Summary
Генетически-кодируемый гистона-miniSOG индуцирует генома наследуемые мутации в голубой светло-зависимым образом. Этот метод мутагенеза является простым, быстрым, свободным от токсичных химических веществ, а также хорошо подходит для прямого генетического скрининга и интеграции трансгена.
Introduction
Форвард генетический скрининг широко используются для создания генетических мутантов разрушающие различные биологические процессы в модельных организмах , таких как Caenorhabditis Элеганс (C. Элеганс) 1. Анализ таких мутантов приводят к открытию функционально важных генов и их сигнальных путей 1,2. Традиционно мутагенеза в C. Элеганс достигается за счет использования мутагенных химических веществ, радиации или транспозонов 2. Химические вещества , такие как этиловый эфир метансульфоната (EMS) и N - этил - N -nitrosourea (ENU) являются токсичными для человека; гамма-лучей или ультрафиолетового (УФ) излучения мутагенеза требует специального оборудования; и транспозонов-активные штаммы, такие как мутаторов штаммов 3, может вызвать ненужные мутации во время технического обслуживания. Мы разработали простой подход , чтобы вызвать наследуемые мутации с использованием генетически закодированного фотосенсибилизатора 4.
Активных форм кислорода (ROS) может привести к повреждению ДНК 5.Мини - Синглетно генератор кислорода (miniSOG) представляет собой зеленый флуоресцентный белок из 106 аминокислот , который был сконструированных из LOV (света, кислорода, и напряжение) области Arabidopsis phototropin 2 6. Под воздействием синего света (~ 450 нм), miniSOG генерирует РОС в том числе синглетный кислород с фл Авин мононуклеотид как кофактор 6-8, который присутствует во всех клетках. Мы сконструировали гибридный белок His-mSOG помечая miniSOG на С-конце гистона-72, в C. Элеганс вариант гистона 3. Мы создали одностраничный копию трансгена 9 , чтобы выразить Его-mSOG в зародышевую C. Элеганс. При нормальных условиях культивирования в темноте, трансгенные черви Его-mSOG имеют нормальный размер выводка и срок службы 4. При воздействии синей подсветкой, черви His-mSOG производят наследуемые мутации среди их потомства 4. Спектр индуцированных мутаций включает в себя нуклеотидные изменения, такие как G: C Т: А и G: C к C: G и небольшой chromosoя делеции 4. Эта процедура мутагенеза проста для выполнения, и требует минимальной настройки безопасности лаборатории. Здесь мы опишем установку светодиодной подсветки и процедуры для оптогенетика мутагенеза.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Конструкция светодиодной подсветки
Примечание: Необходимое оборудование LED резюмируется в списке материалов. Вся светодиодная установка мал и может быть размещен в любом месте в лаборатории, хотя мы рекомендуем быть размещены в темной комнате , чтобы контролировать освещенность червей 4.
- Подключить светодиод к контроллеру с кабелями (Рисунок 1А, D).
- Подключение контроллера к цифровому функции генератора / усилителя с помощью кабеля BNC (Рисунок 1A, C, D).
- Закрепите светодиодные на 10 см выше стадии , используя пользовательский держатель (Рисунок 1А).
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы сделали держатель с металлическими частями. - Накройте светодиодной подсветки установки частично, но избежать накопления тепла (рис 1б), что делает черви больных.
Примечание: Мы используем заказные жесткий пластиковый кожух с открытой верхней и нижней (рис 1А). Крышка не требуется для самого мутагенеза, но используется то ограничить ненужное воздействие синего света на окружающую среду. Мы рекомендуем , чтобы не покрыть полностью светодиодную установку (Рисунок 1B) для предотвращения перегрева червей. - Носите лазерные защитные очки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы носим лазерные защитные очки, потому что свет очень яркий. Солнцезащитные очки могут работать, как хорошо. - Переключите рычаг светодиодного контроллера "Int." для непрерывного освещения (рис 1D) и установить его на уровне 65% от максимальной мощности (рис 1C).
