Summary
codificado genéticamente-histona-miniSOG induce mutaciones hereditarias en todo el genoma de una manera dependiente de la luz azul. Este método de mutagénesis es simple, rápido, libre de productos químicos tóxicos y muy adecuado para la detección genética hacia adelante y la integración del transgén.
Introduction
Pantallas adelante genéticos han sido ampliamente utilizados para generar mutantes genéticos de alteración diversos procesos biológicos en organismos modelo tales como Caenorhabditis elegans (C. elegans) 1. Los análisis de los mutantes de este tipo conducen al descubrimiento de genes funcionalmente importantes y sus vías de señalización 1,2. Tradicionalmente, la mutagénesis en C. elegans se consigue utilizando productos químicos mutagénicos, radiación o transposones 2. Los productos químicos tales como metanosulfonato de etilo (EMS) y N-etil-N -nitrosourea (ESN) son tóxicos para los seres humanos; rayos gamma o ultravioleta (UV) mutagénesis radiación requiere equipo especial; y las cepas de tipo transposón activo, tales como cepas mutantes 3, pueden causar mutaciones innecesarios durante el mantenimiento. Hemos desarrollado un método simple para inducir mutaciones hereditarias utilizando un fotosensibilizador codificado genéticamente-4.
Especies reactivas del oxígeno (ROS) pueden dañar el ADN 5.El generador de mini oxígeno singlete (miniSOG) es una proteína verde fluorescente de 106 aminoácidos que fue diseñado a partir de la lista de valores (luz, oxígeno, y voltaje) de dominio de Arabidopsis phototropin 2 6. Tras la exposición a la luz azul (~ 450 nm), miniSOG genera ROS incluyendo oxígeno singlete con fl avin mononucleótido como cofactor 6-8, que está presente en todas las células. Hemos construido una proteína de fusión His-MSOG mediante el etiquetado de miniSOG a la C-terminal de la histona-72, un C. elegans variante de la histona 3. Hemos generado un transgén de una sola copia 9 para expresar Su-MSOG en la línea germinal de C. elegans. En condiciones normales de cultivo en la oscuridad, los gusanos transgénicos Su-MSOG tiene la cría de tamaño normal y duración de la vida 4. Tras la exposición a la luz LED azul, los gusanos Su-MSOG producen mutaciones hereditarias entre su progenie 4. El espectro de mutaciones inducidas incluye cambios de nucleótidos, tales como G: C a T: A y G: C a C: G, y los pequeños chromosoMe supresiones 4. Este procedimiento de mutagénesis es fácil de realizar y requiere una configuración mínima seguridad en el laboratorio. A continuación, se describe la configuración de la iluminación LED y procedimientos para la mutagénesis optogenético.
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Protocol
1. Construcción de la luz de aviso
NOTA: El equipo requerido LED se resume en la Lista de Materiales. Toda la configuración del LED es pequeña y se puede colocar en cualquier lugar en el laboratorio, aunque se recomienda que se coloca en un cuarto oscuro para el control de exposición a la luz de los gusanos 4.
- Conectar el LED a un controlador con cables (Figura 1 A, D).
- Conectar el controlador a una función de generador / amplificador digital con un cable BNC (Figura 1 A, C, D).
- Fijar los LED de luz de 10 cm por encima del escenario utilizando un soporte personalizado (Figura 1A).
NOTA: Se realizó el soporte con piezas metálicas. - Cubrir la configuración de la iluminación LED en parte, pero evitar la acumulación de calor (Figura 1B), lo que hace que los gusanos enfermos.
NOTA: Nosotros usamos una cubierta de plástico duro de la medida con la parte superior abierta e inferior (Figura 1A). La cubierta no se requiere para la propia mutagénesis, pero se utiliza to limitar la exposición innecesaria de la luz azul para el entorno. Aconsejamos de no cubrir totalmente la configuración de LED (Figura 1B) para evitar el sobrecalentamiento de los gusanos. - Use gafas de protección láser.
NOTA: Use gafas de protección láser, porque la luz es muy brillante. Gafas de sol pueden funcionar tan bien. - Cambiar la palanca del regulador del LED para 'Int.' para la iluminación continua (Figura 1D) y programar a 65% de la potencia máxima (Figura 1C).
- Utilice un fotómetro para medir la intensidad de la luz azul en la etapa en la que los gusanos se colocan usando el protocolo del fabricante. La configuración da 2,0 mW / mm2 bajo iluminación continua.
