Summary
Geneticamente codificado histona-miniSOG induz mutações hereditárias do genoma de uma forma dependente da luz azul. Este método de mutagénese é simples, rápido, livre de produtos químicos tóxicos, e bem adequada para triagem genética para a frente e integração do transgene.
Introduction
Telas genéticos forward têm sido amplamente utilizados para gerar mutantes genéticos perturbadoras vários processos biológicos em organismos modelo tais como Caenorhabditis elegans (C. elegans) 1. As análises de tais mutantes levar à descoberta de genes funcionalmente importantes e suas vias de sinalização 1,2. Tradicionalmente, a mutagénese em C. elegans é conseguida usando produtos químicos mutagénicos, radiação ou transposons 2. Produtos químicos, tais como metanossulfonato de etilo (EMS) e N-etil-N -nitrosourea (ENU) são tóxicos para os seres humanos; de raios gama ou de raios ultravioleta (UV) mutagénese radiação requer equipamento especial; e estirpes transposon-activa, tais como cepas mutantes 3, pode causar mutações desnecessários durante a manutenção. Nós desenvolvemos uma abordagem simples para induzir mutações hereditárias usando um fotossensibilizador geneticamente codificado 4.
Espécies Reativas de Oxigênio (ROS) podem danificar o DNA 5.O Gerador de mini-oxigênio singlete (miniSOG) é uma proteína verde fluorescente de 106 aminoácidos que foi projetado a partir do LOV (luz, oxigênio, e tensão) de domínio de Arabidopsis phototropin 2 6. Após a exposição à luz azul (~ 450 nm), miniSOG gera ROS, incluindo oxigénio singuleto com FL avin mononucleótido como um cofactor 6-8, que está presente em todas as células. Construiu-se uma proteína de fusão His-MSOG por marcação miniSOG para o terminal C da histona-72, um C. variante elegans de histona 3. Geramos um transgene de cópia única 9 para expressar His-MSOG na linha germinativa de C. elegans. Em condições normais de cultura no escuro, os vermes transgênicos His-MSOG tem o tamanho da ninhada normal e tempo de vida 4. Após a exposição à luz LED azul, os vermes His-MSOG produzir mutações hereditárias entre seus descendentes 4. O espectro de mutações induzidas inclui mudanças de nucleótidos, tais como G: C para T: A e G: C para C: G, e pequena chromosome Exclusões 4. Este processo de mutagénese é simples de executar, e requer uma configuração mínima segurança do laboratório. Aqui, descrevemos a instalação de iluminação LED e procedimentos para mutagénese optogenética.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Construção do Iluminador LED
NOTA: O equipamento de LED necessário é resumido na Lista de Materiais. A configuração LED inteiro é pequeno e pode ser colocado em qualquer lugar no laboratório, embora recomendamos que ser colocado em um quarto escuro para controlar a exposição à luz de vermes 4.
- Ligue o LED a um controlador com cabos (Figura 1A, D).
- Ligue o aparelho a uma função de gerador / amplificador digital com um cabo BNC (Figura 1A, C, D).
- Corrigir os LED de luz 10 cm acima do palco usando um suporte personalizado (Figura 1A).
NOTA: Nós fizemos o suporte com peças de metal. - Cubra a instalação de iluminação LED parcialmente, mas evitar a acumulação de calor (Figura 1B), o que torna vermes doente.
NOTA: Nós usamos uma cobertura de plástico rígido feito por encomenda com a parte superior aberta e inferior (Figura 1A). A tampa não é necessária para a própria mutagénese, mas é usado o to limitar a exposição desnecessária da luz azul para os arredores. Aconselhamos a não cobrir a configuração LED totalmente (Figura 1B) para evitar o sobreaquecimento os vermes. - Use óculos de laser de proteção.
NOTA: usar óculos de laser de proteção porque a luz é muito brilhante. Óculos de sol pode funcionar tão bem. - Mudar a alavanca do controlador de LED para 'Int.' para iluminação contínua (Figura 1D) e estabelece-lo em 65% da potência máxima (Figura 1C).