- Используйте фотометр для измерения интенсивности синего света на сцене, где черви размещены с использованием протокола производителя. Установка дает 2,0 мВт / мм 2 при непрерывном освещении.
2. Синий свет Лечение
Примечание: Используйте штамм CZ20310 juSi164 [Pmex-5-His-72 :: miniSOG-3'UTR (ТВВ-2) + Cb-ункции-119 (+)] ункции-119 (ed3) III 4 Штамм доступно. на Caenorhabditis генетический центр (CGC, HTTP: //www.cgc.cbs.umn.edu/).
- Поддерживайте напряжение Его-mSOG в темноте на стандартной среде роста нематода (NGM) пластины с E. палочка OP50 после стандартного протокола 10,11.
Примечание: Под окружающего света, -содержащие штаммы juSi164 не отображать частоту мутаций выше скорости спонтанного 4. Регулярное прохождение деформации, используя рассекает область с галогенной лампой, как правило, не вызывает мутации, а также. Тем не менее, следует соблюдать осторожность , чтобы избежать ненужного воздействия света, например, сохранение штаммов в стандартной темно-внутри инкубатора, или покрытие штаммов с фольгой. Рекомендуется заморозить аликвот штамма после его получения в случае ненужные мутации накапливаются с течением времени. - Встреча беременной молодых взрослых (приблизительно 12 ч после L4) животных с червяком забрать 11.
Примечание: Более молодые животные показывают менее мутагенный эффект 4, в то время как более старые животные могут иметь меньший размер выводка. - Вырезать фильтр ркабан , чтобы соответствовать 60 мм пластины с с 25 мм на 25 мм квадратное отверстие в и место на качестве затравки пластины (рис 1E).
Примечание: Квадратный перфоратор может быть использован, но размер пуансона не должен быть точным. - Отбросьте 100 мкл 100 мМ CuCl 2 на фильтровальную бумагу равномерно , чтобы ограничить червей в квадратное отверстие на пластине.
- Выберите нужное количество икряных молодых взрослых гермафродитов (шаг 3 для примера) и передать в центр пластины CuCl 2.
- Носите лазерные защитные очки.
- Переключатель на светодиодном и функционального генератора.
- Переключите рычаг светодиодного контроллера "Ext. контролировать ее с помощью функции генератора (рис 1D).
- Установите контроллер на 65% от максимальной мощности и функцию генератора в качестве синусоиды, 4 Гц (рис 1C).
- Поместите пластину CuCl 2 с шагом 2.5 без крышки на сцене под LED (рис 1А </ Сильный>).
- Осветить животных с синим светом в течение 30 мин.
- Передача здоровый вид червей на ракетке пластину , как P 0.
Примечание: Требуемое количество P 0 , зависит от типа экрана. См шаг 3 для примера. В P 0 черви могут оказаться несогласованными сразу после легкой обработки и будет восстанавливаться в течение долгого времени. - Держите черви, покрытые с помощью фольги в инкубаторе или в темное время суток; и следовать стандартной процедуре , чтобы начать скрининг желаемых фенотипов среди их потомства 2,10.
3. Пример Форвард генетическом скрининге
Примечание:. Это является примером клонального экрана с 120 гаплоидных геномов , чтобы проверить , если светодиод и деформации работают На рисунке 2 показана схема процедуры.
- [Day1] После синего света лечения, выбрать пять здоровый вид червей на тарелку NGM с OP50 как P 0, держать их в 20 ° C инкубатор, и пусть они откладывают яйца в течение 1d (пластинка 'DAY1').
- [Day2] Передача P 0 на новую ракетке пластины (пластина 'DAY2').
- [Day3] Pick и убить P 0 на табличке 'DAY2', сжигая их.
- [Day4] Pick 30 молодых взрослых беременной F 1 из пластины в 'DAY1' и передавать их на отдельные пластины (30 F 1 пластин для 'DAY1').
- [Число 5 число] Повторите шаг 3.4 для пластины в 'DAY2' (30 F 1 пластины для 'DAY2').
- [Day7-9] Проверьте ненормальные морфологию и / или поведение F 2 червей по сравнению со штаммом WT (рис 3А) под стандартной стереомикроскопа , когда они становятся взрослыми.
Примечание: наследственная мутация отображает около четверти червей с одинаковым фенотипом среди F 2 , когда он является рецессивным с высокой пенетрантностью. Тем не менее, некоторые мутанты могут расти медленно и / или показать частичную пенетрантность. Поэтому, вполне возможно, что менее четверти мутантов можно найти напластина. - Pick червей с видимыми фенотипы индивидуально и проверить наследственность фенотипу в следующем поколении.
4. Пример интеграции экстрахромосомального трансгена
- Впрыскивать интерес ДНК в CZ20310 juSi164 [Pmex-5-His-72 :: miniSOG-3'UTR (ТВВ-2) + Cb-ункции-119 (+)] ункции-119 (ed3) и подготовить трансгенные червей с низкая скорость передачи (10-30%) после стандартного протокола 12,13 инъекции.
Примечание: В качестве альтернативы, установленные экстрахромосомные массивы могут быть скрещены в штаммы juSi164. Чтобы избежать генотипирование для juSi164, juSi164 гетерозиготы могут быть использованы в качестве P 0 , хотя эффективность может снижаться. Метод генотипирования для juSi164 описана в разделе 5. - [Day1] Treat ~ 20 трансгенных животных , как P 0 с синим светом , как описано в шаге 2.
Примечание: Более P 0 черви необходимы в зависимости от тр Скорость ansmission. Трансгенов могут быть идентифицированы с помощью фенотипов или соинжекцию маркера 12,13. - Pick 10 здоровый вид P 0 на отдельные пластины, держать их в 20 ° C инкубатор, и пусть они откладывают яйца в течение нескольких дней (P 0) плиты
- [Day4] Одиночные из 20 трансгенной F 1 червей из каждого P 0 пластины на отдельные пластины и пусть они откладывают яйца. (20 F 1 х 10 P 0 = 200 пластины F 1 пластины в общей сложности.)
- [День7] Найти F 1 пластины с> 75% F 2 , имеющих трансгены.
- Возьмите пять трансгенных животных от скорости передачи данных > 75% F 1 пластины (F 2 пластины).
- [Дни 10] Keep F 2 пластины со 100% скорости передачи в качестве потенциальных интегрированных линий.
- Скрещивание потенциальные интегрированные линии , используя стандартную процедуру 10 для проверки Менделя сегрегации и устранить возможные фоновые мутации.
- Lyse 20 ауткроссной F 2 червей в буфере для лизиса с использованием стандартного протокола 14.
- Выполните ПЦР с использованием праймеров для MosSCI вставки 9, juSi164, (таблица 1) с температурой отжига 58 ° С ниже стандартного протокола 14.
Примечание: Нет необходимости генотипу КСН-119 (ed3) , потому что ункции-119 (ed3) можно обнаружить с помощью несогласованного поведения после удаления спасая трансген (juSi164) в следующих шагах 5.4 и 5.5. - Запуск электрофореза в агарозном геле 15 и изучить размеры полос (таблица 1) , чтобы найти WT для juSi164.
- Проверьте , если потомство F 2 парализовала червей из - за существования КСН-119 (ed3).
- Если несогласованные черви находятся на стадии 5.4, одиночные несколько nonuncoordinated червей для получения всех nonuncoordinated червей в следующем поколении.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы провели вперед генетический экран с CZ20310 juSi164 КСН-119 (ed3) с использованием 30 мин воздействия света в соответствии со стандартным протоколом , описанным в разделах 2 и 3. Среди 60 F 1 пластин , соответствующих 120 мутагенезу гаплоидных геномов, мы нашли 8 F 1 пластины с F 2 черви , отображающие видимые фенотипы , такие как размер тела дефекта (рис 3B), несогласованного движения (рис 3C), и для взрослых летальности (рис 3D). Мы не заметили никакой разницы в количестве мутантов между 'DAY1' и 'пластинами DAY2'. Все потомство выделенных малых F 2 червей и несогласованных F 2 червей показали соответствующие фенотипы, предполагая , что они являются наследственные мутанты. Полное наблюдение в таблице 2. В среднем, клоновая экран с 120 гаплоидных геномов приведет к приблизительно 10 F 1 пластин консодержащие червей с явно обнаруживаемых фенотипов, таких как форма тела и локомоции, которые легко обнаружить под стереомикроскопа. Более количественный анализ необходим , чтобы определить скорость именно 4 мутации. Ожидаемое количество видимых мутантов с этого экрана показывает, что напряжение и установка правильно работает для оптогенетика мутагенеза.
Рисунок 1:. Индикатор Setup (A) Вся система. Светодиод был установлен на заказ держателе. Подробности можно найти в списке материалов. (B) Крышка сделана из пластика. Он не охватывает систему полностью, чтобы избежать накопления тепла. (C) Контроллер и функциональный генератор. (D) Задняя сторона системы. (Е) Unseeded пластина с CuCl 2 -soaked фильтровальную бумагу для синего света лечения. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 2: Экспериментальная процедура для клоновых экрана После синего света лечения, P 0 черви передаются на ракетке пластине и позволил откладывать яйца. P 0 черви переносят в новую посеяны пластины 1 г после того, как светолечение и убили 2 D после легкой обработки. F 1 червей выделены из P 0 пластин. Фенотипов F 2 червей рассматриваются после того, как они становятся взрослыми. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
10fig3.jpg "/>
Рисунок 3: Пример Мутанты (А) Оригинальный штамм для оптогенетика мутагенеза:. CZ20310 juSi164 ункции-119 (ed3). Этот штамм имеет нормальную форму тела, поведение и размер выводка. Шкала бар: 0,5 мм. . (B - D) F 2 Потомство показывая тело размер дефекта (B), несогласованные (С) и летальные (D) фенотипы Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Таблица 1: генотипирование juSi164 и КСН-119 (ed3).
Таблица 2: Пример фенотипов фром Клональная экране.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы опишем подробно процедура оптогенетика мутагенеза с использованием His-mSOG выражается в зародышевой линии и представляют собой пример малого масштаба вперед генетического экрана. По сравнению со стандартным химического мутагенеза, этот оптогенетика метод мутагенеза имеет несколько преимуществ. Во-первых, это не токсичен, тем самым сохраняя персонал лаборатории от токсичных химических мутагенов, таких как EMS, Гумилева и trimethylpsoralen ультрафиолетовым светом (TMP / УФ). Во- вторых, экспериментальная процедура мутагенеза может быть использован для небольшого числа P 0 животных и может быть завершен в течение одного часа. В-третьих, оптогенетика мутагенез производит широкий спектр мутаций в том числе нуклеотидных замен и хромосомных делеций. И, наконец, оптогенетика мутагенез может быть использован для интеграции экстрахромосомных трансгенов.
Критическим шагом в этом мутагенеза протокола является обеспечение того, светодиодная установка работает на His-mSOG штаммов, содержащих в эксожидаемому эффективность. Мы рекомендуем провести пилотный клонального экран, как описано в разделе 3 протокола, с около 100 гаплоидных геномов. Мутагенез легко масштабируется от мелкомасштабных пилотных экранов для неклональную экранов путем увеличения числа P 0 для легкой обработки. Для крупномасштабных неклональную экранов, мы предлагаем синхронизации червей икряных молодых людей и передачи их сотни с раствором М9 на тарелку CuCl 2 для легкой обработки. Стандартное состояние описано в шагах 2 и 3, по оценкам, примерно в 4,4 раза меньшую эффективность , чем широко используемый 50 мМ EMS мутагенеза 4. Частота мутаций может быть повышена за счет увеличения светового времени экспозиции и / или увеличения интенсивности света. Тем не менее, эти изменения могут привести к фототоксичности и привести к небольшим размером выводка и болезни легких обработанных червей. Для повышения эффективности, это может быть возможным использовать производные miniSOG с более высоким выходом РОС такогов качестве miniSOG (Q103L) , хотя это может увеличить эффект фона мутагенеза без света лечения 16,17. Для модификации ДНК - конструкции, то Pmex-5-His-72 :: miniSOG-3' - UTR (ТВВ-2) плазмидой (pCZ886) является коммерчески доступным.
