Summary
Genetiskt kodade histon-miniSOG inducerar genomet hela ärftliga mutationer i en blå ljusberoende sätt. Denna mutagenes Metoden är enkel, snabb, fri från giftiga kemikalier, och lämpar sig väl för fram genetisk screening och transgen integration.
Introduction
Framåt genetiska skärmar har använts i stor utsträckning för att generera genetiska mutanter störa olika biologiska processer i modellorganismer såsom Caenorhabditis elegans (C. elegans) 1. Analyser av sådana mutanter att leda till upptäckten av funktionellt viktiga gener och deras signalvägar 1,2. Traditionellt, mutagenes i C. elegans uppnås med hjälp av mutagena kemikalier, strålning eller transposoner 2. Kemikalier såsom etylmetansulfonat (EMS) och N-etyl-N -nitrosourea (ENU) är giftiga för människor; gamma-ray eller ultraviolett (UV) strålning mutagenes kräver speciell utrustning; och transposon-aktiva stammar, såsom mutatorstammar 3, kan orsaka onödiga mutationer vid underhåll. Vi har utvecklat en enkel metod för att orsaka ärftliga mutationer med hjälp av en genetiskt kodad fotosensibiliserare 4.
Reaktiva syreradikaler (ROS) kan skada DNA 5.Mini Singlet Oxygen Generator (miniSOG) är ett grönt fluorescerande protein av 106 aminosyror som var konstruerad från LOV (ljus, syre och spänning) domän av Arabidopsis phototropin 2 6. Vid exponering för blått ljus (~ 450 nm), miniSOG genererar ROS inklusive singlettsyre med fl avin mononukleotiden som en kofaktor 6-8, som är närvarande i alla celler. Vi konstruerade en His-marknadsövervakningsgruppen fusionsprotein genom att märka miniSOG till C-terminalen av histon-72, ett C. elegans variant av Histon 3. Vi genererade en enda kopia transgen 9 att uttrycka His-marknadsövervakningsgruppen i nedärvda C. elegans. Under normala odlingsförhållanden i mörker, de His-marknadsövervakningsgruppen transgena maskarna har normal kull storlek och livslängd 4. Vid exponering för blått LED-ljus, de His-marknadsövervakningsgruppen maskar producera ärftliga mutationer bland deras avkomma 4. Spektrumet av inducerade mutationer inkluderar nukleotid förändringar, såsom G: C till T: A och G: C till C: G, och små chromosomig deletioner 4. Denna mutagenes Proceduren är enkel att utföra och kräver minimal lab säkerhetsinställning. Här beskriver vi den LED-belysning setup och förfaranden för optogenetic mutagenes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Konstruktion av LED-lampan
OBS: Den erforderliga LED utrustning sammanfattas i förteckningen över material. Hela LED installationen är liten och kan placeras var som helst i labbet, men vi rekommenderar det placeras i ett mörkt rum för att styra ljusexponering av maskar 4.
- Anslut LED till en styrenhet med kablar (Figur 1A, D).
- Anslut kontrollenheten till en digital funktionsgenerator / förstärkare med en BNC-kabel (Figur 1A, C, D).
- Fäst LED-ljus 10 cm ovanför scenen med hjälp av en anpassad hållare (Figur 1A).
OBS: Vi gjorde hållare med metalldelar. - Täck LED-belysning inställning delvis, men undvika värmeansamling (Figur 1B), vilket gör maskar sjuk.
OBS: Vi använder en skräddarsydd hårt plasthölje med öppen topp och botten (Figur 1A). Locket är inte krävs för mutagenes själv, men används to begränsa onödig exponering av blått ljus till omgivningen. Vi rekommenderar att inte täcka LED installationen helt (Figur 1B) för att förhindra överhettning maskar. - Bär laserskyddsglasögon.
OBS: Vi bär laserskyddsglasögon eftersom ljuset är mycket ljus. Solglasögon kan fungera lika bra. - Slå spaken på LED-kontroller till "Int." för kontinuerlig belysning (figur 1D) och ställa in den på 65% av den maximala effekten (Figur 1C).
