Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Optogenetic Random Mutagenese Bruke Histone-miniSOG i Published: November 14, 2016 doi: 10.3791/54810
Automatic Translation
1, 1,2
1Division of Biological Sciences, Section of Neurobiology, University of California in San Diego and Howard Hughes Medical Institute, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, University of California in San Diego School of Medicine and Howard Hughes Medical Institute

Summary

Genetisk kodet histon-miniSOG induserer genom-wide arve mutasjoner i et blått lys avhengig måte. Dette mutagenese metoden er enkel, rask, fri for giftige kjemikalier, og godt egnet for videre genetisk screening og transgenet integrasjon.

Introduction

Termin genetiske skjermer har blitt mye brukt til å generere genetiske mutanter forstyrre ulike biologiske prosesser i modellorganismer som Caenorhabditis elegans (C. elegans) 1. Analyser av slike mutanter føre til oppdagelse av funksjonelt viktige gener og deres signalveier 1,2. Tradisjonelt mutagenese i C. elegans oppnås ved bruk av mutagene kjemikalier, stråling, eller transposoner 2. Kjemikalier som etylmetansulfonat (EMS) og N-etyl-N -nitrosourea (ENU) er giftige for mennesker; gamma-ray eller ultrafiolett (UV) stråling mutagenese krever spesialutstyr; og transposon-aktive stammer som Mutator stammer 3, kan føre til unødvendige mutasjoner under vedlikehold. Vi har utviklet en enkel tilnærming til å indusere arve mutasjoner ved hjelp av en genetisk kodet fotosensibiliserende 4.

Reaktive oksygenforbindelser (ROS) kan skade DNA fem.Mini Singlet Oxygen generator (miniSOG) er et grønt fluorescerende protein på 106 aminosyrer som ble konstruert fra LOV (lys, oksygen og spenning) domene av Arabidopsis phototropin 2 6. Ved eksponering for blått lys (~ 450 nm), miniSOG genererer ROS inkludert singlet oksygen med fl avin mononukleotid som en kofaktor 6-8, som er til stede i alle celler. Vi har konstruert en His-mSOG fusjonsproteinet ved å merke miniSOG til den C-terminale ende av histon-72, en C. elegans variant av Histone 3. Vi ga en løssalgs transgen 9 til å uttrykke Hans-mSOG i germline av C. elegans. Under normale dyrkningsforhold i mørke, Hans-mSOG transgene ormer har normal kullstørrelse og levetid fire. Ved eksponering for blå LED lys, Hans-mSOG ormer produserer arve mutasjoner blant deres avkom 4. Spekteret av induserte mutasjoner omfatter nucleotide endringer, for eksempel G: C til T: A og G: C til C: G og små chromosomeg slettinger fire. Dette mutagenese prosedyren er enkel å utføre, og krever minimalt med lab sikkerhet oppsett. Her beskriver vi LED-belysning oppsett og prosedyrer for optogenetic mutagenese.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Bygging av LED-lys

MERK: Den nødvendige LED utstyr er oppsummert i materialliste. Hele LED oppsettet er liten og kan plasseres hvor som helst i laboratoriet, men vi anbefaler den plasseres i et mørkt rom til å styre lys eksponering av ormer 4.

  1. Koble LED til en kontroller med kabler (figur 1A, D).
  2. Koble kontrolleren til en digital funksjon generator / forsterker med en BNC-kabel (figur 1A, C, D).
  3. Fest LED lys 10 cm over scenen ved hjelp av en egendefinert holderen (figur 1A).
    MERK: Vi har gjort holderen med metalldeler.
  4. Dekk til LED-belysning oppsett delvis, men unngå varmeakkumuler (figur 1B), som gjør ormer syk.
    MERK: Vi bruker en skreddersydd hardt plastdeksel med åpen topp og bunn (figur 1A). Dekselet er ikke nødvendig for mutagenese i seg selv, men blir brukt to begrense unødvendig eksponering av det blå lyset til omgivelsene. Vi anbefaler å ikke dekke LED oppsettet helt (figur 1B) for å hindre overoppheting ormer.
  5. Bruk laser-beskyttende briller.
    MERK: Vi bruker laser-beskyttelsesbriller fordi lyset er svært lyse. Solbriller kan fungere også.
  6. Slå spaken av LED-kontrolleren til 'Int.' for kontinuerlig belysning (figur 1D) og sette den på 65% av maksimal effekt (figur 1C).
  7. Bruk et fotometer for å måle blått lys intensitet på scenen hvor ormene er plassert ved hjelp av produsentens protokoll. Oppsettet gir 2,0 mW / mm 2 under kontinuerlig belysning.