2. El tratamiento de luz azul
NOTA: Utilice la cepa CZ20310 juSi164 [pMex-5-SU-72 :: miniSOG-3'UTR (TBB-2) + Cb-UNC-119 (+)] UNC-119 (ed3) III 4 La cepa está disponible. en el Centro de Genética Caenorhabditis (CGC, http: //www.cgc.cbs.umn.edu/).
- Mantener la cepa Su-MSOG en la oscuridad en medio de crecimiento de nematodos estándar (NGM) placas con E. OP50 coli siguiendo un protocolo estándar de 10,11.
NOTA: Bajo la luz ambiente, juSi164 cepas -Con no muestran una tasa de mutación espontánea por encima de una tasa de 4. paso cepa de rutina usando un microscopio de disección con una lámpara halógena generalmente no causa mutaciones también. No obstante, se debe tener cuidado para evitar la exposición innecesaria a la luz, por ejemplo, manteniendo las cepas en una incubadora oscura en el interior estándar, o cubriendo las cepas con papel de aluminio. Se aconseja congelar alícuotas de la cepa después de recibirlo en caso de que las mutaciones se acumulan con el tiempo innecesarias. - Escoja grávidas adultos jóvenes (12 h post-L4) a unos animales con un gusano recogen 11.
NOTA: Los animales más jóvenes muestran un menor efecto mutagénico 4, mientras que los animales más viejos pueden tener menor tamaño de la camada. - Corte un filtro de paper para adaptarse a una placa de 60 mm con un 25 mm x 25 mm agujero cuadrado y colocarlo sobre una placa de cabeza de serie (Figura 1E).
NOTA: Un punzón cuadrado puede ser utilizado, pero el tamaño del punzón no tiene que ser preciso. - Caída de 100 l de 100 mM CuCl 2 en el papel de filtro de manera uniforme para restringir gusanos dentro del orificio cuadrado en el plato.
- Anotar número deseado de grávidas hermafroditas adultos jóvenes (ver paso 3 para un ejemplo) y traslado al centro de la placa CuCl2.
- Utilice gafas de protección láser.
- Interruptor en el LED y el generador de funciones.
- Cambiar la palanca del regulador del LED para Ext. ' para controlar por el generador de funciones (Figura 1D).
- Ajuste el controlador en el 65% de la potencia máxima y el generador de funciones como onda sinusoidal, 4 Hz (Figura 1C).
- Coloque la placa de CuCl 2 de la Etapa 2.5 sin tapa en el escenario bajo el LED (Figura 1A </ Strong>).
- Iluminar los animales con la luz azul durante 30 minutos.
- Transferir los gusanos de aspecto saludable a una placa sembrada como P 0.
NOTA: El número deseado de P 0 depende del tipo de pantalla. Consulte el paso 3 para un ejemplo. Los P 0 gusanos pueden parecer no coordinado inmediatamente después del tratamiento y la luz se recuperarán con el tiempo. - Mantenga gusanos cubiertos usar papel aluminio en una incubadora o en la oscuridad; y seguir el procedimiento estándar para el tamizaje de fenotipos deseados entre su progenie 2,10.
3. Ejemplo de una pantalla adelante genéticos
NOTA:. Este es un ejemplo de la pantalla clonal con 120 genomas haploides para comprobar si el LED y la tensión están trabajando Figura 2 muestra un esquema del procedimiento.
- [Día 1] Después de tratamiento con luz azul, recoger cinco gusanos de aspecto saludable en una placa de NGM con OP50 como P 0, mantenerlos en un 20 ° C incubadora, y dejar que ellos ponen sus huevos durante 1d (placa 'día 1').
- [Día 2] Transferencia de P0 a una nueva placa de cabeza de serie (placa 'Día 2').
- [Día 3] Escoja y matar P 0 en la placa del 'Día 2' quemándolas.
- [Día 4] Recoger 30 grávido adulto joven F 1 de la placa del 'día 1' y transferirlos en placas individuales (30 F 1 Placas para 'Día 1').
- [Día 5] Repita el paso 3.4 para la placa de 'Día 2' (30 F 1 Placas para 'Día 2').
- [Day7-9] Comprobar las morfologías y / o el comportamiento de F 2 gusanos en comparación con la cepa WT (Figura 3A) anormales bajo un microscopio estereoscópico estándar cuando se convierten en adultos.