В условиях , описанных здесь, интегрированные трансгены генерируются приблизительно одной линии на 200 F 1 в среднем в 4 при использовании внехромосомный трансгенный штамм со скоростью передачи 10 - 30%. Эта эффективность может быть увеличена за счет использования внехромосомные трансгенных линий с высокими скоростями передачи , как сообщалось ранее для способа 18 УФ излучения.
Его-mSOG-опосредованной оптогенетика мутагенез индуцирует мутации в широком диапазоне генов. Кроме того , частота локусов выздоровел от экрана оборотов в минуту-1 - супрессора с использованием оптогенетика мутагенез аналогичны тем , которые с той же экране с помощью EMS 4. Тем не менее, возBLE, что оптогенетика мутагенеза с использованием гена гистона может иметь уклон в сторону определенных генов, из-за неизвестных факторов, таких как структура хроматина. Для решения этой проблемы, необходимо проанализировать много optogenetically индуцированных мутаций от всего генома.
Его-mSOG-опосредованной оптогенетика мутагенез вызывает широкий спектр мутаций в том числе единичных нуклеотидных замен и делеций в пределах от 1 п.о. до нескольких сотен пар оснований 4. Спектр единичных вариантов нуклеотидных предполагает , что miniSOG-индуцированных активных форм кислорода являются причиной мутаций 4. Также возможно , что miniSOG повреждает гистоновых белков и вызывает нестабильность хроматина , поскольку miniSOG используется для инактивации белков, а также 19. Может быть возможно манипулировать тип мутаций с помощью света различной интенсивности. Так как оптогенетика мутагенеза вызывает делеции, важно проанализировать удалений, а также одиночные нуклеотидные изменения в том, ктоле секвенирование генома данных для отображения 20.
Ранее сообщалось , что эпифлуоресцентной микроскоп используется для miniSOG-опосредованной клеточной абляции 21,22. Интенсивность света стандартного эпифлуоресцентной сложного микроскопа было измерено , ~ 0,5 мВт / мм 2 без объектива, которая составляет около 4x ниже , чем используется в стандартном протоколе оптогенетика мутагенеза. Таким образом, весьма желательно, чтобы эмпирически определить эффективность при использовании эпи-флуоресцентного микроскопа в качестве источника света. Одно из преимуществ светодиодов является стабильность в течение тысяч часов. Предыдущие исследования показали , что miniSOG является более мощным в РОС-опосредованного абляции клеток под импульсным светом 22, хотя точный механизм еще предстоит определить. Мы использовали цифровой функциональный генератор / усилитель, чтобы сделать импульсный свет. Другим вариантом является подключение источника света к компьютеру с помощью USB-TTL интерфейс (Рисунок 1А) для регулирования LED LiGHT программой. Система LED , описанный здесь также может быть использована для других целей, таких как оптогенетика контроль возбудимых клеток с использованием channelrhodopsin 23, ячейка абляции с использованием mitochondria- или клеточную мембрану с таргетингом miniSOG 17,22, и хромофора-Assisted Light инактивация (Cali) из белки 19. Кроме того, этот оптогенетика мутагенез имеет потенциал, который будет применен к другим организмам, таким как бактерии, дрожжи, муха, и данио рерио, а также клеточные линии млекопитающих.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ultra High Power LED light source | Prizmatix | UHP-mic-LED-460 | 460 ± 5 nm |
| LED controller | Prizmatix | UHPLCC-01 | |
| Digital function generator/amplifier | PASCO | PI-9587C | PI-9587C is no longer available. The replacement is PI-8127. |
| BNC cable male/male | THORLABS | CA3136 | |
| USB-TTL interface | Prizmatix | Optional | |
| Photometer | THORLABS | PM50 and Model D10MM | |
| Filter paper | Whatman | 1001-110 | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ95 | |
| NGM plate | Dissolve 5 g NaCl, 2.5 g Peptone, 20 g Agar, 10 µg/mL cholesterol in 1 L H2O. After autoclaving, add 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mM KH2PO4(pH 6.0). | ||
| Lysis solution | 10 mM Tris(pH 8.8), 50 mM KCl, 0.1% Triton X-100, 2.5 mM MgCl2, 100 µg/mL Proteinase K |
References
- Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nat Rev Genet. 3 (5), 356-369 (2002).