- Use um fotômetro para medir a intensidade da luz azul sobre a fase em que os vermes são colocados utilizando o protocolo do fabricante. A configuração dá 2,0 mW / mm 2 sob iluminação contínua.
2. Tratamento Light Blue
NOTA: Utilize a tensão CZ20310 juSi164 [Pmex-5-HIS-72 :: miniSOG-3'UTR (TBB-2) + Cb-unc-119 (+)] unc-119 (ED3) III 4 A estirpe está disponível. no Caenorhabditis Genetics Center (CGC, http: //www.cgc.cbs.umn.edu/).
- Manter a tensão His-MSOG no escuro em meio de crescimento nematóide padrão (NGM) placas com E. coli OP50 seguindo um protocolo padrão 10,11.
NOTA: Sob luz ambiente, juSi164 estirpes molecular contendo não apresentam uma taxa de mutação acima de uma taxa espontânea 4. passagem estirpe de rotina usando um escopo de dissecação com uma lâmpada de halogéneo geralmente não causa mutações também. No entanto, os cuidados devem ser tomados para evitar a exposição desnecessária à luz, por exemplo, mantendo as tensões em uma incubadora-escuro dentro standard, ou cobrindo as tensões com papel alumínio. Aconselha-se a congelar alíquotas da estirpe após recebê-la no caso de mutações desnecessárias se acumulam ao longo do tempo. - Escolha grávida jovem adulto (cerca de 12 h pós-L4) animais com um verme pegar 11.
NOTA: Os animais mais jovens mostram efeito menos mutagênico 4, enquanto que os animais mais velhos podem ter menor tamanho da ninhada. - Corte um filtro paper para atender a uma placa de 60 mm com 25 mm x 25 milímetros furo quadrado e coloque sobre uma placa unseeded (Figura 1E).
NOTA: Um perfurador quadrado pode ser usado, mas o tamanho do punção não tem de ser preciso. - Queda de 100 ul de 100 mM de CuCl 2, no papel de filtro para restringir uniformemente vermes dentro do furo quadrado sobre a placa.
- Escolha número desejado de grávidas hermafroditas adultos jovens (ver Passo 3, por exemplo) e transferir para o centro da placa de CuCl2.
- Usar a laser óculos de proteção.
- Ligue o LED e o gerador de função.
- Mudar a alavanca do controlador de LED para "Ext." para controlá-lo por o gerador de funções (Figura 1D).
- Definir o controlador a 65% da potência máxima e o gerador de função como onda senoidal, 4 Hz (Figura 1C).
- Colocar a placa de CuCl 2 do Passo 2.5, sem uma tampa sobre o palco sob o diodo emissor de luz (Figura 1A </ Strong>).
- Iluminar os animais com luz azul durante 30 min.
- Transferir vermes aparência saudável a um prato semeado como P 0.
NOTA: O número desejado de P 0 depende do tipo de tela. Consulte a Etapa 3 para um exemplo. Os P 0 vermes pode parecer ser descoordenada imediatamente após o tratamento de luz e vai recuperar ao longo do tempo. - Mantenha vermes cobertos com folha em uma incubadora ou no escuro; e siga o procedimento padrão para começar a triagem fenótipos desejados entre os seus descendentes 2,10.
3. Exemplo de uma tela genética Adiante
NOTA:. Este é um exemplo do ecrã clonal com 120 genomas haplóides para verificar se o diodo emissor de luz e a tensão estão a trabalhar Figura 2 mostra um esquema do processo.
- [Day1] Após o tratamento luz azul, escolher cinco vermes aparência saudável em uma placa NGM com OP50 como P 0, mantê-los em um 20 ° C incubadora, e deixá-los colocar ovos para 1d (placa 'Day1').
- [Day2] Transferência P 0 para uma nova placa sem sementes (placa 'Day2').
- [Day3] Escolha e matar P 0 na placa o 'Day2', queimando-os.
- [Day4] Escolha 30 gravídico jovem adulto F 1 da chapa 'Day1' e transferi-los em placas individuais (30 F 1 Bocas para 'Day1').
