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Genetics

히스톤 - miniSOG에서 사용 Optogenetic 무작위 돌연변이 유발 Published: November 14, 2016 doi: 10.3791/54810
Automatic Translation
1, 1,2
1Division of Biological Sciences, Section of Neurobiology, University of California in San Diego and Howard Hughes Medical Institute, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, University of California in San Diego School of Medicine and Howard Hughes Medical Institute

Summary

유전자 인코딩 히스톤 - miniSOG는 푸른 빛 의존적으로 게놈 전체의 유전 변이를 유도한다. 이 돌연변이 유발 방법은 빠르고 간단 독성 화학 물질의 자유, 앞으로 유전자 검사 및 유전자 통합에 적합합니다.

Introduction

앞으로 유전 화면이 널리 예쁜 꼬마 선충 (C. elegans의) 1과 모델 생물의 다양한 생물학적 과정을 방해 유전 적 돌연변이를 생성하는 데 사용되었다. 이러한 돌연변이의 분석은 기능적으로 중요한 유전자의 발견을 유도 및 시그널링 1,2 경로. 전통적으로, C.에서 돌연변이 유발 엘레은 돌연변이 유발 화학 물질, 방사선, 또는 트랜스포존 2를 사용하여 달성된다. 에틸 메탄 (EMS) 및 N - 에틸 N의 -nitrosourea (ENU) 인간에게 독성이 같은 화학; 감마선 또는 자외선 (UV) 방사선 돌연변이 특별한 장비를 필요로; 및 뮤 테이터 균주 3 등 트랜스포존 활성 균주, 유지 보수시 불필요한 돌연변이를 일으킬 수 있습니다. 우리는 유 전적으로 인코딩 된 감광제 (4)를 이용하여 유전 변이를 유도하는 간단한 방법을 개발했습니다.

반응성 산소 종 (ROS)의 DNA 5가 손상 될 수 있습니다.미니 중항 산소 발생기 (miniSOG)는 LOV (빛, 산소 및 전압)에서 설계 한 106 아미노산 애기 phototropin 2/6 도메인의 녹색 형광 단백질이다. 청색광 (~ 450 ㎚), miniSOG에 노출시 ROS는 모든 세포에 존재하는 보조 인자 6-8로 FL AVIN 모노 뉴클레오티드와 일 중항 산소를 포함한 생성한다. 우리는 히스톤-(72), C의 C 말단에 miniSOG에 태그를 지정하여 그의-mSOG 융합 단백질을 구성 히스톤 (3)의 엘레 변형 우리는 C.의 생식 세포에 그의-mSOG을 표현하는 단일 복사 유전자 (9)을 생성 엘레. 어둠 속에서 정상 배양 조건은 그의-mSOG 유전자 변형 웜은 정상 무리의 크기와 수명 4 있습니다. 블루 LED 빛에 노출되면, 그의-mSOG 웜은 자신의 자손 4 사이의 유전 변이를 생산하고 있습니다. T에 C : A와 G : C에 C : G, 작은 chromoso에 의한 돌연변이의 스펙트럼은 G와 같은 염기 변화를 포함날 4 삭제. 이 돌연변이 유발 절차를 수행하는 간단하고, 최소한의 실험 안전 설정을 요구한다. 여기, 우리는 optogenetic 돌연변이 유발을위한 LED 조명 설정 및 절차에 대해 설명합니다.

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Protocol

LED가 조명기 1. 건설

주 : 필요한 장비는 LED 자재 목록에 요약 하였다. 전체 LED 설치가 작고, 우리는이 웜 (4)의 빛 노출을 제어하는 어두운 방에 배치 할 것을 권장하지만, 실험실에서 삽입 될 수 있습니다.