- Kutscher, L. M., Shaham, S. Forward and reverse mutagenesis in C. elegans. WormBook. , 1-26 (2014).
- Collins, J., Saari, B., Anderson, P. Activation of a transposable element in the germ line but not the soma of Caenorhabditis elegans. Nature. 328 (6132), 726-728 (1987).
- Noma, K., Jin, Y.
- Cooke, M. S., Evans, M. D., Dizdaroglu, M., Lunec, J. Oxidative DNA damage: mechanisms, mutation, and disease. FASEB J. 17 (10), 1195-1214 (2003).
- Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLoS Biol. 9 (4), 1001041 (2011).
- Ruiz-Gonzalez, R., et al. Singlet oxygen generation by the genetically encoded tag miniSOG. J Am Chem Soc. 135 (26), 9564-9567 (2013).
- Pimenta, F. M., Jensen, R. L., Breitenbach, T., Etzerodt, M., Ogilby, P. R. Oxygen-dependent photochemistry and photophysics of "miniSOG," a protein-encased flavin. Photochem Photobiol. 89 (5), 1116-1126 (2013).
- Frokjaer-Jensen, C., et al. Random and targeted transgene insertion in Caenorhabditis elegans using a modified Mos1 transposon. Nat Methods. 11 (5), 529-534 (2014).
- Brenner, S.
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. J Vis Exp. (47), (2011).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. (18), (2008).
- Mello, C., Fire, A.
- Fay, D., Bender, A. Genetic mapping and manipulation: chapter 4--SNPs: introduction and two-point mapping. WormBook. , 1-7 (2006).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
- Westberg, M., Holmegaard, L., Pimenta, F. M., Etzerodt, M., Ogilby, P. R. Rational design of an efficient, genetically encodable, protein-encased singlet oxygen photosensitizer. J Am Chem Soc. 137 (4), 1632-1642 (2015).
- Xu, S., Chisholm, A. D. Highly efficient optogenetic cell ablation in C. elegans using membrane-targeted miniSOG. Sci Rep. 6, 21271 (2016).
- Mariol, M. C., Walter, L., Bellemin, S., Gieseler, K. A rapid protocol for integrating extrachromosomal arrays with high transmission rate into the C. elegans genome. J Vis Exp. (82), (2013).
- Lin, J. Y., et al. Optogenetic inhibition of synaptic release with chromophore-assisted light inactivation (CALI). Neuron. 79 (2), 241-253 (2013).
- Minevich, G., Park, D. S., Blankenberg, D., Poole, R. J., Hobert, O. CloudMap: A Cloud-Based Pipeline for Analysis of Mutant Genome Sequences. Genetics. 192 (>4), 1249-1269 (2012).
- Qi, Y., Xu, S.
- Qi, Y. B., Garren, E. J., Shu, X., Tsien, R. Y., Jin, Y. Photo-inducible cell ablation in Caenorhabditis elegans using the genetically encoded singlet oxygen generating protein miniSOG. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (19), 7499-7504 (2012).
- Nagel, G., et al. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).