- [Dia5] Repita o passo 3.4 para a placa do "Day2 '(30 F 1 placas para' Day2 ').
- [Day7-9] Verifique as morfologias anormais e / ou comportamento de F 2 vermes em comparação com a estirpe WT (Figura 3A) sob um microscópio estereoscópico padrão quando se tornam adultos.
NOTA: uma mutação hereditárias exibe cerca de um quarto dos vermes com o mesmo fenótipo entre F 2, quando é recessiva com alta penetrância. No entanto, alguns mutantes podem crescer lentamente, e / ou mostrar penetrância parcial. Portanto, é possível que menos do que um quarto dos mutantes pode ser encontrado numaprato. - Escolha vermes com fenótipos visíveis individualmente e verificar a herdabilidade do fenótipo na próxima geração.
4. Exemplo de Integração Extracromossômica Transgene
- Injetar o DNA de interesse em CZ20310 juSi164 [Pmex-5-His-72 :: miniSOG-3'UTR (tbb-2) + Cb-unc-119 (+)] unc-119 (ED3) e preparar vermes transgênicos com uma baixa taxa de transmissão (10-30%) na sequência de um protocolo de 12,13 injeção padrão.
NOTA: Como alternativa, as matrizes extracromossômicos estabelecidos podem ser cruzados para as cepas juSi164. Para evitar a genotipagem em juSi164, heterozigotos juSi164 pode ser usado como a P 0, embora a eficiência pode ser diminuída. O método de genotipagem para juSi164 é descrito na Seção 5. - [Dia1] Tratar ~ 20 animais transgénicos como P 0 com luz azul, como descrito no Passo 2.
NOTA: Mais P 0 vermes são necessárias, dependendo do tr taxa de ansmission. Os transgenes podem ser identificados por co-injecção ou fenótipos marcador 12,13. - Escolha 10 saudável P procura 0 em placas individuais, mantê-los em um 20 ° C incubadora, e deixá-los põem ovos por alguns dias (P 0 placas)
- [Day4] Único out 20 transgênico F 1 vermes de cada placa P 0 em placas individuais e deixá-los pôr ovos. (20 f 1 x 10 placas de P 0 = 200 F 1 placas no total).
- [Day7] Encontrar F 1 placas com> 75% F 2 com transgenes.
- Escolha cinco animais transgénicos a partir da taxa de transmissão de> 75% F 1 F 2 placas (placas).
- [Dia10] Mantenha F 2 placas com taxa de transmissão de 100% como potenciais linhas integradas.
- Outcross as potenciais linhas integradas, usando um procedimento padrão 10 para verificar a segregação mendeliana e remover possíveis mutações de fundo.
- Lyse outcrossed 20 F 2 vermes em tampão de lise utilizando um protocolo padrão 14.
- Executar PCR utilizando os iniciadores para MosSCI inserção 9, juSi164, (Tabela 1) com uma temperatura de recozimento de 58 ° C, seguindo um protocolo padrão 14.
NOTA: Não é necessário ao genótipo unc-119 (ED3), porque unc-119 (ED3) pode ser detectado pelo comportamento descoordenado após a remoção do transgene resgatando (juSi164) nas seguintes etapas 5.4 e 5.5. - Execute eletroforese em gel de agarose 15 e examinar os tamanhos da banda (Tabela 1) para encontrar o WT para juSi164.
- Examinar se a progênie F 2 tem paralisado vermes devido à existência de unc-119 (ED3).