2. Blue Light Treatment

MERK: Bruk belastningen CZ20310 juSi164 [Pmex-5-HIS-72 :: miniSOG-3'UTR (TBB-2) + CB-unc-119 (+)] UNC-119 (DE3) III 4 Belastningen er tilgjengelig. på Caenorhabditis Genetics Center (CGC, http: //www.cgc.cbs.umn.edu/).

  1. Opprettholde Hans-mSOG belastning i mørket på standard nematode vekst medium (NGM) plater med E. coli OP50 etter en standard protokoll 10,11.
    MERK: Under ambient lys, trenger juSi164 holdige stammer ikke vise en mutasjonsraten over en spontan sats 4. Rutine belastning passasje ved hjelp av en dissekere omfang med en halogenlampe vanligvis ikke forårsaker mutasjoner i tillegg. Likevel bør man være forsiktig for å unngå unødvendig eksponering for lys, for eksempel å holde stammene i en standard mørk inne inkubator, eller dekker stammer med folie. Det anbefales å fryse prøver av belastningen etter å ha fått det i tilfelle unødvendige mutasjoner akkumuleres over tid.
  2. Plukk gravid ung voksen (ca 12 timer etter L4) dyr med en orm plukke 11.
    MERK: Yngre dyr viser mindre mutagen effekt 4, mens eldre dyr kan ha lavere kullstørrelse.
  3. Skjær et filter paper til å passe en 60 mm plate med en 25 mm x 25 mm firkantet hull og legg inn en uanriket plate (figur 1E).
    MERK: En firkantet slag kan brukes, men størrelsen av den effekt trenger ikke å være nøyaktig.
  4. Slipp 100 pl av 100 mM CuCl2 på filterpapiret jevnt for å begrense ormer innenfor det firkantede hull på plate.
  5. Plukke ønsket antall av gravid unge voksne hermaphrodites (se trinn 3 for et eksempel), og overfører til midten av CuCl 2 plate.
  6. Bruk laser vernebriller.
  7. Slå på LED og funksjon generator.
  8. Slå spaken av LED-kontrolleren til Ext. for å styre den ved funksjonsgenerator (figur 1D).
  9. Sett kontrolleren ved 65% av maksimal effekt og funksjonsgeneratoren som sinusbølge, 4 Hz (figur 1C).
  10. Plasser CuCl 2 plate fra trinn 2,5 uten lokk på scenen under LED (figur 1A </ Strong>).
  11. Belyse dyr med blått lys i 30 min.
  12. Overfør friskt utseende ormer til en seeded plate som P 0.
    MERK: ønsket antall P 0 avhenger av typen av skjermen. Se trinn 3 for et eksempel. De P 0 ormer kan synes å være ukoordinert umiddelbart etter lysbehandling og vil komme seg over tid.
  13. Hold ormer dekket ved hjelp av folie i en inkubator eller i mørket; og følge standard prosedyre for å begynne screening ønskede fenotyper blant deres avkom 2,10.

3. Eksempel på en Forward Genetisk Screen

MERK:. Dette er et eksempel på den klonale skjermen med 120 haploide genomer for å sjekke om LED og belastning jobber Figur 2 viser en skjematisk av prosedyren.

