Vi beskriver her en fremgangsmåte for å oppnå og å identifisere en nylig karakterisert subpopulasjon av nøytrofil-avledet gigantiske fagocytter. Disse cellene utvikle seg i kultur fra friske humane blod nøytrofile, og er preget av fagocytose, autofagi, umåtelig stor størrelse, og forlenget levetid. Denne fremgangsmåten er viktig for å ytterligere undersøke denne unike nøytrofil-avledet subpopulasjon.
Nøytrofile celler (PMN) er best kjent for sine fagocyterende funksjoner mot invaderende patogener og mikroorganismer. De har den korteste halveringstid blant leukocytter og i sin ikke-aktiverte tilstand, blir konstitutivt forpliktet til apoptose. Når rekruttert til inflammatoriske nettsider for å løse betennelse, produserer de en rekke cytotoksiske molekyler med potente antimikrobiell drap. Likevel, når disse kraftige cytotoksiske molekyler er utgitt på en ukontrollert måte de kan skade omkringliggende vev. I de senere årene har imidlertid er nøytrofile allsidighet stadig dokumentert, ved å demonstrere plastisitet og immunfunksjoner. Vi har nylig identifisert en ny nøytrofil-avledet undergruppe, som utvikler spontant i standard kulturbetingelser uten tilsetning av cytokiner / vekstfaktorer så som granulocytt-kolonistimulerende faktor (GM-CSF) / interleukin (IL) -4. Deres fagocytterende evner av nøytrofile rester i stor grad bidra til å øke sinestørrelse umåtelig; derfor ble de betegnet gigantiske fagocytter (Gφ). I motsetning til nøytrofile er Gφ lenge levd i kulturen. De uttrykker klyngen av differensiering (CD) nøytrofile markører CD66b / CD63 / CD15 / CD11b / myeloperoksidase (MPO) / nøytrofil elastase (NE), og er blottet for monocytic avstamning markørene CD14 / CD16 / CD163 og dendrittiske CD1c / CD141 markører . De tar også opp latex og zymosan og svare ved oksidativ burst til stimulering med opsonisert-zymosan og PMA. Gφ uttrykker også åtseldyr reseptorer CD68 / CD36, og i motsetning til nøytrofile, internal oksidert-low density lipoprotein (oxLDL). Videre, i motsetning til friske nøytrofile, eller kultur monocytter, de svare på oxLDL opptak av økte reaktive oksygenforbindelser (ROS) produksjon. I tillegg er disse fagocytter inneholder mikrotubulus-assosiert protein-en lettkjede 3B (LC3B) belagt vakuoler, som indikerer aktivering av autophagy. Ved hjelp av spesifikke hemmere er det klart at både fagocytose og autofagi er prerequisites for deres utvikling og sannsynlig NADPH oksidase avhengig ROS. Vi beskriver her en metode for utarbeidelse av denne nye undergruppe lang levetid, nøytrofil-avledet phagocytic celler i kultur, deres identifisering og deres kjente egenskaper. Denne protokollen er vesentlig for å oppnå og karakterisere Gφ for videre å undersøke deres betydning og funksjoner.
Polymorfonukleære nøytrofiler (PMN) utgjør den største bestanden av leukocytter i blodet, fungerer som den første linjen i forsvaret mot invaderende patogener ved å produsere et bredt spekter av cytotoksiske molekyler. Det tradisjonelle synet har lenge vært at av sirkulerende blod, kortvarig, profesjonelle fagocytter, som er de første som kommer til akutte inflammatoriske nettsider for å bekjempe infeksjoner og hjelpemiddel i clearance av patogener og skadelige partikler. 1 I sin ikke-aktivert tilstand, nøytrofile er konstitutivt forpliktet til apoptose. Når du overfører fra blodet til inflammatoriske seter, nøytrofile gjennomgå aktivering for å løse betennelse. De fagocyttere og drepe invaderende mikroorganismer, ved å frembringe en matrise av cytotoksiske molekyler som reaktive oksygenarter (ROS), lytiske enzymer så som nøytrofil elastase (NE) og katepsiner med potent cidisk aktivitet. For å felle patogener, nøytrofile også slipper ekstracellulære feller (NET) Som består av kjernefysisk kromatin tråder som inneholder antibakterielle peptider og diverse lytiske enzymer. Imidlertid kan ukontrollert utslipp av disse cytotoksiske molekylene fra nøytrofile også hevde betennelsesreaksjoner og indusere skader på omkringliggende vev. 2 er derfor en effektiv klarering av apoptotiske nøytrofiler av makrofager (Mii) og dendrittiske celler (DC) avgjørende for å løse betennelse. 3, 4, 5, 6