- Se vermes descoordenados são encontrados na etapa 5.4, individuais vários vermes nonuncoordinated obter todos os vermes nonuncoordinated na próxima geração.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Foi realizado um rastreio genético para a frente com CZ20310 juSi164 unc-119 (ED3), utilizando a exposição à luz 30 min seguindo o protocolo padrão descrito nas secções 2 e 3. Entre 60 F 1 placas correspondentes a 120 genomas haplóides mutagenizados, encontramos 8 F 1 placas com F 2 vermes que exibem fenótipos visíveis, tais como defeito tamanho do corpo (Figura 3B), o movimento descoordenado (Figura 3C), e letalidade adulto (Figura 3D). Nós não notar qualquer diferença no número de mutantes entre 'Day1 "e placas' Day2 '. Toda a descendência de escolhidas pequenos F 2 worms e descoordenados F 2 vermes mostrou os fenótipos correspondentes, sugerindo que eles são mutantes hereditárias. A observação completo está resumido no Quadro 2. Em média, uma tela clonal com 120 genomas haplóides resultará em cerca de 10 M uma con placastenção vermes com fenótipos visivelmente detectáveis, como a forma do corpo e locomoção que facilmente localizados sob um microscópio estereoscópico. Uma análise mais quantitativa é necessária para determinar a taxa de precisão 4 mutação. O número esperado de mutantes visíveis a partir desta tela sugere que a tensão e configuração estão funcionando corretamente para mutagénese optogenética.
Figura 1:. O Setup LED (A) O sistema inteiro. O LED foi montado em um suporte feito por encomenda. Detalhes são encontrados na Lista de Materiais. (B) A tampa é feita de plástico. Ele não cobre completamente o sistema para evitar a acumulação de calor. (C) Controller e função de gerador. (D) O lado de trás do sistema. (E) Uma placa unseeded com CuCl2 papel de filtro -soaked para o tratamento luz azul. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2:. Procedimento experimental para uma tela clonal Após tratamento com luz azul, P 0 vermes são transferidos para uma placa semeada e deixada a pôr ovos. P 0 vermes são transferidos para uma nova placa semeada 1 d após o tratamento de luz e matou 2 d após o tratamento de luz. F 1 vermes são escolhidos a partir dos P 0 placas. Fenótipos de F 2 vermes são examinados depois de se tornarem adultos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
10fig3.jpg "/>
Figura 3: Exemplo de Mutantes (A) estirpe original para mutagénese optogenetic:. CZ20310 juSi164 unc-119 (ED3). Esta linhagem tem forma normal do corpo, comportamento e tamanho da ninhada. Barra de escala: de 0,5 mm. . (B - D) F 2 progênie tamanho do defeito mostrando corpo (B), descoordenada (C), e fenótipos letais (D) Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: A genotipagem de juSi164 e unc-119 (ED3).
Tabela 2: Exemplo de fenótipos FRom uma tela clonal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aqui, nós descrevemos um procedimento detalhado de mutagénese utilizando optogenetic His-MSOG expresso na linha germinativa e fornecem um exemplo de um rastreio genético para a frente em pequena escala. Comparado a mutagénese química padrão, este método de mutagénese optogenetic tem várias vantagens. Em primeiro lugar, não é tóxico, mantendo assim o pessoal de laboratório longe de agentes mutagénicos químicos tóxicos, tais como EMS, ENU e trimetilpsoraleno com luz ultravioleta (TMP / UV). Em segundo lugar, o procedimento experimental de mutagénese pode ser utilizado para um pequeno número de animais P 0 e pode ser terminada dentro de uma hora. Em terceiro lugar, a mutagénese optogenetic produz um largo espectro de mutações incluindo substituições e deleções de nucleótidos de cromossomas. Finalmente, a mutagénese optogenetic pode ser usado para a integração de transgenes extracromossómicos.