  1. [Dag1] Etter blått lys behandling, plukke fem friske jakt ormer på en NGM plate med OP50 som P 0, holde dem i en 20 ° C inkubator, og la dem legge egg for end ( 'Dag1' plate).
  2. [Day2] Transfer P 0 på en ny seeded plate ( 'Day2' plate).
  3. [Day3] Plukk og drepe P 0 på "Day2 'plate ved å brenne dem.
  4. [Dag 4] Plukk 30 gravid ung voksen F 1 fra "Dag1 'plate og overføre dem til individuelle plater (30 F 1 plater for' Dag1 ').
  5. [Day5] Gjenta trinn 3.4 for 'Day2' plate (30 F 1 plater for 'Day2').
  6. [Day7-9] Sjekk unormale morfologi og / eller oppførsel av F 2 ormer i forhold til WT belastningen (figur 3A) under en standard stereo når de blir voksne.
    MERK: En arve mutasjon viser om en fjerdedel av ormer med samme fenotype blant F 2 når det er recessive med høy penetrans. Imidlertid kan noen mutanter vokser sakte og / eller viser delvis pene. Derfor er det mulig at mindre enn en fjerdedel av mutantene kan bli funnet på entallerken.
  7. Plukk ormer med synlige fenotyper individuelt og sjekk arvbarheten av fenotype i neste generasjon.

4. Eksempel på et ekstrakromosomalt Transgene Integration

  1. Injisere DNA av interesse i CZ20310 juSi164 [Pmex-5-His-72 :: miniSOG-3'UTR (TBB-2) + CB-unc-119 (+)] unc-119 (DE3) og forberede transgene ormer med en lav overføringshastighet (10-30%) etter en standard injeksjonsprotokoll 12,13.
    MERK: Alternativt kan etablerte ekstrakromosomale arrays krysses inn i juSi164 stammer. For å unngå for genotyping juSi164, kan juSi164 heterozygoter anvendes som P 0 selv om effektiviteten kan bli redusert. Den genotyping metode for juSi164 er beskrevet i punkt 5.
  2. [Dag1] Unn ~ 20 transgene dyr som P 0 med blått lys som beskrevet i trinn 2.
    MERK: Mer P 0 ormer er nødvendig, avhengig av st ansmission rate. Transgener kan identifiseres ved fenotyper eller coinjection markør 12,13.
  3. Plukk 10 sunn P 0 på enkelte plater, holde dem i en 20 ° C inkubator, og la dem legge egg i et par dager (P 0 plater)
  4. [Dag 4] Enkelt ut 20 transgen F 1 ormer fra hver P 0 platen på enkelte plater og la dem legge egg. (20 F 1 x 10 P 0 plater = 200 F 1 plater totalt.)
  5. [Day7] Finn F 1 plater med> 75% F 2 med transgener.
  6. Plukk fem transgene dyr fra> 75% overføringshastighet F 1 plater (F 2 plater).
  7. [Day10] Hold F 2 plater med 100% overføringshastighet som potensielle integrerte linjer.
  8. Parre de potensielle integrert linjer ved hjelp av en standard prosedyre 10 for å sjekke Mendelsk segregering og for å fjerne eventuelle bakgrunns mutasjoner.
le "> 5. Genotyping

  1. Lyse 20 outcrossed F 2 ormer i lyseringsbuffer ved hjelp av en standard protokoll 14.
  2. Utføre PCR ved anvendelse av primere for MosSCI innsetting 9, juSi164, (tabell 1) med en glødetemperatur på 58 ° C etter en standard protokoll 14.
    MERK: Det er unødvendig å genotype unc-119 (DE3) fordi unc-119 (DE3) kan oppdages ved ukoordinert oppførsel etter å ha fjernet redde transgenet (juSi164) i følgende trinn 5.4 og 5.5.
  3. Kjør agarosegelelektroforese 15 og undersøke bandet størrelser (Tabell 1) for å finne WT for juSi164.
  4. Undersøke om F 2 avkom har lammet ormer på grunn av eksistensen av UNC-119 (DE3).
  5. Hvis ukoordinerte ormer er funnet på trinn 5.4, til enkelt flere nonuncoordinated ormer innhente alle nonuncoordinated ormer i neste generasjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi utførte en frem genetisk skjerm med CZ20310 juSi164 unc-119 (DE3) med 30 min lyseksponering etter standard protokoll beskrevet i punkt 2 og 3. Blant 60 F 1 plater som tilsvarer 120 mutageniserte haploide genomer, fant vi 8 F 1 plater med F 2 ormer viser synlige fenotyper som kroppsstørrelse defekt (figur 3B), ukoordinert bevegelse (figur 3C), og voksen dødelighet (Figur 3D). Vi gjorde ikke merke noen forskjell i antall mutanter mellom "Dag1 'og' day2 'plater. Alle avkom blinket små F 2 ormer og ukoordinerte F 2 ormer viste tilsvarende fenotyper, noe som tyder på at de er arvelige mutanter. Hele observasjonen er oppsummert i tabell 2. I gjennomsnitt vil en klonal skjerm med 120 haploide genomer resultere i ca 10 F 1 plater conholde ormer med synlig påvisbare fenotyper som kroppsform og bevegelse som lett oppdaget under et stereomikroskop. Mer kvantitativ analyse er nødvendig for å bestemme den mutasjonsfrekvensen nøyaktig fire. Det forventede antall synlige mutanter fra denne skjermen tyder på at belastningen og oppsettet fungerer som de skal for optogenetic mutagenese.