NOTA: una mutación hereditaria muestras sobre una cuarta parte de los gusanos con el mismo fenotipo entre F2 cuando es recesiva con alta penetrancia. Sin embargo, algunos mutantes pueden crecer lentamente y / o mostrar penetrancia parcial. Por lo tanto, es posible que menos de un cuarto de los mutantes se puede encontrar en unaplato. - Recoger los gusanos con fenotipos visibles individualmente y comprobar la heredabilidad del fenotipo en la generación siguiente.
4. Ejemplo de integración del transgén Extracromosómica
- Inyectar el ADN de interés en CZ20310 juSi164 [pMex-5-his-72 :: miniSOG-3'UTR (TBB-2) + Cb-UNC-119 (+)] unc-119 (ed3) y preparar los gusanos transgénicos con una baja tasa de transmisión (10-30%) después de un 12,13 protocolo de inyección estándar.
NOTA: Como alternativa, extracromosómicos arrays establecidos pueden ser cruzadas en las cepas juSi164. Para evitar el genotipado para juSi164, heterocigotos juSi164 se pueden usar como el P 0 aunque la eficiencia puede ser disminuida. El método de genotipificación para juSi164 se describe en la Sección 5. - [Día 1] Tratar ~ 20 animales transgénicos como P 0 con luz azul, como se describe en el paso 2.
NOTA: Más P 0 gusanos son necesarias en función de la tr tasa ansmission. Los transgenes pueden ser identificados por fenotipos o 12,13 marcador coinyección. - Recoger 10 P aspecto saludable 0 en placas individuales, mantenerlos en un 20 ° C incubadora, y dejar que ellos ponen sus huevos durante unos días (P) 0 placas
- [Día 4] singularizar 20 transgénico F1 gusanos de cada placa P 0 en placas individuales y dejar que ellos ponen huevos. (20 F 1 x 10 P = 0 placas 200 F 1 placas en total).
- [Día 7] Encuentra F1 placas con> 75% de F 2 que tienen transgenes.
- Escoja cinco animales transgénicos de la velocidad de transmisión de> 75% de F 1 F 2 placas (placas).
- [Día 10] Mantener F 2 placas con velocidad de transmisión de 100% como líneas integradas potenciales.
- Outcross las posibles líneas integradas, utilizando un procedimiento estándar 10 para comprobar la segregación mendeliana y para eliminar posibles mutaciones de fondo.
- Lyse 20 outcrossed F 2 gusanos en tampón de lisis utilizando un protocolo estándar 14.
- Realizar PCR usando los cebadores para la inserción MosSCI 9, juSi164, (Tabla 1) con una temperatura de hibridación de 58 ° C siguiendo un protocolo estándar 14.
NOTA: No es necesario determinar el genotipo de UNC-119 (ed3) debido a UNC-119 (ed3) puede ser detectado por conducta no coordinada después de retirar el transgén rescate (juSi164) en los siguientes pasos 5.4 y 5.5. - Ejecutar electroforesis en gel de agarosa 15 y examinar los tamaños de las bandas (Tabla 1) para encontrar el tiempo de acceso a juSi164.
- Examinar si la progenie F 2 ha paralizado gusanos debido a la existencia de UNC-119 (ed3).
- Si se encuentran los gusanos no coordinados en el paso 5.4, solo varios gusanos nonuncoordinated para obtener todos los gusanos nonuncoordinated en la próxima generación.
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Representative Results
Se realizó un rastreo genético adelante con CZ20310 juSi164 UNC-119 (ed3) mediante exposición a la luz 30 min siguiendo el protocolo estándar descrito en las secciones 2 y 3. Entre 60 placas F 1 que corresponden a 120 genomas haploides mutagenizados, encontramos 8 F 1 con placas F 2 gusanos que exhiben fenotipos visibles como defecto el tamaño del cuerpo (Figura 3B), el movimiento no coordinado (Figura 3C), y la letalidad de adultos (Figura 3D). No notamos ninguna diferencia en el número de mutantes entre 'día 1' 'y las placas Day2'. Toda la progenie de singularizados pequeñas F 2 gusanos y no coordinadas F 2 gusanos mostró los fenotipos correspondientes, lo que sugiere que los mutantes son heredables. La observación completa se resume en la Tabla 2. En promedio, una pantalla clonal con 120 genomas haploides dará lugar a aproximadamente 10 F 1 con placascontienen gusanos con fenotipos visiblemente detectables, tales como la forma del cuerpo y la locomoción que capta fácilmente bajo un microscopio estereoscópico. Más análisis cuantitativo es necesario determinar la tasa de mutación, precisamente, 4. El número esperado de mutantes visibles desde esta pantalla sugiere que la cepa y la configuración están funcionando correctamente para la mutagénesis optogenético.