O passo crítico neste protocolo mutagênese é garantir que a configuração LED funciona em Seus-MSOG contendo cepas na exeficiência perado. Recomendamos que você faça uma tela clonal piloto, conforme descrito na Seção Protocolo n.º 3, com cerca de 100 genomas haplóides. A mutagénese é facilmente escaláveis das telas pequenas escala piloto para telas nonclonal, aumentando o número de 0 P para o tratamento de luz. Para telas nonclonal grande escala, sugerimos a sincronização dos vermes para grávidas jovens adultos e transferir centenas deles com solução M9 sobre uma placa de CuCl 2 para tratamento de luz. A condição padrão descrito nos Passos 2 e 3 é estimada para ter eficiência cerca de 4,4 vezes menor do que o utilizado EMS 50 mM método de mutagénese 4. A taxa de mutação pode ser melhorada aumentando o tempo de exposição à luz e / ou aumentando a intensidade da luz. No entanto, essas modificações podem causar fototoxicidade e levar ao tamanho da ninhada pequeno e doença de vermes de luz tratada. Para aumentar a eficiência, pode ser possível a utilização de derivados miniSOG com um rendimento mais elevado de ERO, taiscomo miniSOG (Q103L) embora possa aumentar o efeito de fundo mutagênese sem luz tratamento 16,17. Para a modificação da construção de ADN, a (TBB-2) plasmídeo Pmex-5-His-72 :: miniSOG-3'UTR (pCZ886) está disponível comercialmente.
Sob as condições aqui descritas, os transgenes integrados são geradas em cerca de uma linha por 200 F 1, em média, 4 quando se utiliza uma estirpe transgénica extracromossómico com uma taxa de transmissão de 10 - 30%. Esta eficiência pode ser aumentada usando cepas transgênicas extracromossômicos com altas taxas de transmissão Como relatado anteriormente por um método de radiação UV 18.
His-MSOG mediada por mutagénese optogenetic induz mutações em uma vasta gama de genes. Além disso, a frequência de loci recuperado de tela supressor do rpm-1 utilizando mutagênese optogenética é semelhante aos da mesma tela usando EMS 4. No entanto, é possílho que mutagênese optogenetic usando um gene histona pode ter um viés para determinados genes, devido a fatores desconhecidos, como a estrutura da cromatina. Para abordar esta questão, é necessário analisar muitas mutações induzidas optogenetically por toda a sequenciação do genoma.
His-MSOG mediada por mutagénese optogenetic faz com que um largo espectro de mutações incluindo substituições e deleções de um único nucleótido que variam de 1 pb a algumas centenas de pb 4. O espectro de variantes de nucleótidos individuais sugere que as espécies reactivas de oxigénio induzida miniSOG são a causa de as mutações 4. É também possível que as proteínas histona miniSOG danos e causa instabilidade cromatina miniSOG porque é utilizado para inactivar proteínas bem 19. Pode ser possível manipular o tipo de mutações através da utilização de luz de intensidades diferentes. Desde mutagênese optogenetic provoca supressões, é importante analisar exclusões, bem como alterações de nucleotídeo único em queDados le sequenciação do genoma para o mapeamento de 20.
Foi relatado anteriormente que um microscópio de epifluorescência é utilizada para a ablação de células miniSOG mediada 21,22. A intensidade da luz de um microscópio de epifluorescência padrão composto foi medido como sendo de ~ 0,5 mW / mm2 sem uma lente, que é cerca de 4x mais baixo do que o utilizado no protocolo de mutagénese optogenetic padrão. Assim, é altamente aconselhável determinar empiricamente a eficiência quando se utiliza um microscópio epi fluorescente como fonte de luz. Uma vantagem do LED é a estabilidade ao longo de milhares de horas. Estudos anteriores demonstraram que miniSOG é mais potente na ablação de células ROS mediada sob luz pulsada 22, embora o mecanismo exacto ainda não foi determinado. Nós usamos uma câmera digital função de gerador / amplificador para fazer a luz pulsada. Outra opção é conectar a fonte de luz a um computador através de uma interface USB-TTL (Figura 1A) para regular o li LEDaltura desejada por um programa. O sistema de LED descrito aqui pode também ser utilizado para outros fins, tais como o controlo de optogenetic células excitáveis usando channelrodopsina 23, ablação celular usando mitochondria- ou de célula-alvo membrana miniSOG 17,22, e Cromóforo-Assisted Luz Inactivação (CALI) de proteínas 19. Além disso, esta mutagénese optogenetic tem o potencial de ser aplicado a outros microorganismos, tais como bactérias, leveduras, voar, e peixe-zebra, bem como linhas de células de mamíferos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ultra High Power LED light source | Prizmatix | UHP-mic-LED-460 | 460 ± 5 nm |
| LED controller | Prizmatix | UHPLCC-01 | |
| Digital function generator/amplifier | PASCO | PI-9587C | PI-9587C is no longer available. The replacement is PI-8127. |
| BNC cable male/male | THORLABS | CA3136 | |
| USB-TTL interface | Prizmatix | Optional | |
| Photometer | THORLABS | PM50 and Model D10MM | |
| Filter paper | Whatman | 1001-110 | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ95 | |
| NGM plate | Dissolve 5 g NaCl, 2.5 g Peptone, 20 g Agar, 10 µg/mL cholesterol in 1 L H2O. After autoclaving, add 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mM KH2PO4(pH 6.0). | ||
| Lysis solution | 10 mM Tris(pH 8.8), 50 mM KCl, 0.1% Triton X-100, 2.5 mM MgCl2, 100 µg/mL Proteinase K |
References
- Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nat Rev Genet. 3 (5), 356-369 (2002).