- Använda en fotometer för att mäta den blå ljusintensiteten på det stadium där maskarna placeras med användning av tillverkarens protokoll. Installationen ger 2,0 mW / mm2 under kontinuerlig belysning.
2. Blue ljusbehandling
OBS: Använd stammen CZ20310 juSi164 [Pmex-5-HIS-72 :: miniSOG-3'UTR (TBB-2) + Cb-UNC-119 (+)] UNC-119 (ED3) III 4 Stammen är tillgänglig. på Caenorhabditis Genetics Center (CGC, http: //www.cgc.cbs.umn.edu/).
- Bibehålla His-marknadsövervakningsgruppen stammen i mörkret på standard nematod tillväxtmedium (NGM) plattor med E. coli OP50 efter ett standardprotokoll 10,11.
OBS: Under omgivande ljus, gör juSi164-innehållande stammar inte visa en mutationshastighet över en spontan takt fyra. Rutin stam passage med hjälp av en dissekera omfattning med en halogenlampa i allmänhet inte orsakar mutationer samt. Trots det bör försiktighet iakttas för att undvika onödig exponering för ljus, till exempel, att hålla stammarna i en vanlig mörk inuti inkubator, eller täcker stammar med folie. Det rekommenderas att frysa alikvoter av stammen efter mottagandet i fall onödiga mutationer ackumuleras över tiden. - Plocka gravid unga vuxna (ca 12 h efter L4) djur med en mask plocka 11.
OBS: Yngre djur visar mindre mutagen effekt 4, medan äldre djur kan ha lägre kull storlek. - Skär ett filter paper för att passa en 60 mm platta med en 25 mm x 25 mm fyrkantiga hål och placera på en oympade platta (Figur 1E).
ANMÄRKNING: En fyrkantig stans kan användas, men storleken av stansen behöver inte vara exakt. - Släpp 100 | il av 100 mM CuCl2 på filterpapperet jämnt för att begränsa maskar inom det fyrkantiga hålet på plattan.
- Välj önskat antal gravida unga vuxna hermafroditer (se steg 3 för ett exempel) och överföra till mitten av CuCl2 plattan.
- Bär laserskyddsglasögon.
- Slå på LED och funktionsgeneratorn.
- Slå spaken på LED-kontroller till "Ext." att styra den av funktionsgeneratorn (figur 1D).
- Ställ in controller på 65% av den maximala effekten och funktionsgeneratorn som sinusvåg, 4 Hz (Figur 1C).
- Placera CuCl2 plattan från steg 2,5 utan lock på scenen under LED (Figur 1A </ Strong>).
- Belysa djuren med blått ljus i 30 min.
- Överföra friska letar maskar till en ympad platta som P 0.
OBS: Det önskade antalet P 0 beror på vilken typ av skärm. Se Steg 3 för ett exempel. P 0 maskar kan tyckas vara okoordinerade omedelbart efter ljusbehandlingen och kommer att återhämta tiden. - Håll maskar täckas med folie i en inkubator eller i mörkret; och följ standardförfarandet att börja screening önskade fenotyper bland deras avkomma 2,10.
3. Exempel på en Forward genetisk skärm
OBS:. Detta är ett exempel på den klonala skärmen med 120 haploida genomet för att kontrollera om lysdioden och stam arbetar Figur 2 visar en schematisk av förfarandet.
- [Dag 1] Efter blått ljus behandling, plocka fem friska ser maskar på en NGM platta med OP50 som P 0, hålla dem i en 20 ° C inkubator och låta dem lägga ägg för end (Day1 "platta).
- [Dag 2] Transfer P 0 på en ny seedade plåt (Day2 "platta).
- [Dag3] Plocka och döda P 0 på "Day2" platta genom att bränna dem.
- [Dag4] Pick 30 gravid ung vuxen F 1 från "Day1" plattan och överföra dem till enskilda plattor (30 F 1 plattor för "Dag 1").
