最後に、光遺伝学的変異誘発は、染色体外導入遺伝子の統合のために使用することができます。

この変異誘発プロトコルにおける重要なステップは、LEDセットアップが元で彼-mSOG含む株に動作することを保証することですpected効率。約100半数体ゲノムで、議定書3章で説明したように我々は、パイロットクローンスクリーニングを行うことをお勧めします。突然変異誘発は、光治療のために、P 0の数を増加させることにより非クローン画面への小規模なパイロット画面から容易に拡張可能です。大規模な非クローンスクリーニングのために、私たちは妊娠若年成人にワームを同期させることを提案し、光治療のためのCuCl 2プレート上にM9溶液を用いて、それらの何百ものを転送します。ステップ2および3に記載されている標準的な条件は、広く使用され、50mMのEMS突然変異誘発法4よりも約4.4倍低い効率を有すると推定されます。突然変異率は、露光時間を増加させ、および/または光の強度を増加させることによって改善することができます。ただし、これらの変更は、光毒性を引き起こし、光処理されたワームの小さなひなサイズや病気につながることができます。効率を高めるために、そのようなより高いROS収率でminiSOG誘導体を使用することも可能ですminiSOG（Q103L）として、それは光処理16,17ずにバックグラウンド突然変異誘発効果を高めることがあります。 DNA構築物の変更については、Pmex-5-HIS-72 :: miniSOG-3'UTR（TBB-2）プラスミド（pCZ886）は、市販されています。

30％ - 10の伝送速度を持つ染色体外遺伝子導入株を使用した場合、ここで記載された条件の下では、統合された導入遺伝子は、平均4に200 F 1あたり約1ラインで生成されます。以前にUV照射方法18について報告されたように、この効率は、高い透過率を有する染色体外遺伝子導入株を使用することによって増加させることができます。

彼-mSOG媒介光遺伝学の突然変異誘発は、遺伝子の広い範囲で突然変異を誘発します。また、光遺伝学突然変異誘発を使用して、RPM-1抑制画面から回収された遺伝子座の頻度は、EMS 4を使用して、同じ画面からのものと類似しています。しかし、それはpossiですヒストン遺伝子を用いて光遺伝学的変異誘発は、クロマチン構造などの未知の要因に起因する特定の遺伝子に向かってバイアスを有し得ることBLE。この問題に対処するために、全ゲノム配列決定により多くoptogenetically誘導される変異を分析する必要があります。

彼-mSOG媒介光遺伝学的変異誘発は、1塩基対から数百塩基対4の範囲の一塩基置換および欠失を含む変異の広いスペクトルを引き起こします。単一ヌクレオチド変異体のスペクトルはminiSOGによって誘導される活性酸素種は、突然変異4の原因であることを示唆しています。これはminiSOG損害ヒストンタンパク質することも可能であるとminiSOGはタンパク質ならびに19を不活性化するために使用されるため、クロマチンの不安定性を引き起こします。異なる強度の光を用いて、変異の種類を操作することも可能です。光遺伝学的変異誘発は、欠失を引き起こすので、中の欠失ならびに単一ヌクレオチド変化を分析することが重要ですマッピング20のためのルゲノム配列データ。

これは、以前に落射蛍光顕微鏡miniSOG媒介細胞切除21,22のために使用されることが報告されました。標準的な落射蛍光複合顕微鏡の光強度は、標準的な光遺伝学突然変異誘発プロトコルに使用されるものよりも約4倍低いレンズなし〜0.5ミリワット/ mm 2であることが測定されました。これにより、光源としての落射蛍光顕微鏡を使用する場合、経験的効率を決定するために、非常に賢明です。 LEDの利点の一つは、数千時間にわたって安定性です。以前の研究では、正確なメカニズムはまだ決定されていないもののminiSOGは、パルス光22の下ROS媒介性細胞除去においてより強力であることが示されています。私たちは、パルス光を作るために、デジタル関数発生器/アンプを使用しました。別のオプションは、LEDのLiを調節するためにUSB-TTLインターフェース（ 図1A）を使用してコンピュータに光源を接続することですプログラムによってGHT。ここで説明するLEDシステムはまた、チャネルロドプシン23を用いて、興奮性細胞の光遺伝学の制御のような他の目的に使用することができる、細胞切除はmitochondria-または細胞膜標的miniSOG 17,22を使用し、光不活化（CALI）を発色団支援しますタンパク質19。また、この光遺伝学的変異誘発は、細菌、酵母、ハエ、ゼブラフィッシュ、ならびに哺乳動物細胞株のような他の生物に適用される可能性を有しています。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ultra High Power LED light source Prizmatix UHP-mic-LED-460 460 ± 5 nm
LED controller Prizmatix UHPLCC-01
Digital function generator/amplifier PASCO PI-9587C PI-9587C is no longer available. The replacement is PI-8127.
BNC cable male/male THORLABS CA3136
USB-TTL interface Prizmatix Optional
Photometer THORLABS PM50 and Model D10MM
Filter paper Whatman 1001-110
Stereomicroscope Leica MZ95
NGM plate Dissolve 5 g NaCl, 2.5 g Peptone, 20 g Agar, 10 µg/mL cholesterol in 1 L H2O. After autoclaving, add 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mM KH2PO4(pH 6.0). 
Lysis solution 10 mM Tris(pH 8.8), 50 mM KCl, 0.1% Triton X-100, 2.5 mM MgCl2, 100 µg/mL Proteinase K

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References

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遺伝学、問題117、ゲノムワイドなランダム突然変異誘発、DNA修飾、ROS、ヒストンminiSOG、トランスジーン組み込み、染色体欠失、フォワード遺伝子スクリーニング
でヒストンminiSOGを使用した光遺伝学ランダム突然変異誘発<em&gt; C。エレガンス</em
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Noma, K., Jin, Y. Optogenetic Random … More

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