  1. 케이블 (그림 1A, D)와 컨트롤러에 LED를 연결합니다.
  2. BNC 케이블 (그림 1A, C, D)와 디지털 함수 발생기 / 앰프 컨트롤러를 연결합니다.
  3. 사용자 정의 홀더 (그림 1A)를 사용하여 스테이지 위의 LED 조명 10cm를 수정합니다.
    참고 : 우리는 금속 부품 홀더를했다.
  4. 부분적으로 LED 조명 설치를 커버하지만, 웜 아프게 축열 (그림 1B)를 피하십시오.
    참고 : 우리는 개방 상단과 하단 (그림 1A)와 주문 제작 하드 플라스틱 커버를 사용합니다. 커버는 돌연변이 자체에 요구되지 않으며, t를 사용오 주위에 푸른 빛의 불필요한 노출을 제한합니다. 우리는 벌레의 과열을 방지하기 위해 LED 설치 완전히 (그림 1B)를 포함하지 않는 것이 좋습니다.
  5. 레이저 보호 안경을 착용 할 것.
    주 : 빛이 매우 밝은이기 때문에 우리는 레이저 보호 안경을 착용하십시오. 선글라스가 잘 작동 할 수 있습니다.
  6. 에 LED 컨트롤러의 레버 스위치 '지능을.' 연속 조명 (그림 1D)의 최대 전력 (그림 1C)의 65 %로 설정합니다.
  7. 벌레는 제조 업체의 프로토콜을 사용하여 배치 단계에있는 푸른 빛의 강도를 측정하는 광도계를 사용합니다. 설정은 연속 조명 아래 2.0 mW의 / mm 2를 제공합니다.

2. 블루 라이트 치료

참고 :. 인증 기관은-UNC가-119 (+) Pmex-5-HIS-72 : miniSOG - 3'UTR (TBB-2) +] UNC-119 (ED3) III 4 균주를 사용할 수있는 변형 CZ20310 juSi164를 사용하여 Caenorhabditis 엘레 유전학 센터 (CGC에서, HTTP: //www.cgc.cbs.umn.edu/).

  1. E. 표준 선충의 성장 배지 (NGM)에 어둠 속에서 그의-mSOG의 피로를 유지 판 대장균 OP50 표준 프로토콜 10, 11 다음.
    참고 : 주변 광에 따라, juSi164 함유 균주가 자발적 비율 4 위의 돌연변이 속도를 표시하지 않습니다. 일반적뿐만 아니라 돌연변이를 일으키지 않는 할로겐 램프와 해부 범위를 사용 루틴 변형 통로. 그럼에도 불구하고, 치료는 표준 어두운 내부 배양기에서 긴장을 유지, 또는 호일로 변종을 포함, 예를 들어 빛에 불필요한 노출을 피하기 위해주의해야한다. 불필요한 돌연변이가 시간이 지남에 축적 경우를받은 후 균주의 분취 량을 동결하는 것이 좋습니다.
  2. 임신하는 젊은 성인을 선택 웜으로 (약 12 시간 후 L4) 동물 (11)을 선택합니다.
    참고 : 오래된 동물이 낮은 무리의 크기를 가질 수있는 동안 젊은 동물, 이하 돌연변이 유발 효과 4을 보여줍니다.
  3. 필터 페이지를 잘라조리개는 25mm X 25mm 사각형 구멍이있는 60mm 판에 맞게 및 시드 화 판 (그림 1E)에 배치합니다.
    주 : 사각형 펀치를 사용할 수 있지만, 펀치의 크기가 정확하지 않습니다.
  4. 접시에 사각형 구멍에서 벌레를 제한 균등 필터 종이에 100 밀리미터의 CuCl 2의 100 μL를 삭제합니다.
  5. 임신하는 젊은 성인 자웅 동체의 원하는 번호를 (예를 들어 3 단계 참조) 선택과의 CuCl 2 판의 중심에 전송할 수 있습니다.
  6. 레이저 보호 안경을 착용 할 것.
  7. LED와 함수 발생기 ON 전환합니다.
  8. 에 LED 컨트롤러의 레버 스위치 '내선을.' 함수 발생기 (도 1D)가 그것을 제어한다.
  9. 최대 전력의 65 %에서 컨트롤러와 사인파, 4 Hz에서 (그림 1C)와 같은 함수 발생기를 설정합니다.
  10. LED가 (그림 1A <아래 단계에 뚜껑없이 단계 2.5에서의 CuCl 2 판을 배치/ STRONG>).
  11. 30 분 동안 푸른 빛으로 동물을 조명.
  12. P 0으로 시드 판에 건강한 찾고 웜을 전송합니다.
    참고 : P 0의 원하는 번호가 화면의 종류에 따라 다릅니다. 예를 들어 3 단계를 참조하십시오. 는 P 0 벌레는 빛 치료 후 즉시 조정되지 않은 것으로 나타날 수 있으며, 시간이 지남에 따라 회복됩니다.
  13. 인큐베이터이나 어둠 속에서 호일을 사용하여 적용 벌레를 유지; 그들의 자손 2,10 중 원하는 표현형을 심사 시작하는 표준 절차를 따르십시오.