- Kutscher, L. M., Shaham, S. Forward and reverse mutagenesis in C. elegans. WormBook. , 1-26 (2014).
- Collins, J., Saari, B., Anderson, P. Activation of a transposable element in the germ line but not the soma of Caenorhabditis elegans. Nature. 328 (6132), 726-728 (1987).
- Noma, K., Jin, Y.
- Cooke, M. S., Evans, M. D., Dizdaroglu, M., Lunec, J. Oxidative DNA damage: mechanisms, mutation, and disease. FASEB J. 17 (10), 1195-1214 (2003).
- Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLoS Biol. 9 (4), 1001041 (2011).
- Ruiz-Gonzalez, R., et al. Singlet oxygen generation by the genetically encoded tag miniSOG. J Am Chem Soc. 135 (26), 9564-9567 (2013).
- Pimenta, F. M., Jensen, R. L., Breitenbach, T., Etzerodt, M., Ogilby, P. R. Oxygen-dependent photochemistry and photophysics of "miniSOG," a protein-encased flavin. Photochem Photobiol. 89 (5), 1116-1126 (2013).
- Frokjaer-Jensen, C., et al. Random and targeted transgene insertion in Caenorhabditis elegans using a modified Mos1 transposon. Nat Methods. 11 (5), 529-534 (2014).
- Brenner, S.
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. J Vis Exp. (47), (2011).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. (18), (2008).
- Mello, C., Fire, A.
- Fay, D., Bender, A. Genetic mapping and manipulation: chapter 4--SNPs: introduction and two-point mapping. WormBook. , 1-7 (2006).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
- Westberg, M., Holmegaard, L., Pimenta, F. M., Etzerodt, M., Ogilby, P. R. Rational design of an efficient, genetically encodable, protein-encased singlet oxygen photosensitizer. J Am Chem Soc. 137 (4), 1632-1642 (2015).
- Xu, S., Chisholm, A. D. Highly efficient optogenetic cell ablation in C. elegans using membrane-targeted miniSOG. Sci Rep. 6, 21271 (2016).
- Mariol, M. C., Walter, L., Bellemin, S., Gieseler, K. A rapid protocol for integrating extrachromosomal arrays with high transmission rate into the C. elegans genome. J Vis Exp. (82), (2013).
- Lin, J. Y., et al. Optogenetic inhibition of synaptic release with chromophore-assisted light inactivation (CALI). Neuron. 79 (2), 241-253 (2013).
- Minevich, G., Park, D. S., Blankenberg, D., Poole, R. J., Hobert, O. CloudMap: A Cloud-Based Pipeline for Analysis of Mutant Genome Sequences. Genetics. 192 (>4), 1249-1269 (2012).
- Qi, Y., Xu, S.
- Qi, Y. B., Garren, E. J., Shu, X., Tsien, R. Y., Jin, Y. Photo-inducible cell ablation in Caenorhabditis elegans using the genetically encoded singlet oxygen generating protein miniSOG. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (19), 7499-7504 (2012).
- Nagel, G., et al. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).