Figur 1
Figur 1:. LED Setup (A) Hele systemet. Lampen ble montert på en skreddersydd holderen. Detaljer finner du i liste over materialer. (B) Dekselet er laget av plast. Det dekker ikke systemet helt å unngå varme opphopning. (C) Controller og funksjonsgenerator. (D) Baksiden av systemet. (E) En uanriket plate med CuCl 2 -soaked filterpapir for blått lys behandling. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2:. Eksperimentell Prosedyre for en Klonal Screen Etter blått lys behandling, er P 0 ormer overført til en seeded plate og lov til å legge egg. P 0 ormer er overført til en ny seeded plate 1 d etter lysbehandling og drept to d etter lysbehandling. F 1 ormer er blinket fra P 0 platene. Fenotyper av F 2 ormer er undersøkt etter at de blir voksne. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

10fig3.jpg "/>
Figur 3: Eksempel på Mutants (A) Original belastning for optogenetic mutagenese. CZ20310 juSi164 unc-119 (DE3). Denne belastningen har normal kroppsform, atferd, og kullstørrelse. Skala: 0,5 mm. . (B - D) F 2 avkom som viser kroppsstørrelse defekt (B), ukoordinert (C), og dødelige (D) fenotyper Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tabell 1
Tabell 1: Genotyping av juSi164 og unc-119 (DE3).

Tabell 2
Tabell 2: Eksempel på fenotyper from en Klonal Screen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her beskriver vi en detaljert fremgangsmåte for optogenetic mutagenese bruker Hans-mSOG uttrykt i germline og gi et eksempel på en liten skala frem genetisk skjermen. Sammenlignet med standard kjemisk mutagenese, har dette optogenetic mutagenese fremgangsmåte flere fordeler. For det første er det ikke giftig, og dermed holde lab personell unna giftige kjemiske mutagener som EMS, ENU og trimethylpsoralen med ultrafiolett lys (TMP / UV). For det andre kan den eksperimentelle prosedyren ifølge mutagenese benyttes for et lite antall av de P 0 dyr, og kan være ferdig i løpet av en time. For det tredje produserer optogenetic mutagenese et bredt spekter av mutasjoner, inkludert nukleotidsubstitusjoner og kromosom delesjoner. Endelig kan det optogenetic mutagenese benyttes for integrasjon av ekstrakromosomale transgener.

Det kritiske trinnet i denne mutagenese protokollen er å sikre at LED oppsettet fungerer på Hans-mSOG inneholder stammer på exforventes effektivitet. Vi anbefaler å utføre en pilot klonal skjerm, som beskrevet i protokollen § 3, med ca 100 haploide genomer. Mutagenesen er lett skaleres fra småskala pilotskjermer til nonclonal skjermer ved å øke antallet av P-0 for lysbehandlingen. For store nonclonal skjermer, foreslår vi å synkron ormer til gravid unge voksne og overføre hundrevis av dem med M9 løsning på en CuCl2 plate for lysbehandling. Standarden tilstanden beskrevet i trinn 2 og 3 er estimert til å ha omtrent 4,4 ganger lavere effektivitet enn den mye brukte 50 mM EMS mutagenese metode 4. Mutasjonshastigheten kan forbedres ved å øke lyset eksponeringstiden og / eller å øke intensiteten av lyset. Men disse endringene føre til fototoksisitet og føre til liten kullstørrelse og sykdom av lys-behandlet ormer. For å øke effektiviteten, kan det være mulig å benytte miniSOG derivater med høyere utbytte ROS sliktsom miniSOG (Q103L) selv om det kan øke bakgrunnen mutagenese effekt uten lysbehandling 16,17. For endring av DNA-konstruksjonen, den Pmex-5-HIS-72 :: miniSOG-3'UTR (TBB-2) plasmid (pCZ886) er tilgjengelig kommersielt.