- [Day5] Upprepa steg 3,4 för "Day2" platta (30 F 1 plattor för 'Day2).
- [Day7-9] Kontrollera onormala morfologier och / eller beteende F 2 maskar jämfört med WT-stammen (figur 3A) enligt en vanlig stereo när de blir vuxna.
OBS: En ärftliga mutationer visar om en fjärdedel av maskar med samma fenotyp bland F 2 när det är recessiv med hög penetrans. Dock kan vissa mutanter växer långsamt och / eller visa partiell penetrans. Därför är det möjligt att mindre än en fjärdedel av mutanterna kan hittas på entallrik. - Plocka maskar med synliga fenotyper individuellt och kontrollera ärftligheten fenotypen i nästa generation.
4. Exempel på ett extrakromosomalt transgen integration
- Injicerar DNA av intresse i CZ20310 juSi164 [Pmex-5-His-72 :: miniSOG-3'UTR (TBB-2) + Cb-UNC-119 (+)] UNC-119 (ED3) och förbereda transgena maskarna med en låg överföringshastighet (10-30%) efter en standardinjektionsprotokoll 12,13.
OBS: Alternativt kan etablerade extrakromosomala arrayer korsas i juSi164 stammar. För att undvika genotypning för juSi164 kan juSi164 heterozygoter användas som P 0 även om effektiviteten kan minskas. Genotypning metod för juSi164 beskrivs i avsnitt 5. - [Dag 1] Treat ~ 20 transgena djur som P 0 med blått ljus såsom beskrivits i steg 2.
OBS: Mer P 0 maskar är nödvändigt beroende på tr ansmission hastighet. Transgener kan identifieras genom fenotyper eller samsprutning markör 12,13. - Pick 10 friska letar P 0 på individuella plattor, hålla dem i en 20 ° C inkubator och låta dem lägga ägg för ett par dagar (P 0 plattor)
- [Dag4] Single 20 transgen F 1 maskar från varje P 0 plattan på enskilda plattor och låt dem lägga ägg. (20 F 1 x 10 P 0 plattor = 200 F 1 plattor totalt.)
- [Dag7] Hitta F 1 plattor med> 75% F 2 med transgener.
- Välj fem transgena djur från överföringshastigheten> 75% F 1 plattor (F 2 plattor).
- [Day10] Håll F 2 plattor med 100% överföringshastigheten som potentiella integrerade linjer.
- Utparning potentiella integrerade linjer med ett standardförfarande 10 för att kontrollera Mendel segregering och att avlägsna eventuella bakgrundsmutationer.
- Lyse 20 utparade F 2 maskar i lysbuffert med hjälp av ett standardprotokoll 14.
- Utföra PCR med användning av primrar för MosSCI införing 9, juSi164, (tabell 1) med en glödgningstemperatur av 58 ° C efter ett standardprotokoll 14.
OBS: Det är onödigt att genotypa UNC-119 (ED3) eftersom UNC-119 (ED3) kan detekteras genom okoordinerade beteende efter avlägsnande av undsättning transgen (juSi164) i följande steg 5.4 och 5.5. - Köra agarosgelelektrofores 15 och undersöka bandstorlekar (tabell 1) för att hitta det WT för juSi164.
- Undersök om F 2 avkomman har förlamad maskar på grund av förekomsten av UNC-119 (ED3).