Figura 1:. La Configuración de LED (A) Todo el sistema. El LED se montó sobre un soporte hecho a medida. Los detalles se encuentran en la Lista de Materiales. (B) La cubierta está hecha de plástico. No cubre por completo el sistema para evitar la acumulación de calor. Controlador y la función del generador (C). (D) El lado posterior del sistema. (E) Una placa no sembrada con CuCl2 papel de filtro para el tratamiento -soaked luz azul. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2:. Procedimiento experimental para una pantalla clonal Después de tratamiento con luz azul, P 0 gusanos se transfieren a una placa sin semillas y permitió a poner huevos. P 0 gusanos son transferidos a una nueva placa de cabeza de serie 1 d después del tratamiento con luz y mataron a 2 días después de tratamiento con luz. F 1 gusanos se escogieron de las placas P 0. Fenotipos de F 2 gusanos se examinan después de que se conviertan en adultos. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 3: Ejemplo de Mutantes (A) cepa original para la mutagénesis optogenético:. CZ20310 juSi164 UNC-119 (ed3). Esta cepa tiene forma normal del cuerpo, comportamiento y tamaño de la camada. Barra de escala: 0,5 mm. . (B - D) F 2 progenie defecto que muestra el tamaño del cuerpo (B), falta de coordinación (C) y (D) fenotipos letales Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: Genotipado de juSi164 y UNC-119 (ed3).
Tabla 2: Ejemplo de fenotipos from una pantalla clonal.
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Discussion
A continuación, describimos un procedimiento detallado de mutagénesis usando optogenético Su-MSOG expresa en la línea germinal y proporcionar un ejemplo de una pantalla genética hacia delante pequeña escala. En comparación con mutagénesis química estándar, este método de mutagénesis optogenético tiene varias ventajas. En primer lugar, es no tóxico, manteniendo de esta manera el personal de laboratorio fuera de mutágenos químicos tóxicos como el EMS, ENU y trimetilpsoraleno con luz ultravioleta (TMP / UV). En segundo lugar, el procedimiento experimental de la mutagénesis se puede utilizar para un pequeño número de los P 0 animales y se puede acabar en una hora. En tercer lugar, la mutagénesis optogenético produce un amplio espectro de mutaciones incluyendo sustituciones de nucleótidos y deleciones cromosómicas. Finalmente, la mutagénesis optogenético se puede utilizar para la integración de transgenes extracromosómicos.
El paso crítico en este protocolo de mutagénesis es asegurarse de que la configuración del LED trabaja en su MSOG-cepas que contienen al exeficiencia esperadas. Se recomienda realizar una pantalla clonal piloto, tal como se describe en la Sección 3 del Protocolo, con cerca de 100 genomas haploides. La mutagénesis es fácilmente escalable de las pequeñas pantallas de piloto a gran escala a las pantallas no clonales mediante el aumento de la cantidad de P 0 para el tratamiento de la luz. Para las pantallas nonclonal a gran escala, se sugiere la sincronización de los gusanos a los adultos jóvenes grávidas y transferir cientos de ellos con solución M9 sobre una placa de CuCl2 para el tratamiento de la luz. La condición estándar descrito en los pasos 2 y 3 se estima que la eficiencia de aproximadamente 4,4 veces menor que el método de mutagénesis ccsme 50 mM ampliamente usado 4. La tasa de mutación puede mejorarse aumentando el tiempo de exposición a la luz y / o el aumento de la intensidad de la luz. Sin embargo, estas modificaciones pueden causar fototoxicidad y conducir a la cría de tamaño pequeño y la enfermedad de los gusanos de luz tratada. Para aumentar la eficiencia, puede ser posible utilizar derivados miniSOG con mayor rendimiento ROS talescomo miniSOG (Q103L) aunque puede aumentar el efecto de fondo mutagénesis y sin tratamiento con luz 16,17. Para la modificación de la construcción de ADN, la (TBB-2) plásmido pMex-5-HIS-72 :: miniSOG-3'UTR (pCZ886) está disponible comercialmente.