순방향 유전 화면 3. 예

참고 :. 이것은 LED 및 변형이 작동하는지 확인하기 위해 120 반수체 게놈을 가진 클론 화면의 예입니다 그림 2는 절차의 개략도를 보여줍니다.

  1. [첫째날] 푸른 빛을 처리 한 후, P 0으로 OP50와 NGM 판에 다섯 건강한 찾고 벌레를 선택 20 ° C 배양기에서 그들을 유지하고 그들에게 1 알을 낳기하자D ( '첫째날'판).
  2. [둘째 날] 새 시드 판에 전송 P 0 ( '둘째 날'판).
  3. [Day3] 선택하고 레코딩하여 '둘째 날'접시에 P 공을 죽일.
  4. [Day4]를 '첫째날'판에서 30 임신하는 젊은 성인 F 1을 선택하고 개별 플레이트 ( '첫째날'30 F 1 판)에 전송할.
  5. '둘째 날'플레이트 [Day5] 단계를 반복 3.4 ( '둘째 날'30 F 1 판).
  6. 그들이 성인이 될 때 Day7-9] 표준 실체 현미경 하에서 비정상적인 형태 학적 및 / 또는 WT 변형 (그림 3A)에 비해 F 2 웜의 동작을 확인합니다.
    참고 : 높은 침투와 열성이다 F 2 중 같은 표현형과 벌레의 내무반에 관한 유전 변이가 표시됩니다. 그러나 일부 돌연변이 천천히 성장 및 / 또는 부분적인 침투를 표시 할 수 있습니다. 따라서, 돌연변이 미만 분기가 발견 될 수있다플레이트.
  7. 개별적으로 볼 수 표현형과 벌레를 선택하고 다음 세대의 표현형의 유전을 확인합니다.

염색체 외 형질 전환 유전자 통합 4. 예

  1. A의 CZ20310 juSi164에 관심있는 DNA를 주입 [Pmex-5-HIS-72 : miniSOG - 3'UTR (TBB-2) + CB-UNC-119 (+)] UNC-119 (ED3) 및 준비 유전자 변형 벌레 표준 주입 프로토콜 12,13 다음 저 전송률 (10~30%).
    참고 : 또는 설립 염색체 외 배열이 juSi164 균주에 교차 할 수 있습니다. juSi164에 대한 유전자형을 방지하기 위해, juSi164의 이형 효율이 감소 될 수 있지만 P 0으로 사용될 수있다. juSi164 대한 유전자형 방법은 섹션 5에서 설명한다.
  2. 2 단계에 설명 된대로 [첫째날] ~ 푸른 빛 P 0로 (20) 형질 전환 동물을 취급합니다.
    참고 : 더 P 0 웜은 그럴 필요에 따라 필요 ansmission 속도. 표현형은 유전자 또는 공사 출 마커 (12, 13)에 의해 식별 될 수있다.
  3. 개인 접시에 10 건강한 찾고 P 0 선택 20 ° C 배양기에서 그들을 유지하고 며칠 (P 0 판)에 대한 알을 낳는하자
  4. [Day4] 싱글 아웃 (20) 형질 전환 F 1 개별 플레이트 상에 각각 P 0 판에서 벌레와 그들이 알을 낳기 수 있습니다. (20 F 1 × P 0 판 = 총 200 F 1 판).
  5. [Day7] F에게> 75 % F 2 가지는 유전자 1 판을 찾습니다.
  6. F에게> 75 % 전송 속도에서 1 판 (F 2 판) 오 형질 전환 동물을 선택합니다.
  7. [Day10] F 잠재적 인 통합 선으로 100 %의 전송 속도 2 판을 보관하십시오.
  8. 멘델의 분리를 확인하고 잠재적 인 배경 돌연변이를 제거하기 위해 표준 절차를 사용하여 (10) 전위 집적 라인 교배.
제작 "> 5. 유전자형

  1. 를 Lyse (20)는 표준 프로토콜 (14)을 사용하여 용해 완충액 F 2 웜 outcrossed.
  2. 표준 프로토콜 14 다음 58 ℃의 어닐링 온도 MosSCI 삽입 9 juSi164 (표 1)에 대한 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한다.
    주 : UNC-119 (ED3)가 다음 단계 5.4 및 5.5에서 구하고 트랜스 (juSi164)을 제거한 후 배위 동작에 의해 검출 될 수 있기 때문에이 UNC-119 (ED3)를 유전자형 불필요하다.
  3. 아가로 오스 겔 전기 영동 (15)을 실행하고 juSi164에 대한 WT를 찾기 위해 밴드 크기 (표 1)를 검사합니다.
  4. 은 F 2 자손으로 인해 UNC-119 (ED3)의 존재에 벌레를 마비 경우 검사합니다.
  5. 조정되지 않은 웜 단계 5.4에서 발견하는 경우, 하나의 여러 nonuncoordinated 웜은 다음 세대의 모든 nonuncoordinated 웜을 얻었다.

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Representative Results

우리는 120 돌연변이 반수체 게놈에 해당하는 60 F 1 판 중 섹션 2와 3에 설명 된 표준 프로토콜 다음 30 분 빛 노출을 사용 CZ20310 juSi164 UNC-119 (ED3)와 앞으로 유전자 화면을 수행, 우리는 8 F 1 판을 발견 F 등의 신체 사이즈 결함 (그림 3B), 조정되지 않은 운동 (그림 3C), 성인 치사 (그림 3D)으로 볼 수 표현형을 표시이 웜. 우리는 '첫째날'과 '둘째 날'판 사이 돌연변이의 수의 차이를 통보하지 않았다. 찍어 작은 F 2 웜 및 조정되지 않은 F 2 웜의 모든 자손은 유전 돌연변이 것을 제안, 해당 표현형을 보여 주었다. 전체 관찰은 표 2에 요약 하였다. 평균 120 반수체 게놈을 가진 클론 화면 10 F 1 플레이트 초래할 것이다 콘쉽게 실체 현미경 아래에서 발견 등의 체형과 운동으로 눈에 띄게 검출 표현형과 벌레 이닝. 정량적 인 분석은 돌연변이율 정확하게 4를 결정할 필요가있다. 이 화면에서 볼 수 돌연변이의 예상 수는 변형 및 설치가 optogenetic 돌연변이 유발을 위해 제대로 작동하는지 제시한다.

그림 1
그림 1 :. LED가 설치 (A) 전체 시스템. LED는 사용자 정의 만든 홀더에 장착되었다. 자세한 내용은 재료의 목록에서 발견된다. (B) 커버는 플라스틱으로 제조된다. 그것은 열 축적을 방지하기 위해 시스템을 완전히 적용되지 않습니다. (C) 컨트롤러 및 함수 발생기. (D) 시스템의 뒷면. (E) 푸른 빛 치료의 CuCl 2 -soaked 필터 종이를 가진 시드 화 판. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 :. 클론 화면에 대한 실험 절차는 푸른 빛을 처리 후, P 0 웜은 시드 판에 전달하고 알을 낳기 위해 사용할 수 있습니다. P 0 벌레는 빛 치료 후 새 시드 플레이트 (1) D로 전송 가벼운 치료 후 2 일 사망있다. F 1 웜은 P 0 판에서 선발된다. F 2 웜의 표현형들이 성인이 될 후 검사합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

10fig3.jpg "/>
그림 3 : 돌연변이의 예 optogenetic 돌연변이 유발을위한 (A) 원본 변형 :. CZ20310 juSi164 UNC-119 (ED3). 이 균주는 정상적인 몸 모양, 행동, 그리고 무리의 크기를 갖는다. 스케일 바 : 0.5 mm. . (B - D) F 2 자손 보여주는 신체 사이즈 결함 (B), 조정되지 않은 (C) 및 치명적인 (D) 표현형 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

1 번 테이블
표 1 : juSi164와 UNC-119 (ED3)의 유전자형.

표 2
표 2 : 표현형 FR의 예클론 성 화면 옴.

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Discussion

여기서는 optogenetic 돌연변이의 상세한 절차는 그의-mSOG는 배아에서 발현 이용하여 소규모 순방향 유전 화면의 일례를 설명 제공. 표준 화학적 돌연변이 유발에 비해,이 optogenetic 돌연변이 유발 방법은 여러 가지 장점을 갖는다. 첫째, 이에 거리와 같은 EMS, ENU 같은 독성 화학 돌연변이에서 실험실 인력을 유지하고 자외선 (TMP / UV)와 trimethylpsoralen, 무독성이다. 둘째, 돌연변이 유발 실험 절차는 P 0 동물 소수 사용할 수 있으며 1 시간 이내에 완료 될 수있다. 셋째, optogenetic 돌연변이는 염기 치환 및 염색체 삭제를 포함하여 돌연변이의 광범위한 스펙트럼을 생산하고 있습니다. 마지막 optogenetic 돌연변이는 염색체 외 유전자의 통합을 위해 사용될 수있다.

이 돌연변이 유발 프로토콜의 중요한 단계는 LED 설치가 전에서 그의-mSOG 포함하는 균주에 작동하는지 확인하는 것입니다예견했던 효율성. 약 100 반수체 게놈과, 프로토콜 제 3 절에 설명 된대로 우리는 파일럿 클론 화면을 수행하는 것이 좋습니다. 돌연변이 유발 광 치료 P 0의 수를 증가시킴으로써 nonclonal 화면에 소규모의 파일럿 화면 쉽게 확장 가능하다. 대규모 nonclonal 화면을 위해, 우리는 임신하는 젊은 성인 벌레를 동기화하는 것이 좋습니다 빛 치료에 대한의 CuCl 2 판에 M9 솔루션들을 수백 전송. 표준 상태는 단계 2에서 설명한 (3)가 널리 사용 50mM의 EMS 돌연변이 유발 방법 (4)보다 약 4.4 배 낮은 효율을 가질 것으로 예상된다. 돌연변이 비율은 노광 시간을 증가 및 / 또는 광의 강도를 증가시킴으로써 개선 될 수있다. 그러나 이러한 수정은 광독성을 일으킬 빛 처리 벌레의 작은 무리의 크기와 질병으로 이어질 수 있습니다. 효율을 증가시키기 위해, 더 높은 수율 ROS 등을 함께 miniSOG 유도체를 사용할 수도miniSOG (Q103L)는 빛 치료 16,17없이 배경 돌연변이 유발 효과를 증가시킬 수 있지만있다. DNA의 구조의 변형 예를 들어, Pmex -5- HIS-72 : miniSOG-3'UTR (TBB-2) 플라스미드 (pCZ886)이 시판되고있다.

30 % - 10의 전송률과 함께 염색체 외 형질 전환 균주를 이용한 경우 여기에 설명 된 조건 하에서, 통합 유전자는 평균 4 200 F 일 당 약 하나의 라인에서 생성된다. 이 효율은 이전에 UV 조사 방법 (18)에 대해보고 된 높은 전송 속도 염색체 외 형질 전환 균주를 사용하여 증가 될 수있다.

그의-mSOG 매개 optogenetic 돌연변이 유전자의 다양한 돌연변이를 유도한다. 또한 optogenetic 돌연변이 유발을 이용한 RPM-1 억제 화면으로부터 회수 궤적의 주파수는 EMS 사를 사용하여 동일 화면에서와 마찬가지이다. 그러나 possi 인때문에 같은 크로 마틴 구조를 알 수없는 요인, 특정 유전자를 향한 편견을 가질 수있는 히스톤 유전자를 사용하여 해당 optogenetic 돌연변이 유발을 BLE. 이 문제를 해결하기 위해, 총 유전체에 의해 많은 optogenetically 유도 돌연변이를 분석 할 필요가있다.

그의-mSOG 매개 optogenetic 돌연변이 단일 염기 치환 1 BP에서 몇 백 BP 사에 이르기까지 삭제를 포함하여 돌연변이의 넓은 스펙트럼을 발생합니다. 단일 염기 변이의 스펙트럼은 miniSOG 유도 된 반응성 산소 종의 돌연변이 (4)의 원인이되는 것을 의미한다. miniSOG 단백질도 19을 비활성화하는 데 사용되기 때문에 miniSOG 손상은 히스톤 단백질 및 염색질 불안정성을 유발하는 것도 가능하다. 다른 강도의 광을 이용하여 돌연변이 형태를 조작하는 것이 가능하다. optogenetic 돌연변이가 결실을 야기하기 때문에,의 결실뿐 아니라 단일 염기 변화를 분석하는 것이 중요매핑 (20)에 대한 제작 게놈 시퀀싱 데이터입니다.

그것은 이전에 epifluorescent 현미경 miniSOG 매개 세포 절제 (21, 22)에 사용되는 것으로보고되었다. 표준 epifluorescent 화합물 현미경의 광 강도는 표준 optogenetic 돌연변이 유발 프로토콜에서 사용 된 것보다 약 4 배 낮은 렌즈없이 ~ 0.5 mW의 / 2 mm로 측정되었다. 따라서, 광원으로서 에피 형광 현미경을 사용하는 경우에 경험적 효율을 결정하는 것이 매우 바람직하다. LED의 장점은 수천 시간에 걸쳐 안정성이다. 이전 연구는 정확한 메커니즘이 결정되어야 남아 있지만 miniSOG는, 펄스 광 (22)에서 ROS - 매개 세포 제거에 더 강력한 것을 보여 주었다. 우리는 펄스 빛을 만들기 위해 디지털 함수 발생기 / 앰프를 사용했다. 또 다른 옵션은 LED 리튬을 조절하는 USB-TTL 인터페이스를 (도 1a)를 사용하여 컴퓨터에 광원을 연결하는프로그램에 의해 GHT. 여기에 설명 된 LED 시스템은 또한 channelrhodopsin 23을 이용하여 흥분성 세포 optogenetic 제어와 같은 다른 목적을 위해 사용될 수있다, 휴대 절제는 mitochondria- 또는 세포막 타겟 miniSOG 17, 22를 사용하고, 광 불 활성화 (CALI)를 발색단 이용한 단백질 19. 또한,이 돌연변이 optogenetic는 박테리아, 효모, 플라이 및 지브라 피쉬 같은 다른 유기체뿐만 아니라 포유 동물 세포주에 적용 할 수있는 가능성이있다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ultra High Power LED light source Prizmatix UHP-mic-LED-460 460 ± 5 nm
LED controller Prizmatix UHPLCC-01
Digital function generator/amplifier PASCO PI-9587C PI-9587C is no longer available. The replacement is PI-8127.
BNC cable male/male THORLABS CA3136
USB-TTL interface Prizmatix Optional
Photometer THORLABS PM50 and Model D10MM
Filter paper Whatman 1001-110
Stereomicroscope Leica MZ95
NGM plate Dissolve 5 g NaCl, 2.5 g Peptone, 20 g Agar, 10 µg/mL cholesterol in 1 L H2O. After autoclaving, add 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mM KH2PO4(pH 6.0). 
Lysis solution 10 mM Tris(pH 8.8), 50 mM KCl, 0.1% Triton X-100, 2.5 mM MgCl2, 100 µg/mL Proteinase K

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유전학 문제 117 게놈 전체의 무작위 돌연변이 유발 DNA 변형 ROS 히스톤 - miniSOG 유전자 통합 염색체 삭제 앞으로 유전자 검사
히스톤 - miniSOG에서 사용 Optogenetic 무작위 돌연변이 유발<em&gt; C. 엘레</em
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Noma, K., Jin, Y. Optogenetic Random … More

Noma, K., Jin, Y. Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans. J. Vis. Exp. (117), e54810, doi:10.3791/54810 (2016).

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