Under de forholdene som er beskrevet her, er integrerte transgener generert på omtrent én linje per 200 F 1 i gjennomsnitt 4 når du bruker en extrachromosomal transgene stamme med en overføringshastighet på 10 - 30%. Denne effektiviteten kan økes ved å bruke ekstrakromosomale transgene stammer med høye overføringshastigheter som tidligere er rapportert for en UV-stråling metode 18.

His-mSOG-mediert mutagenese optogenetic induserer mutasjoner i et bredt spekter av gener. Dessuten er frekvensen av loci utvinnes fra rpm-en suppressor skjermen ved hjelp optogenetic mutagenese lik de fra samme skjermen ved hjelp av EMS 4. Imidlertid er det imidlegjengelig som optogenetic mutagenese ved hjelp av en histone genet kan ha en bias mot visse gener, på grunn av ukjente faktorer som kromatinstruktur. For å løse dette problemet, er det nødvendig å analysere mange optogenetically induserte mutasjoner av hele genomsekvensering.

Hans-mSOG-mediert optogenetic mutagenese fører et bredt spekter av mutasjoner inkludert single nucleotide erstatninger og slettinger som strekker seg fra en bp til noen få hundre bp 4. Spekteret av enkelt-nukleotid-varianter antyder at miniSOG-induserte reaktive oksygenarter er årsaken til mutasjonene 4. Det er også mulig at miniSOG skader histonproteinene og bevirker kromatin ustabilitet på grunn miniSOG brukes til å inaktivere proteiner samt 19. Det kan være mulig å manipulere den type mutasjoner ved hjelp av lys av forskjellige intensiteter. Siden optogenetic mutagenese fører til delesjoner, er det viktig å analysere delesjoner så vel som enkle nukleotid- endringer i hvemle genom sekvense data for kartlegging 20.

Det ble tidligere rapportert at en epifluorescent mikroskop brukes for miniSOG-mediert celle ablasjon 21,22. Lysintensiteten i et standard epifluorescent sammensatt mikroskop ble målt til å være ~ 0,5 mW / mm 2 uten en linse, som er omtrent 4 ganger lavere enn den som anvendes i den vanlige optogenetic mutagenese protokoll. Således er det produsert en empirisk å bestemme effektiviteten ved bruk av et epi-fluorescerende mikroskop som en lyskilde. En fordel med LED er stabiliteten over tusenvis av timer. Tidligere studier har vist at miniSOG er mer potente i ROS-mediert celle ablasjon i henhold pulset lys 22, selv om den nøyaktige mekanismen gjenstår å bli bestemt. Vi brukte en digital funksjon generator / forsterker for å gjøre pulserende lys. Et annet alternativ er å koble lyskilden til en datamaskin med en USB-TTL grensesnitt (figur 1A) for å regulere LED liGHT av et program. LED-systemet er beskrevet her kan også brukes til andre formål, for eksempel optogenetic kontroll av hissige celler ved hjelp channelrhodopsin 23, celle ablasjon bruker mitochondria- eller celle-membran-målrettet miniSOG 17,22, og Kromofor-pasning Lys Inaktive (CALI) av proteiner 19. Videre har dette optogenetic mutagenese potensiale til å bli brukt på andre organismer, slik som bakterier, gjær, fly og sebrafisk, så vel som pattedyrcellelinjer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ultra High Power LED light source Prizmatix UHP-mic-LED-460 460 ± 5 nm
LED controller Prizmatix UHPLCC-01
Digital function generator/amplifier PASCO PI-9587C PI-9587C is no longer available. The replacement is PI-8127.
BNC cable male/male THORLABS CA3136
USB-TTL interface Prizmatix Optional
Photometer THORLABS PM50 and Model D10MM
Filter paper Whatman 1001-110
Stereomicroscope Leica MZ95
NGM plate Dissolve 5 g NaCl, 2.5 g Peptone, 20 g Agar, 10 µg/mL cholesterol in 1 L H2O. After autoclaving, add 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mM KH2PO4(pH 6.0). 
Lysis solution 10 mM Tris(pH 8.8), 50 mM KCl, 0.1% Triton X-100, 2.5 mM MgCl2, 100 µg/mL Proteinase K