En las condiciones descritas aquí, los transgenes integrados se generan aproximadamente a una línea por cada 200 F 1 en promedio 4 cuando se utiliza una cepa transgénica extracromosómico con una velocidad de transmisión de 10 a 30%. Esta eficiencia se puede aumentar mediante el uso de cepas transgénicas extracromosómicos con altas tasas de transmisión como se informó anteriormente para un método de radiación UV 18.
Su mediada por mutagénesis MSOG optogenético induce mutaciones en una amplia gama de genes. Además, la frecuencia de loci recuperado de la pantalla supresor de rpm-1 usando mutagénesis optogenético es similar a los de la misma pantalla usando EMS 4. Sin embargo, es posible que la mutagénesis optogenético usando un gen de histona puede tener un sesgo hacia ciertos genes, debido a factores desconocidos tales como la estructura de la cromatina. Para hacer frente a este problema, es necesario analizar muchas mutaciones inducidas por optogenetically secuenciación del genoma completo.
Su mediada por mutagénesis MSOG optogenético provoca un amplio espectro de mutaciones incluyendo sustituciones de nucleótidos individuales y supresiones van de 1 pb a unos pocos cientos de pares de bases 4. El espectro de variantes de nucleótido único sugiere que las especies reactivas de oxígeno inducidas por miniSOG son la causa de las mutaciones 4. También es posible que miniSOG daños histona proteínas y provoca la inestabilidad de la cromatina porque miniSOG se utiliza para inactivar las proteínas, así 19. Puede ser posible manipular el tipo de mutaciones mediante el uso de luz de diferentes intensidades. Desde mutagénesis optogenético causa deleciones, es importante analizar deleciones así como los cambios de nucleótido único en quearchivo de datos de secuenciación del genoma para el mapeo 20.
Se informó previamente que un microscopio de epifluorescencia se utiliza para la ablación de células mediada por miniSOG 21,22. La intensidad de la luz de un microscopio de epifluorescencia estándar compuesto se midió para ser ~ 0,5 mW / mm 2 sin una lente, que es aproximadamente 4 veces menor que la usada en el protocolo de mutagénesis optogenético estándar. Por lo tanto, es altamente recomendable para determinar empíricamente la eficacia cuando se utiliza un microscopio de epi-fluorescencia como fuente de luz. Una de las ventajas de los LED es la estabilidad durante miles de horas. Estudios anteriores han demostrado que miniSOG es más potente en la ablación de células mediada por ROS bajo luz pulsada 22, aunque el mecanismo exacto que queda por determinar. Se utilizó una función de generador / amplificador digital para hacer luz pulsada. Otra opción es conectar la fuente de luz a un ordenador mediante una interfaz USB-TTL (Figura 1A) para regular la li LEDGHT por un programa. El sistema LED se describe aquí también se puede utilizar para otros fines, tales como el control optogenético de células excitables utilizando canalrodopsina 23, la ablación de células usando mitochondria- o miniSOG 17,22 dirigido por células de membrana, y cromóforo asistida Light Inactivación (Cali) de 19 proteínas. Además, esta mutagénesis optogenético tiene el potencial de ser aplicado a otros organismos, tales como bacterias, levaduras, volar, y pez cebra, así como líneas celulares de mamífero.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ultra High Power LED light source | Prizmatix | UHP-mic-LED-460 | 460 ± 5 nm |
| LED controller | Prizmatix | UHPLCC-01 | |
| Digital function generator/amplifier | PASCO | PI-9587C | PI-9587C is no longer available. The replacement is PI-8127. |
| BNC cable male/male | THORLABS | CA3136 | |
| USB-TTL interface | Prizmatix | Optional | |
| Photometer | THORLABS | PM50 and Model D10MM | |
| Filter paper | Whatman | 1001-110 | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ95 | |
| NGM plate | Dissolve 5 g NaCl, 2.5 g Peptone, 20 g Agar, 10 µg/mL cholesterol in 1 L H2O. After autoclaving, add 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mM KH2PO4(pH 6.0). | ||
| Lysis solution | 10 mM Tris(pH 8.8), 50 mM KCl, 0.1% Triton X-100, 2.5 mM MgCl2, 100 µg/mL Proteinase K |
References
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