- Om okoordinerade maskar finns på steg 5,4, till enskilda flera nonuncoordinated maskar få alla nonuncoordinated maskar i nästa generation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi gjorde en framåt genetisk skärm med CZ20310 juSi164 UNC-119 (ED3) med användning av 30 min ljusexponering efter standardprotokoll som beskrivs i avsnitten 2 och 3. Bland 60 F 1 plattor motsvarande 120 muterade haploida genomet har vi hittat 8 F 1 plattor med F 2 maskar visar synliga fenotyper såsom kroppsstorlek defekt (figur 3B), okoordinerade rörelser (figur 3C), och vuxna dödlighet (Figur 3D). Vi märkte inte någon skillnad i antalet mutanter mellan "Dag 1" och "Day2" plattor. All avkomma av pekas små F 2 maskar och okoordinerade F 2 maskar visade motsvarande fenotyper, vilket tyder på att de är ärftliga mutanter. Den fullständiga observationen sammanfattas i tabell 2. I genomsnitt kommer en klonal skärm med 120 haploida genomet resulterar i cirka 10 F 1-plattor conlande maskar med synligt detekterbara fenotyper såsom kroppsform och förflyttning som lätt upptäckas under ett stereomikroskop. Mer kvantitativ analys är nödvändig för att bestämma mutationshastighet exakt fyra. Det förväntade antalet synliga mutanter från denna skärm tyder på att stammen och installationen fungerar för optogenetic mutagenes.
Figur 1:. LED Setup (A) Hela systemet. Lysdioden monterades på en skräddarsydd hållare. Detaljer finns i förteckningen över material. (B) Locket är gjort av plast. Det täcker inte systemet helt för att undvika värmeansamling. (C) Controller och funktionsgenerator. (D) Den bakre sidan av systemet. (E) En oympade platta med CuCl2 -soaked filterpapper för blått ljus behandling. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:. Försöksförfarande för en klonal Screen Efter blått ljus behandlingen, är P 0 maskar överförs till en ympad platta och fick lägga ägg. P 0 maskar överförs till en ny seedade plattan 1 d efter ljusbehandling och dödade två d efter ljusbehandling. F 1 maskar pekas från P 0 plattorna. Fenotyper av F 2 maskar undersöks när de blir vuxna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
10fig3.jpg "/>
Figur 3: Exempel på mutanter (A) Original stam för optogenetic mutagenes. CZ20310 juSi164 UNC-119 (ED3). Denna stam har normal kroppsform, beteende och grubbla storlek. Skala bar: 0,5 mm. . (B - D) F2 avkomma visar kroppsstorlek defekt (B), okoordinerade (C), och dödliga (D) fenotyper Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1: genotypning av juSi164 och UNC-119 (ED3).
Tabell 2: Exempel på Fenotyper frOm en Klon skärm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskriver vi ett detaljerat förfarande för optogenetic mutagenes med hjälp av His-marknadsövervakningsgruppen uttryckt i könsceller och ge ett exempel på en småskalig framåt genetisk skärm. Jämfört med standard kemisk mutagenes, har denna optogenetic mutagenes metod flera fördelar. För det första är det giftfritt, varigenom laboratoriepersonal från giftiga kemiska mutagener, såsom EMS, ENU och trimetylpsoralen med ultraviolett ljus (TMP / UV). För det andra kan den experimentella proceduren för mutagenes användas för ett litet antal av de P 0 djur och kan vara klar inom en timme. För det tredje ger optogenetic mutagenes ett brett spektrum av mutationer inklusive nukleotidsubstitutioner och kromosom deletioner. Slutligen kan optogenetic mutagenes användas för integrering av extrakromosomala transgener.
Det kritiska steget i denna mutagenes protokoll är att se till att LED installationen fungerar på His-marknadsövervakningsgruppen innehåller stammar på exväntas effektivitet. Vi rekommenderar att utföra en pilot klonal skärm, som beskrivs i protokoll 3 §, med cirka 100 haploida genomet. Mutagenesen är skalbar från småskaliga pilot skärmar till nonclonal skärmar genom att öka antalet P 0 för ljusbehandling. För storskaliga nonclonal skärmar, föreslår vi att synkronisera maskar till gravida unga vuxna och överföra hundratals av dem med M9 lösningen på en CuCl2 platta för ljusbehandling. Standard tillstånd beskrivs i steg 2 och 3 beräknas ha ca 4,4 gånger lägre effektivitet än den allmänt använda 50 mM EMS mutagenes metod 4. Mutationen Hastigheten kan förbättras genom att öka ljusexponeringstiden och / eller öka intensiteten av ljuset. Dock kan dessa ändringar orsakar fototoxicitet och leda till små grubbla storlek och sjukdom ljusbehandlade maskar. För att öka effektiviteten, kan det vara möjligt att använda miniSOG derivat med högre ROS avkastning sådansom miniSOG (Q103L) även om det kan öka bakgrundsmutagenes effekt utan ljusbehandling 16,17. För modifiering av DNA-konstruktionen är Pmex-5-HIS-72 :: miniSOG-3'UTR (TBB-2) plasmid (pCZ886) kommersiellt tillgängliga.
Under de villkor som beskrivs här, är integrerade transgener genereras vid ungefär en rad per 200 F 1 i genomsnitt 4 vid användning av en extrakromosomal transgen stam med en överföringshastighet på 10 till 30%. Denna effektivitet kan ökas genom användning av extrakromosomala transgena stammar med höga överföringshastigheter som tidigare rapporterats för en UV-strålning metod 18.
His-marknadsövervakningsgruppen-medierad optogenetic mutagenes inducerar mutationer i ett stort antal olika gener. Dessutom är frekvensen av loci återhämtat sig från rpm-en suppressor skärmen med optogenetic mutagenes liknar dem från samma skärm med hjälp av EMS 4. Emellertid är det möjble att optogenetic mutagenes med hjälp av en histon gen kan ha en inriktning mot vissa gener, på grund av okända faktorer såsom kromatinstrukturen. För att lösa detta problem, är det nödvändigt att analysera många optogenetically inducerade mutationer av hela genomet sekvensering.
His-marknadsövervakningsgruppen-medierad optogenetic mutagenes orsakar ett brett spektrum av mutationer inklusive enkla nukleotidsubstitutioner och deletioner som sträcker sig från 1 bp till ett fåtal hundra bp 4. Spektrumet av single nucleotide varianter antyder att miniSOG-inducerade reaktiva syrespecies är orsaken av mutationerna 4. Det är också möjligt att miniSOG skador histonproteiner och orsakar kromatin instabilitet eftersom miniSOG används för att inaktivera proteiner såväl 19. Det kan vara möjligt att manipulera typen av mutationer med hjälp av ljus av olika intensitet. Eftersom optogenetic mutagenes orsakar deletioner, är det viktigt att analysera strykningar samt single nucleotide förändringar i vemle genomet sekvensdata för kartläggning 20.
Det har tidigare rapporterats att en epifluorescent mikroskop används för miniSOG-medierad cell ablation 21,22. Ljusintensiteten hos en standard epifluorescent mikroskop uppmättes till ~ 0,5 mW / mm 2 utan lins, vilket är ca 4x lägre än den som används i standarden optogenetic mutagenesprotokoll. Således är det mycket lämpligt att empiriskt bestämma effektiviteten vid användning av ett epi-fluorescensmikroskop som ljuskälla. En fördel med LED är stabiliteten över tusentals timmar. Tidigare studier har visat att miniSOG är mer potent i ROS-medierad cell ablation enligt pulserat ljus 22, även om den exakta mekanismen ännu inte är fastställd. Vi använde en digital funktionsgenerator / förstärkare för att göra pulserande ljus. Ett annat alternativ är att koppla ljuskällan till en dator med en USB-TTL-gränssnitt (Figur 1A) för att reglera LED liGHT av ett program. LED-system som beskrivs här kan också användas för andra ändamål, såsom optogenetic kontroll av exciterbara celler genom att använda channelrhodopsin 23 cell ablation med hjälp mitochondria- eller cellmembran riktade miniSOG 17,22, och kromofor-assisterad lätt inaktivering (CALI) av proteiner 19. Dessutom har denna optogenetic mutagenes potential att kunna tillämpas på andra organismer, såsom bakterier, jäst, fluga och zebrafisk, liksom däggdjurscellinjer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ultra High Power LED light source | Prizmatix | UHP-mic-LED-460 | 460 ± 5 nm |
| LED controller | Prizmatix | UHPLCC-01 | |
| Digital function generator/amplifier | PASCO | PI-9587C | PI-9587C is no longer available. The replacement is PI-8127. |
| BNC cable male/male | THORLABS | CA3136 | |
| USB-TTL interface | Prizmatix | Optional | |
| Photometer | THORLABS | PM50 and Model D10MM | |
| Filter paper | Whatman | 1001-110 | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ95 | |
| NGM plate | Dissolve 5 g NaCl, 2.5 g Peptone, 20 g Agar, 10 µg/mL cholesterol in 1 L H2O. After autoclaving, add 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mM KH2PO4(pH 6.0). | ||
| Lysis solution | 10 mM Tris(pH 8.8), 50 mM KCl, 0.1% Triton X-100, 2.5 mM MgCl2, 100 µg/mL Proteinase K |
References
- Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nat Rev Genet. 3 (5), 356-369 (2002).
- Kutscher, L. M., Shaham, S. Forward and reverse mutagenesis in C. elegans. WormBook. , 1-26 (2014).
- Collins, J., Saari, B., Anderson, P. Activation of a transposable element in the germ line but not the soma of Caenorhabditis elegans. Nature. 328 (6132), 726-728 (1987).
- Noma, K., Jin, Y.
- Cooke, M. S., Evans, M. D., Dizdaroglu, M., Lunec, J. Oxidative DNA damage: mechanisms, mutation, and disease. FASEB J. 17 (10), 1195-1214 (2003).
- Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLoS Biol. 9 (4), 1001041 (2011).
- Ruiz-Gonzalez, R., et al. Singlet oxygen generation by the genetically encoded tag miniSOG. J Am Chem Soc. 135 (26), 9564-9567 (2013).
- Pimenta, F. M., Jensen, R. L., Breitenbach, T., Etzerodt, M., Ogilby, P. R. Oxygen-dependent photochemistry and photophysics of "miniSOG," a protein-encased flavin. Photochem Photobiol. 89 (5), 1116-1126 (2013).
- Frokjaer-Jensen, C., et al. Random and targeted transgene insertion in Caenorhabditis elegans using a modified Mos1 transposon. Nat Methods. 11 (5), 529-534 (2014).
- Brenner, S.
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. J Vis Exp. (47), (2011).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. (18), (2008).
- Mello, C., Fire, A.
- Fay, D., Bender, A. Genetic mapping and manipulation: chapter 4--SNPs: introduction and two-point mapping. WormBook. , 1-7 (2006).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
- Westberg, M., Holmegaard, L., Pimenta, F. M., Etzerodt, M., Ogilby, P. R. Rational design of an efficient, genetically encodable, protein-encased singlet oxygen photosensitizer. J Am Chem Soc. 137 (4), 1632-1642 (2015).
- Xu, S., Chisholm, A. D. Highly efficient optogenetic cell ablation in C. elegans using membrane-targeted miniSOG. Sci Rep. 6, 21271 (2016).
- Mariol, M. C., Walter, L., Bellemin, S., Gieseler, K. A rapid protocol for integrating extrachromosomal arrays with high transmission rate into the C. elegans genome. J Vis Exp. (82), (2013).
- Lin, J. Y., et al. Optogenetic inhibition of synaptic release with chromophore-assisted light inactivation (CALI). Neuron. 79 (2), 241-253 (2013).
- Minevich, G., Park, D. S., Blankenberg, D., Poole, R. J., Hobert, O. CloudMap: A Cloud-Based Pipeline for Analysis of Mutant Genome Sequences. Genetics. 192 (>4), 1249-1269 (2012).
- Qi, Y., Xu, S.
- Qi, Y. B., Garren, E. J., Shu, X., Tsien, R. Y., Jin, Y. Photo-inducible cell ablation in Caenorhabditis elegans using the genetically encoded singlet oxygen generating protein miniSOG. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (19), 7499-7504 (2012).
- Nagel, G., et al. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).