I de senere årene har det imidlertid blitt stadig tydeligere at nøytrofile er allsidige celler, hvis funksjoner går langt utover fagocytose og patogen drap. 6, 7 Ved gjennomgår priming eller aktivering, er nøytrofile plastisitet gradvis økende oppmerksomhet. For eksempel, bakterier og mykobakterier utfordret nøytrofile ble vist tilutsondre interleukin (IL) -10 og kontrollere den inflammatoriske respons, noe som tyder på tilstedeværelsen av immunregulerende tiltak. 8 Post-mitotiske nøytrofile ble vist til trans-differensiere i Mii-lignende celler, eller DC-lignende celler ved bearbeider og presenterer antigen fragmenter når de ble behandlet med cytokiner og vekstfaktorer, 9, 10 således som serverer en avgjørende rolle i å integrere medfødte og adaptive responser. 3, 6 Aktivering av vekstfaktor markedsført engulfment av apoptotiske nøytrofile celler eller celleavfall, og derved tilrettelegge for klaring av rusk i inflammatoriske seter og oppløsningen av betennelse, 3, 9 spesielt når Mii / DC klaring system er utilstrekkelig eller overveldet, 11, 12 foreslå potensielle "selvregulering" for å bidra til å reløse den inflammatoriske respons. Dette, siden apoptose er en form for regulert selv-død som kan inhibere den ekstracellulære frigjøring av cytotoksiske forbindelser og således hindre skade på omgivende vev. 6
Forlenget overlevelse er en annen funksjon i nøytrofil aktivering og ble demonstrert ved behandling med forskjellige verts avledede faktorer, slik som granulocytt-kolonistimulerende faktor (G-CSF), granulocytt-makrofag-kolonistimulerende faktor (GM-CSF), inflammatoriske cytokiner så som interferon ( IFN) -γ, tumor nekrose faktor (TNF) -a og / eller patogene avledede produkter, og dermed, slik at neutrofiler for å modulere deres overlevelse respons. 6 Faktisk er neutrofil overlevelse en forutsetning for sin plastisitet og er knyttet til evnen til å utføre fagocytose. 6, 13 Følgelig ble det også vist å assosiere med fenotypiske og funksjonelle forandringer som DEPENded på oppregulert genuttrykk ved å indusere syntese av nye proteiner som er involvert i nøytrofile levetid forlengelse, og redusert apoptose. 10
I motsetning til nøytrofile som er kortvarig og konstitutivt gjennomgår apoptose i kultur, eller cytokiner / vekstfaktorer-aktiverte nøytrofiler, beskrevet ovenfor, som har utvidet levetid, har vi nylig identifisert en ny, liten undergruppe av nøytrofile som utvikler spontant i langvarig standard kultur forhold fra nylig isolerte humane blod nøytrofiler uten ekstern tilsetning av cytokiner eller vekstfaktorer. 14 Disse nøytrofil-avledede celler som ikke var beskrevet før i litteraturen, ble kalt gigantiske fagocytter (Gφ). Den Gφ har utvidet levetid i kultur, de er fullt utviklet i løpet av 5-7 dager, og er preget av unike morfologiske egenskaper, fenotypiske uttrykk og funksjoner. De er vesentlig utvidet grunnet autophagocytosis av døde nøytrofile rester, vacuolated, og inneholder phagolysosomes. Den Gφ uttrykke spesifikke nøytrofile granulater markør – klynge av differensiering (CD) 66b, de azurofile granulater markører – CD63 og myeloperoxidase (MPO) og ytterligere nøytrofile markører som CD11b, NE, CD15, de NADPH oksidase subenheter gp91- phox og p22- phox, og autofagi markør -LC3BII. 14, 15 Funksjonelt er de aktivt opprullingslatekskuler og zymosan partikler, og generere ROS som reaksjon på zymosan og forbol-12-myristat 13-acetat (PMA) stimulering. Interessant, i motsetning til friske nøytrofile, Gφ også intensivt uttrykker scavenger reseptorer CD68 og CD36, ta opp oksidert low density lipoprotein (oxLDL), og genererer ROS som respons på stimulering med oxLDL. I tillegg Gφ er blottet for monocyttiske avstamning markørene CD14, CD16 og CD163 eller dendrittiske markører CD1c og CD141. Videre phagocytosis og autofagi og sannsynligvis funksjonell NADPH oksidase er en forutsetning for deres utvikling. Denne siden, fagocytose-inhibitor cytochalsin B, den autofagi hemmere 3-metyladenin (3-MA) og bafilomycin (BafA1) og NADPH oksidase inhibitor – difenylen -jod (DPI) – hindret deres utvikling. I tillegg monocytter / nøytrofile co-kulturer samt eksponering for periodisk hypoksi hemmet deres utvikling, mens nøytrofile tilpasning til vedvarende hypoksi var tydelig. 14,15 Deres foreslått utvikling i kultur er vist i figur 1 sikret protokoll i det foreliggende papir beskrives trinn for trinn ved fremstillingen av Gφ fra nylig isolerte humane blod sirkulerende neutrofiler, deres utvikling, identifikasjon og noen grunnleggende egenskaper. Denne protokollen kan brukes til å undersøke og avsløre det brede spekteret og rollene til disse nylig beskrevet og spennende nøytrofile-avledet Gφ for å characterize deres betydning og deres potensielle funksjoner.
Figur 1: Skjematisk fremstilling av Giant celler utvikling i 7 Day nøytrofile kulturer. Det er foreslått at inflammasjons (1) nøytrofile gjennomgå apoptotisk celledød, og (2) slipper membran omkranset fragmenter som inneholder kjernefysisk avfall, granulater (grønne og røde prikker) og andre subcellulære bestanddeler som utløser autofagi mekanismer. (3) Giant fagocytter (Gφ) utvikle langsiktige nøytrofile kulturer blottet for cytokiner eller vekstfaktorer ved å internal apoptotiske legemer og nøytrofile rusk, og samtidig opprettholde funksjonell NADPH oxidase.They er preget av ulike nøytrofil CD66b + / CD63 + / MPO + / CD15 + / CD11b + / NE markører, store phagosomes omsluttende granulater og cellerester, og scavenger reseptorer CD36 og CD68. Gb1; er for det meste mononukleærerte celler, i stand til å internal også ulike partikler og oksidert LDL og generere ROS. Membranene av vakuoler fylle Gφ inneholde LC3B (markert med mørk blå), en markør for autophagosomal membran, noe som tyder på en streng sammenheng mellom autofagi og gigantiske phagocyte formasjon. Gφ utvikler ikke i medium inneholdende GM-CSF / IL-4. Også hemmere som NADPH oksidase inhibitor – difenylen -jod (DPI), de autofagi hemmere 3-metyladenin (3-MA) og bafilomycin (BafA1) og fagocytose inhibitor cytokalasin B (. Cyto B) avskaffe deres dannelse. (4) Potensielle Gφ funksjoner i vivo kan inkludere anti eller pro-inflammatoriske egenskaper og deltakelse i aterosklerotiske prosesser (dette tallet er basert på våre funn 14, 15 og ble endret fra den medfølgende Redaksjonell av BErton 20). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Giant fagocytter (Gφ) er en nylig definert undergruppe av nøytrofile-deriverte celler som uttrykker grunnleggende og spesifikke nøytrofile markører som CD66b / CD15 / CD63 / MPO / NE. Denne type av nøytrofil-avledet phagocyte ble ikke beskrevet i litteraturen tidligere. I motsetning til nøytrofile som er kortvarig og gjennomgår apoptose, Gφ er Annexin-V-negative og vise utvidet levetid. Likevel, som nøytrofiler, Gφ også internalisere partiklene og produserer NADPH oksidase-avhengig ROS som reaksjon på de partikler og til PMA. Men deres evner til å internal OxLDL og dermed å produsere ROS er unike funksjonene til Gφ. 14
En rekke faktorer ble vist å påvirke deres utvikling i kultur. Mangelen på eksterne cytokiner eller vekstfaktorer i vekstmediet er vesentlig (spesielt GM-CSF / IL-4). Men nøytrofile migrasjon mot IL-8 viste en diskriminerende faktor mellom de som devrømte inn Gφ og de som ikke gjorde det. Også, internalisering av avfall som følge av apoptotiske nøytrofiler, ekspresjon av autophagy proteiner (LC3B) og funksjonell NADPH oksidase, ble alle vist seg å være avgjørende for deres utvikling, ettersom deres hemming forhindres Gφ dannelse (figur 1). Tilsynelatende utviklingen av disse kjempeceller som kommer fra neutrofiler er forskjellig fra det som karakteriserer kjempecelledannelse i monocytt / makrofagen avstamning. De sistnevnte danner flerkjernedannelse kjempeceller i forbindelse med forskjellige kroniske inflammatoriske sykdommer, 20, 21, mens den nøytrofil Gφ beskrevet her utvikler seg via autophagocytosis, ved engulfing cellerester og forbli hovedsakelig mono-kjernedannet gjennom hele deres utvikling, 14 (sjelden imidlertid noen ganger en annen kjerne kan observeres). Videre er en rekke kontroller etablert sin nøytrofil opprinnelse: (1) EXPREssion av de konkrete neutropilic markører og fravær av dendrittiske og monocytic avstamning markører, (2) deres hemmet utvikling i monocytter / PMN co-kulturer, (3) deres ulike bevegelsesmønstre i kultur fra makrofager (som dokumentert av levende celle bildebehandling og tid -lapse mikroskopi), 14 (4) sitt lys tilslutning til plast retter og (5) sin utvikling fra ren CD15 + / CD14 – PMN ervervet ved flowcytometri.
Noen av funksjonene som er identifisert in vitro kan gi oss ledetråder til sine potensielle funksjoner i vivo. For eksempel, for å evnene til Gφ konsumerer store mengder nøytrofile granuler og rusk, tilstedeværelse av store vakuoler, og uttrykket LC3B – en autofagi protein som bidrar til å svekke betennelse gjennom regulatoriske interaksjoner med medfødte immunsignalveier, 22 – som alle støtte scavenging evner. som sådanDisse funnene indikerer også at Gφ kan fungere på inflammasjons hvor Mii / DC system er utilstrekkelig eller overveldet, og dermed bidra til løsning av betennelse. Denne forestillingen kan bli støttet av det faktum at i blandede monocytter / nøytrofile kulturer Gφ utvikling er hemmet. 14 også, gitt at Gφ uttrykke oxLDL scavenger reseptorer (CD36, CD68), internal oxLDL, og produsere ROS svar på det, kan tyde på at de er involvert i aterosklerotiske prosesser for å løse betennelse. Siden Gφ utviklet bare fra nøytrofiler som migrerte mot IL-8, og nøytrofile 'transmigrasjon på tvers av endotel-monolag mot IL-8 representerer neutrofil rekruttering til akutte inflammatoriske seter, dette funn også kan støtte anti-inflammatorisk funksjoner. Omvendt, kan ytelsen til Gφ i visse betennelsestilstander sette dem i stand til å oppfylle granule bestanddeler og ROS, og dermed bidra til perkonsistent betennelse og vevsskade. 20 Men alt i alt, sine autophagic evner indikerer at Gφ sannsynligvis involvert i reduseres den inflammatoriske respons i stedet for å videreføre den.
Interessant har vi nylig identifisert tilstedeværelsen av Gφ i menneskelige aterosklerotisk plakk. (Under forberedelse). Likevel, et stort antall spørsmål gjenstår å bli avslørt. For eksempel, er Gφ pro- eller anti-inflammatorisk? Hva er de faktorer som bestemmer deres dannelse og funksjon in vitro eller in vivo? Hvilke konkrete nøytrofile undergruppe er deres forløper celle som forenkler deres utvikling i Gφ? Er de forbundet med visse sykdommer og hvilke? Kollektivt, posing interessante spørsmål om deres opprinnelse og mulige funksjoner.
Men kritiske trinnene og fallgruver i protokollen bør holdes i bakhodet. Et kritisk punkt i utviklingen av Gφ jegs dyrking de rene nøytrofile i medium blottet for cytokiner, vekstfaktorer eller antibiotika. Et annet kritisk punkt er å utelukke at Gφ utvikle seg fra forurensende monocytter og å fastslå nøytrofil opprinnelse Gφ. Dermed, etter blodseparasjon ved diskontinuerlig gradient, neutrofilene ble videre underkastet et ytterligere trinn med rensing ved flowcytometri hjelp av granulocytt portstyring og CD15 + / CD14 – markører. Den utviklede Gφ oppnådd fra nøytrofiler som ble ytterligere renset ved hjelp av strømningscytometri separasjon var ikke forskjellig fra de som ikke ble utsatt for dette rensetrinn. Derfor ble de fleste av forsøkene gjennomført uten flowcytometri rensetrinn på grunn av ytterligere celletap. Av notatet, i noen sjeldne tilfeller noen eosinofile ble registrert i kultur. Deres størrelse forble uendret gjennom hele dyrkningsperioden. Vi bør også merke seg at selv om det finnes en rekke fremgangsmåterfor nøytrofile separasjon fra menneskeblod, metoden som er beskrevet her er den eneste metoden vi ansatt og derfor kan vi ikke sammenligne Gφ utvikling av andre tilgjengelige metoder for nøytrofile separasjon.
En stor fallgruve i å undersøke Gφ resultat av manglende evne til å få et tilstrekkelig antall rene Gφ befolkningen egnet for ulike biokjemiske analyser. Det er i utgangspunktet ikke mulig under de forhold våre eksperimenter ble utført. For det første er utbyttet av Gφ lav. Fra 1,0 x 10 til 6 PMN podet på 100-200 Gφ utvikle seg etter syv dager i kultur, avhengig av blod donor. For det andre er det i utgangspunktet vanskelig i øyeblikket for å skille den utviklede Gφ i kultur fra de resterende nøytrofile rusk i fatet. Disse begrensninger har gjort det praktisk talt umulig å analysere cellene ved biokjemiske eller molekylærbiologiske metoder. Derfor er denne protokollen fokusert på å beskrive Gφ identifikasjon og funksjon ved hjelp av lettog konfokalmikroskopi. Deres morfologisk transformasjon fra nøytrofile inn Gφ i kultur ble også etterfulgt av levende celle bildebehandling og time lapse mikroskopi. 14 Tilsynelatende mye større blodvolum kan være nødvendig for å kunne gjennomføre biokjemiske eller molekylærbiologiske metoder og overvinne den lave avkastningen innhentet og skille levedyktig Gφ fra nøytrofile 'rusk i fatet.
Oppsummert har vi nylig beskrev for første gang utviklingen av Gφ i kultur, en undergruppe av langlivede fagocytter av nøytrofil opprinnelse. Derfor er dette den eneste metoden for tiden tilgjengelig for å oppnå Gφ i kultur, selv om de to store begrensninger som er nevnt ovenfor skal overvinnes (det lave utbyttet av Gφ oppnådd i kulturen, og den manglende evne til å skille den utviklede Gφ fra nøytrofile avfall i kulturen matrett). Likevel, deres forberedelser og identifikasjon, som presenteres i denne protokollen, er Essential for forskere som er interessert i inflammatoriske responser og nøytrofil biologi og plastisitet, for ytterligere å undersøke den potensielle betydning og funksjon av Gφ.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Dr. Edith Suss-Toby for henne uvurderlig hjelp med konfokalmikroskopi studier. Denne studien ble støttet av departementet for innvandring Absorpsjon og Komiteen for planlegging og budsjettering av Rådet for høyere utdanning under rammen av Kamea program (LD og AP). Vi ønsker å takke for støtte fra stipendiat fra Lady Davis Foundation postdoktorFellowShip (OR).
Sterile scalp vein set (21GX3/4) | Bio Diagnostics Ltd. | # 20080312 | A strile needle for venipancture |
VACUETTE HOLDEX Single-Use Holder PP | Greiner Bio-One | # 450263 | For securing during venipuncture |
VACUETTE Tube K3E K3EDTA (16×100/9 ml) | Greiner Bio-One | # 455036 | Sterile tube for blood collection |
Nunclon MultiDish (24 wellx1ml) | Thermo Scientific | # 142475 | |
Polypropylene conical centrifuge tube (50 ml) | Greiner Bio-One | # E14103PJ | |
Transwell-24 well (transmigration assay) | Corning | # CA-3415 | Polycarbonate membrane, 6.5 mm diameter, 3 μm pores) |
RPMI-1640 medium | BioIndustries | # 01-100-1A | Do not add antibiotics |
EA.hy926 (ATCC CRL2922) | BioIndustries | # CRL-2922 | |
ATCC-formulated Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | BioIndustries | # 302002 | complete growth medium |
Polysucrose – Histopaque1119 | Sigma-Aldrich | # 1119-1 | Tissue culture grade |
Polysucrose – Histopaque1077 | Sigma-Aldrich | # 1077-1 | Tissue culture grade |
Phosphate buffered saline (PBS) – ion free | BioIndustries | # 02-023-1A | Cell biology and molecular biology grade |
Heat inactivated Fetal calf serum (HI-FCS) | BioIndustries | # 04-121-1B | Cell biology grade or tissue culture grade, low LPS |
NaCl | Sigma | # S3014 | Molecular biology grade, suitable for cell culture |
Paraformaldehyde, 16% | Electron Microscopy Sciences | # 15710 | Cell bology grade or tissue culture grade (only 16% PFA) |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | # 9002-93-1 | Molecular biology grade |
Normal Goat Serum | BioIndustries | # 04-009-1 | Cell biology and molecular biology grade |
Trypan blue | BioIndustries | # 031021B | Tissue culture grade |
May-Grünwald | Sigma-Aldrich | # MG500 | Cell biology grade-(procedure No GS-10) |
Giemsa stain Kit | Sigma | # 48900 | Cell biololgy grade-(procedure No GS-10) |
Fibronectin | BioIndustries | # 03090105 | |
Human Interleukin-8 (CXCL8) | PeproTech | # 200-08-5 | |
Anti-CD14 (clone 5A3B11B5) | Santa Cruz Biotechnologies | # sc-58951 | Mouse IgG2b; expressed by monocytes |
Anti-CD63 (clone MX-49.129.5) | Santa Cruz Biotechnologies | # sc-5275 | Mouse IgG1; expressed by neutrophils |
Anti-CD66b (clone 80H3) | AbD Serotec | # MCA216 | Mouse IgG1; expressed by neutrophils |
Anti-CD1c (BDCA-1) (clone AD5-8E7) | MACS Miltenyi Biotec | # 130-090-695 | Mouse IgG2a; expressed by dendritic cells |
Anti-CD15 (clone MY-1) | Abcam | # ab754 | Mouse IgM; expressed by neutrophils |
Anti-Cytochrome b-245 Light Chain (p22-phox) (clone 44.1) | BioLegend | # 650001 | Mouse IgG2a; to recognize neutrophil NADPH oxidase complex |
Anti-CD68 | Protein Tech | # 16192-1-AP | Rabbit IgG; to recognize oxLDL scavenger receptor |
Anti-LC3B | Sigma | # L7543 | Rabbit IgG |
Anti-Myeloperoxidase | Abcam | # ab45977 | Rabbit IgG |
Anti-Neutrophil elastase | Calbiochem | # 481001 | Rabbit IgG |
Anti-NOX2 (gp91-phox) | Abcam | # ab131083 | Rabbit IgG |
Anti-CD36 (SR-B3) | Novus Biologicals | # NB400-144 | Rabbit IgG |
Purified Mouse IgG1, κ Isotype Control (clone MG1-45) | BioLegend | # 401401 | Antibody used as isotype control |
Purified Mouse IgG2a, κ Isotype Control (clone MOPC-173) | BioLegend | # 400263 | Antibody used as isotype control |
Normal rabbit IgG | Santa Cruz Biotechnologies | # sc-2027 | Antibody used as isotype control |
CF488A Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Biotium | # 20012 | Anti-Rabbit IgG with the green fluorescent dye CF488A |
CF647 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Biotium | # 20043 | Anti-Rabbit IgG with the red fluorescent dye CF647 |
CF488A Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Biotium | # 20010 | Anti-Mouse IgG with the green fluorescent dye CF488A |
CF647 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Biotium | # 20040 | Anti-Mouse IgG with the red fluorescent dye CF647 |
Fluorescent Mounting Medium with DAPI | Vectashield H-1000; Vector Lab Inc. | # E19-18 | Nuclear staining |
Confocal laser scanning microscope (LSM 700) | Carl Zeiss | Ser.# 3523000380 | Plan Apo x40 immersion oil objective |
Zeiss CLSM software (ZEN 2010) | Carl Zeiss MicroImaging GmbH | version 6.0 | For colocalization analysis |
ImageJ software | Wayne Rasband, NIH, USA | version 1.49k | For determination of cell areas and fluorescence intensity |
Light microscope (Axiovert 25) | Carl Zeiss | Ser.# 201060153 | Examination of cells in culture |
Centrifuge (Megafuge 1.0 R) | Heraeus Instruments | # D-37520 | Cells separation from blood; cytospins preparation |
Inverted fluorescent microscope (Zeiss Axio Observer Z.1) | Carl Zeiss | Ser.# 3834001470 | Demonstration of giant phagocytes development |
Temperature-controlled incubation system (Cube&Box) | Life Imaging Services | Temperature control system for microscopes | |
High resolution digital CCD camera (AxioCam HRm) | Carl Zeiss | Ser.# 117090279 | For capturing high-contrast image data from an examined cell objects |