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nat Rev Genet. 3 (5), 356-369 (2002).
  2. Kutscher, L. M., Shaham, S. Forward and reverse mutagenesis in C. elegans. WormBook. , 1-26 (2014).
  3. Collins, J., Saari, B., Anderson, P. Activation of a transposable element in the germ line but not the soma of Caenorhabditis elegans. Nature. 328 (6132), 726-728 (1987).
  4. Noma, K., Jin, Y. Optogenetic mutagenesis in Caenorhabditis elegans. Nat Commun. 6, 8868 (2015).
  5. Cooke, M. S., Evans, M. D., Dizdaroglu, M., Lunec, J. Oxidative DNA damage: mechanisms, mutation, and disease. FASEB J. 17 (10), 1195-1214 (2003).
  6. Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLoS Biol. 9 (4), 1001041 (2011).
  7. Ruiz-Gonzalez, R., et al. Singlet oxygen generation by the genetically encoded tag miniSOG. J Am Chem Soc. 135 (26), 9564-9567 (2013).
  8. Pimenta, F. M., Jensen, R. L., Breitenbach, T., Etzerodt, M., Ogilby, P. R. Oxygen-dependent photochemistry and photophysics of "miniSOG," a protein-encased flavin. Photochem Photobiol. 89 (5), 1116-1126 (2013).
  9. Frokjaer-Jensen, C., et al. Random and targeted transgene insertion in Caenorhabditis elegans using a modified Mos1 transposon. Nat Methods. 11 (5), 529-534 (2014).
  10. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  11. Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. J Vis Exp. (47), (2011).
  12. Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. (18), (2008).
  13. Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).
  14. Fay, D., Bender, A. Genetic mapping and manipulation: chapter 4--SNPs: introduction and two-point mapping. WormBook. , 1-7 (2006).
  15. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
  16. Westberg, M., Holmegaard, L., Pimenta, F. M., Etzerodt, M., Ogilby, P. R. Rational design of an efficient, genetically encodable, protein-encased singlet oxygen photosensitizer. J Am Chem Soc. 137 (4), 1632-1642 (2015).
  17. Xu, S., Chisholm, A. D. Highly efficient optogenetic cell ablation in C. elegans using membrane-targeted miniSOG. Sci Rep. 6, 21271 (2016).
  18. Mariol, M. C., Walter, L., Bellemin, S., Gieseler, K. A rapid protocol for integrating extrachromosomal arrays with high transmission rate into the C. elegans genome. J Vis Exp. (82), (2013).
  19. Lin, J. Y., et al. Optogenetic inhibition of synaptic release with chromophore-assisted light inactivation (CALI). Neuron. 79 (2), 241-253 (2013).
  20. Minevich, G., Park, D. S., Blankenberg, D., Poole, R. J., Hobert, O. CloudMap: A Cloud-Based Pipeline for Analysis of Mutant Genome Sequences. Genetics. 192 (>4), 1249-1269 (2012).
  21. Qi, Y., Xu, S. MiniSOG-mediated Photoablation in Caenorhabdtis elegans. Bio-protocol. 3 (1), http://www.bio-protocol.org/e316 316 (2013).
  22. Qi, Y. B., Garren, E. J., Shu, X., Tsien, R. Y., Jin, Y. Photo-inducible cell ablation in Caenorhabditis elegans using the genetically encoded singlet oxygen generating protein miniSOG. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (19), 7499-7504 (2012).
  23. Nagel, G., et al. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).

Tags

Genetikk genome-wide tilfeldig mutagenese modifikasjons DNA ROS histon-miniSOG transgenet integrasjon Kromosom sletting frem genetisk screening
Optogenetic Random Mutagenese Bruke Histone-miniSOG i<em&gt; C. elegans</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Noma, K., Jin, Y. Optogenetic Random … More

Noma, K., Jin, Y. Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans. J. Vis. Exp. (117), e54810, doi:10.3791/54810 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter